Method Article

Desenvolvimento de um Backbone cíclica Biblioteca de Peptídeos como potencial antiparasitário Therapeutics Usando Microondas Irradiação

DOI:

10.3791/53589

⸱

January 26th, 2016

 , 
1Department of Chemical and Systems Biology, Stanford University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Um método simples e geral para a síntese de peptídeos cíclicos usando irradiação de microondas é descrito. Este procedimento permite a síntese de peptídeos cíclicos de backbone com uma coleção de diferentes conformações, mantendo as cadeias laterais e as porções farmacofóricas., e, portanto, permite rastrear a conformação bioativa.

Abstract

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Interacções proteína-proteína (IBPs) estão intimamente envolvidos em quase todos os processos biológicos e estão ligadas a muitas doenças humanas. Portanto, há um grande esforço para atingir os IPP em pesquisa básica e na indústria farmacêutica. As interfaces proteína-proteína são geralmente grande e plana, e muitas vezes não têm bolsos, o que complica a descoberta de pequenas moléculas que têm como alvo tais sites. Abordagens alternativas de segmentação utilizando anticorpos têm limitações devido à baixa biodisponibilidade oral, baixa de células-permeabilidade, e ineficiência de produção.

Usando péptidos alvo para interfaces de PPI tem várias vantagens. Os péptidos têm maior flexibilidade conformacional, o aumento da selectividade, e são geralmente baratos. No entanto, os péptidos têm suas próprias limitações incluindo a má estabilidade e ineficiência atravessar membranas celulares. Para superar estas limitações, o péptido de ciclização pode ser realizada. A ciclização foi demonstrado melhorar a selectividade peptídeo, A estabilidade metabólica e biodisponibilidade. No entanto, a previsão da conformação bioactiva de um péptido cíclico não é trivial. Para ultrapassar esta dificuldade, uma abordagem atractiva para o rastreio de uma biblioteca focada para a tela no qual todos os péptidos cíclicos da espinha dorsal tem a mesma sequência primária, mas diferem nos parâmetros que influenciam a sua conformação, como o tamanho do anel e posição.

Nós descrevemos um protocolo detalhado para a síntese de uma biblioteca de péptidos cíclicos de segmentação de estrutura de parasitas específicos de IPP. Utilizando uma abordagem de design racional, foi desenvolvido a partir de péptidos derivados do receptor de G eishmania proteína C activada para andaime-quinase (ausência). Colocámos a hipótese de sequências em FALTA que são conservadas em parasitas, mas não no homólogo de hospedeiro mamífero, podem representar sítios de interacção para proteínas que são críticas para a viabilidade dos parasitas. Os péptidos cíclicos foram sintetizados utilizando a irradiação de microondas para reduzir os tempos de reacção e aumentareficiência. O desenvolvimento de uma biblioteca de backbone peptídeos cíclicos com diferentes tamanhos de tela de toque facilita uma sistemática para a conformação activa mais biológica. Este método oferece uma maneira geral, rápido e fácil de sintetizar péptidos cíclicos.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Interacções proteína-proteína (IBPs) desempenham um papel essencial na maioria dos processos biológicos, de transdução de sinal intracelular para a morte de células 1. Assim, visando IPP é de fundamental importância para a pesquisa básica e aplicações terapêuticas. IPP pode ser regulada por meio de anticorpos específicos e estáveis, mas os anticorpos são caros e difíceis de fabricar e têm uma fraca biodisponibilidade. Alternativamente, IPP pode ser alvo de moléculas pequenas. As moléculas pequenas são mais fáceis de sintetizar e barata em comparação com anticorpos; no entanto, eles são relativamente menos flexível e encaixar melhor do que para as pequenas cavidades grandes para as interfaces proteína-proteína 2,3. Diversos estudos demonstraram que os péptidos, que são mais simples e mais barata do que os anticorpos e mais flexível do que as moléculas pequenas, as interfaces de proteína pode ligar-se e regulam IPP 4,5. O mercado global de peptídeo terapêutico foi avaliada em torno de quinze bilhões de dólares em 2013 e está crescendo 10,5% annually 6. Além disso, existem mais do que 50 péptidos comercializados, cerca de 270 péptidos em diferentes fases de ensaios clínicos, e cerca de 400 péptidos em fases pré-clínicos avançados 7. Apesar de numerosos peptídeos estão sendo usados ​​como drogas, peptídeos ainda representam vários desafios que limitam a sua aplicação generalizada, incluindo fraca biodisponibilidade e estabilidade, a ineficiência nas membranas celulares cruzamento, e flexibilidade conformacional 8,9. Uma alternativa para superar estes inconvenientes é a aplicação de diferentes modificações, tais como (D-amino ácido e N-alquilação) local e global (ciclização) constrangimentos 8,10-12. Estas alterações também ocorrem naturalmente. Por exemplo, a ciclosporina A, um péptido imunossupressor naturais cíclica, contém um único ácido aminado D e sofre modificações de N-alquilação 13,14.

Modificação de amino ácidos naturais para induzir constrangimentos locais, tais como D e N-alquilação, muitas vezes afecta o peptídeo9; s atividade biológica. No entanto, a ciclização, na qual a sequência de interesse pode permanecer a mesma, é mais provável para preservar a actividade biológica. A ciclização é uma forma altamente atraente para restringir o espaço conformacional péptido, reduzindo o equilíbrio entre diferentes conformações. Geralmente, aumenta a actividade biológica e selectividade ao restringir o péptido para a conformação activa que medeia apenas uma função. A ciclização também melhora a estabilidade do péptido, mantendo o peptídeo numa conformação que é reconhecida pelos menos as enzimas degradantes. Com efeito, os péptidos cíclicos foram mostrados como tendo uma melhor estabilidade metabólica, biodisponibilidade, e a selectividade em relação aos seus equivalentes lineares 15-17.

No entanto, a ciclização pode ser uma espada de dois gumes, uma vez que, em alguns casos, a restrição pode impedir que os péptidos de atingir uma conformação bioactiva. Para superar este obstáculo, uma biblioteca focada no qual todos os péptidos possuem o mesmo sequenc primárioE e consequentemente constante farmacóforos podem ser sintetizados. Os péptidos da biblioteca diferem em parâmetros que influenciam a sua estrutura, tais como o tamanho do anel e posição, a fim de rastrear, subsequentemente, para a conformação bioactiva mais 9,18.

Os péptidos podem ser sintetizados tanto em solução como por uma abordagem de síntese de péptidos em fase sólida (SPPS), que é agora a abordagem de síntese de péptidos mais prevalente e será discutido mais adiante. SPPS é um processo pelo qual as transformações químicas são realizadas sobre um suporte sólido através de um ligante para preparar uma vasta gama de compostos sintéticos 19. SPPS de montagem permite que os péptidos por acoplamento consecutivo de ácidos aminados de uma forma passo a passo a partir do terminal C, que está ligado a um suporte sólido, para a extremidade N-terminal. As cadeias laterais de ácido N-a-amino deve ser mascarados com grupos protectores que são estáveis ​​nas condições de reacção utilizadas durante péptido alongamento para assegurar a adição de um aminoácido por rep. No passo final, o péptido é libertado a partir da resina e a cadeia lateral de grupos protectores são removidos simultaneamente. Enquanto o péptido está a ser sintetizado, todos os reagentes solúveis podem ser removidos a partir da matriz de suporte sólida de péptido-se por filtração e lavado no final de cada passo de acoplamento. Com um tal sistema, um grande excesso de reagentes a uma concentração elevada pode conduzir a reacções de acoplamento e a conclusão de todas as etapas de síntese pode ser realizada no mesmo recipiente, sem transferência de material 20.

Embora SPPS apresenta algumas limitações, tais como a produção de reacções incompletas, reacções secundárias, reagentes impuros, bem como dificuldades de controlo da reacção 21, as vantagens de SPPS fez-se o "padrão de ouro" para a síntese de péptidos. Estas vantagens incluem a opção de incorporar ácidos aminados não naturais, automação, fácil purificação, perdas físicas minimizadas, e a utilização de reagentes em excesso, resultando emrendimentos elevados. SPPS demonstrou ser extremamente útil na síntese de sequências difíceis, 21,22 modificações fluorescentes 23, e bibliotecas de péptidos 24,25. SPPS também é muito útil para outras montagens de cadeia poli, tais como os oligonucleótidos, oligossacáridos 28,29 26,27, e ácidos nucleicos peptídicos 30,31. Curiosamente, em alguns casos, a SPPS foi demonstrado ser vantajoso para a síntese de moléculas pequenas que são tradicionalmente feitas em solução de 32,33. SPPS é usado tanto em pequena escala para pesquisa e ensino, bem como 34,35 larga escala na indústria 36-38.

Duas estratégias de síntese que são usados ​​principalmente em SPPS metodologia para a síntese de péptidos são butiloxicarbonilo (Boc) e 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc). A estratégia original introduzido para a SPPS Boc foi, o que requer condições fortemente ácidas para remover os grupos protectores da cadeia lateral e clivagem do péptido da resin. A síntese de péptidos de Fmoc-baseado, no entanto, utiliza condições base moderada e é uma alternativa mais leve ao protocolo Boc ácido-lábil 39. A estratégia de Fmoc utiliza ortogonal de t-butilo (tBu) protecção da cadeia lateral que é removido no último passo da síntese, enquanto a clivagem do péptido a partir da resina sob condições ácidas.

O princípio geral para a síntese de péptidos sobre suporte sólido é apresentado na Figura 1. O aminoácido inicial, mascarada por um grupo protector temporário na N-α-terminal, é carregada sobre a resina a partir da extremidade C-terminal. Um grupo de protecção semi-permanente para mascarar a cadeia lateral é também utilizado, se necessário (Figura 1, Passo 1). A síntese do péptido alvo é montado a partir do terminal C para o terminal N de ciclos repetitivos de desprotecção do grupo de protecção N-α-temporária (Figura 1, Passo 2) e o acoplamento do aminoácido seguinte protegido (Figura 1 ong>, Passo 3). Após o último aminoácido está carregado (Figura 1, Passo 4), o péptido é clivado do suporte de resina e os grupos de protecção semi-permanentes são removido (Figura 1, Passo 5).

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Figura 1. Esquema geral de síntese de péptidos em fase sólida. O aminoácido protegido por N-α está ancorada usando o grupo carboxilo através de um ligante à resina (Passo 1). O péptido desejado é montado de um modo linear a partir do terminal C para o terminal N de ciclos repetitivos de desprotecção do grupo de protecção temporária (TPG) a partir do N-α (Passo 2) e o acoplamento de aminoácidos (Passo 3). Após realização da síntese (Passo 4), os grupos de protecção semi-permanentes (SPG) são desprotegidos durante a clivagem do péptido (Passo 5).obter = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Após a montagem da cadeia peptídica completa, ciclização pode ser conseguido por várias alternativas: (A) head-to-tail ciclização - Esta é uma maneira conveniente, mas limitado, uma vez que fornece apenas uma opção para ciclização (Figura 2A), (B) ciclização utilizando os aminoácidos da sequência de interesse que contêm grupos funcionais bioactivos - no entanto, a utilização destes aminoácidos pode influenciar a actividade biológica (Figura 2B), e (C) a ciclização através da adição de aminoácidos (ou de outros blocos de construção), sem perturbar a sequência bioactivo. A introdução destas moléculas é generalizado, uma vez que permite a produção de bibliotecas focadas, sem modificar a sequência de interesse (Figura 2C).

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Figura 2. estratégias de ciclização de péptido A alternativa (a) ciclização cabeça à cauda através de uma ligação peptídica entre o C-terminal e N-terminal.; (B) a ciclização entre os grupos funcionais, tais como uma ponte de dissulfureto entre resíduos de cisteína (1), ou uma ligação amida entre as cadeias laterais de lisina para aspártico / ácido glutâmico (2), ou a cadeia lateral de N ou C-terminal (3 -4); (C) ciclização adicionando aminoácidos extras ou derivados de aminoácidos ou moléculas pequenas, por exemplo, antes (R0) e depois (R7) a seqüência bioativa. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Síntese utiliza irradiação de microondas para aquecer reações, acelerando assim a química orgânica assistida por microondas transformações 40,41. Microondas química baseia-se na capacidade de o reagente / solvente para absorver omicroondas energia e convertê-lo para aquecer 42. Antes de a tecnologia se tornou generalizada, grandes inconvenientes tiveram que ser superados, incluindo a controlabilidade e reprodutibilidade dos protocolos de síntese e falta de sistemas disponíveis para temperatura e pressão controles adequados 43,44. O primeiro relatório de síntese de peptídeos assistida por microondas foi feito usando um microondas cozinha para sintetizar vários péptidos curtos (7-10 aminoácidos) com melhoria significativa da eficiência de acoplamento e pureza 45. Além disso, a energia de microondas foi demonstrado para diminuir a agregação de cadeia, reduzir as reacções secundárias, limitar a racemização, e melhorar as taxas de acoplamento, que são todos críticos para sequências longas e difíceis 46-53.

Actualmente a utilização de irradiação de microondas para a síntese de péptidos ou compostos relacionados, um suporte sólido é extensiva, incluindo (a) síntese em água em vez de solvente orgânico 54; (B) a síntese de peptídeos commodificações pós-traducionais comuns, tais como os glicopéptidos 55-58 ou 59-61 fosfopéptidos, cuja síntese é tipicamente difícil, devido à baixa eficiência de acoplamento dos derivados de aminoácidos estereoquimicamente impedidas; (C) a síntese de péptidos com modificação no esqueleto, tal como azapeptides, que pode ser formado pela substituição do C (α) de um resíduo de aminoácido com um átomo de azoto 62, ou peptóides, cuja cadeia lateral está ligada ao azoto da amida em vez do átomo de Ca 63,64; (D) a síntese de péptidos cíclicos 65-71; e (E) a síntese de bibliotecas combinatórias 51,72. Em numerosos casos, os autores relataram uma maior eficiência e reduziu o tempo de síntese que utilizam a irradiação de microondas, em comparação com o protocolo convencional.

Usando um desenho racional 73-75, desenvolvemos peptídeos anti-parasitários que foram derivadas do receptor do andaime L de eishmania foR-quinase C activada (ausência). FALTA desempenha um papel importante na fase inicial de infecção por Leishmania 76. Parasitas que expressam níveis mais baixos de FALTA deixar de parasitar mesmo ratos imunocomprometidos 77 como FALTA está envolvida em processos de parasitas sinalização essenciais e síntese de proteínas 78. Portanto, FALTA é uma chave de proteínas scaffold 79 e um alvo de drogas valiosas. Focando em FALTA sequências que são conservadas em os parasitas, mas não no hospedeiro mamífero CREMALHEIRA homólogo, identificou-se um péptido de 8 amino ácidos (RNGQCQRK) que diminuiu Leishmania sp. Viabilidade em cultura.

Aqui, nós descrevemos um protocolo para a síntese de esqueleto cíclico péptidos derivados da sequência da proteína FALTA descrito acima. Os péptidos foram sintetizados num suporte sólido utilizando o aquecimento por microondas através da metodologia de SPPS com o protocolo Fmoc / tBu. Os péptidos foram conjugados com um péptido 47-57 (YGRKKRRQRRR) transportadora TAT através de uma ligação amida comoparte da SPPS. Transporte baseado no TAT de uma variedade de cargas em células tem sido usado por mais de 15 anos e entrega da carga em organelas subcelulares foi confirmada 80. Quatro ligantes diferentes, succínico e anidrido glutárico, bem como adípico e ácido pimélico, foram usadas para efectuar a ciclização para gerar ligantes de ácidos carboxílicos de dois a cinco carbonos. A ciclização foi realizada por meio de energia de microondas, e a clivagem de cadeia lateral e passos de desprotecção final foi feita manualmente, sem energia de microondas. A utilização de um sintetizador de microondas automatizada melhora a pureza do produto, aumentou o rendimento do produto, e reduziu a duração da síntese. Este protocolo geral pode ser aplicada a outros estudos que utilizam péptidos compreender importante mecanismo molecular in vitro e in vivo e ainda desenvolver drogas potenciais para as doenças humanas.

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Protocol

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1. Equipamentos e Reagentes Preparação

  1. Preparar equipamentos
    1. Execute todas as etapas dentro de um exaustor utilizando equipamento de protecção individual adequado.
    2. Quimicamente sintetizar péptidos sobre suporte sólido utilizando um forno microondas sintetizador de péptidos com um módulo adicional da Discover equipado com uma sonda de temperatura de fibra óptica para controlar a entrega de microondas de energia em um vaso de reacção de Teflon (30 ml, com uma frita de vidro) ou de um polipropileno descartável Cartucho (12 ml, com uma frita de vidro grosseira).
    3. Para uma mistura adequada, ligar o fornecimento de azoto ao vaso de reacção, ou, alternativamente, selar ambas as extremidades do cartucho de polipropileno, e colocar num agitador rotativo.
    4. Para drenar misturas de reacção ou lavagens, conecte-se o vácuo casa através de um sifão.
    5. Coloque a sonda de fibra óptica para dentro do vaso de reacção.
  2. Preparação de reagentes
    1. Prepare a resina por pesagem Rink Amide AM resina 100-200 mesh (0,204 mg), Adicionam-se 5 ml de mistura 1: 1 de N, N-dimetilformamida (DMF) / diclorometano (DCM) para o vaso de reacção cartucho / polipropileno para lavar a resina para baixo, agita-se durante 2-4 horas a inchar adequadamente, e drenar.
    2. Prepare a 0,2 M de 9-f luorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) -amino soluções de ácido pela dissolução do ácido Fmoc-aminoácido correspondente em DMF e agitar com vortex a mistura até que os aminoácidos são dissolvidos (Tabela 1).
    3. Preparar a mistura solução 0,45 M activador por dissolução de 18,96 g de O - (benzotriazol-1-il) - N, N, N ', N' tetrametilurónio (HBTU) em 100 ml de DMF e a mistura vortex até o sólido estar dissolvido (Tabela 1).
    4. Preparar 2 M base de activador de mistura solução combinando 34,8 ml de N, N-diisopropiletilamina (DIEA) com 65,2 mL de 1-metil-2-pirrolidinona (NMP) (Tabela 1).
    5. Preparar a mistura solução de 0,1 M de desprotecção por dissolução de 3,37 g de hidrato de 1-hidroxibenzotriazole (HOBt)em 250 ml de uma solução de v / v de 20% de piperidina em DMF e a mistura vortex até o sólido estar dissolvido (Tabela 1).

2. Fmoc-protegido Aminoácido Acoplamento

  1. Acoplamento de aminoácido
    1. Adicionar aminoácido (2,5 ml) / activador (1 mL) / base de activador (0,5 ml) a uma reacção de cartucho vaso / polipropileno e deixar a reacção prosseguir durante 300 segundos (25 W, 75 ° C, Tabela 2). Escorra a solução.
    2. Lava-se a resina com DMF. Adicionar DMF à resina para 120 segundos (7 ml, 0 W, RT) e drenar a solução. Repita cinco vezes.
  2. Desprotecção Fmoc
    1. Adicionar 7 ml de 20% de piperidina em DMF com 0,1 M de HOBt a uma reacção de cartucho vaso / polipropileno e incubar durante 30 seg (45 W, 75 ° C, Tabela 2).
    2. Drenar a mistura de reacção.
    3. Adicionar 7 ml de 20% de piperidina em DMF com 0,1 M de HOBt a uma reacção de cartucho vaso / polipropileno e incubar durante 180 seg (45 W, 75 ° C, Tabela 2).
    4. Drenar a mistura de reacção.
    5. Lava-se a resina com DMF. Adicionar DMF à resina para 120 segundos (7 ml 0 W, RT) e drenar a solução. Repita cinco vezes.
      Nota: Opcionalmente, pause o procedimento aqui e retomar em uma data posterior.
  3. Após o passo de acoplamento de aminoácidos, lavar a resina com DCM e armazenamento durante pelo menos vários dias a 4 ° C (para armazenamento de um período mais longo a resina, a - 20 ° C).
    1. Mover a resina do vaso reaccional para um cartucho de polipropileno.
    2. Lava-se a resina com DCM. Adicionar DCM para a resina, durante 120 segundos (7 ml, 0 W, RT) e drenar a solução. Repita três vezes.
    3. Selar o cartucho firmemente polipropileno com uma tampa superior e torneira.
    4. Antes de iniciar uma nova síntese, a resina inchar durante 3-4 horas em DMF (7 mL).
  4. Acompanhamento da síntese
    1. Utilizar o teste de Kaiser (ninidrina) ou teste de cloranil para determinar rapidamente o progresso dasíntese. Opcionalmente, realizar uma reacção de clivagem em pequena escala para determinar a pureza e a massa do peptídeo sintetizado. Consulte a seção 9.
      Nota: Para solucionar o problema ver Tabela 3.
  5. Repita os passos 2.1 e 2.2 como desejado para sintetizar peptídeo orientados: Arg(Pbf)-Asn(Trt)-Gly-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Mtt)-Gly-Gly-Tyr(But)-Gly-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf).

3. Anidrido / ligação de ácido

  1. Acoplamento anidrido
    1. Lava-se a resina com NMP. Adicionar NMP para a resina, durante 120 segundos (7 ml, 0 W, RT) e drenar a solução. Repita três vezes.
    2. Dissolve-se 10 equivalentes do anidrido correspondente em NMP (5 mL), adicionar 1 equivalente de 4-dimetilaminopiridina (DMAP) e 10 equivalentes de DIEA, para a solução (Tabela 1).
    3. Adicionar 10: mistura de anidrido / DMAP 10 / DIEA, para a resina e incubar durante 300 segundos (25: 1W, 75 ° C, Tabela 2). Escorra a solução.
    4. Lava-se a resina com NMP. Adicionar NMP para a resina, durante 120 segundos (7 ml, 0 W, RT) e drenar a solução. Repita três vezes.
  2. Ácido acoplamento
    1. Lava-se a resina com DMF. Adicionar DMF à resina para 120 segundos (7 ml, 0 W, RT) e drenar a solução. Repita três vezes.
    2. Dissolve-se 10 equivalentes do ácido dicarboxílico correspondente em DMF (5 mL). Adicionar DMAP 1 equivalente e 10 equivalentes de N, N '-diisopropilcarbodiimida (DIC) para a solução (Tabela 1).
    3. Pré-activar-se a mistura através da mistura durante 30 min.
    4. Adicionar a mistura à resina e incubar durante 300 seg (25 W, 75 ° C, Tabela 2) e drenar a solução.
    5. Lava-se a resina com DMF. Adicionar DMF à resina para 120 segundos (7 ml, 0 W, RT) e a drenagem da solução. Repita o passo três vezes.

4. N-metiltritilo (MTT) Proteção Grupo DEPROTECTíon

Nota: A cadeia lateral da lisina foi protegido com N-metiltritilo (Mtt) 81, um grupo de protecção que pode ser selectivamente desprotegido sob condições ácidas lábeis 82,83. Grupo DEPROTECT Mtt proteger manualmente num agitador sem energia de microondas.

  1. Transferir a resina para um cartucho de polipropileno equipado com plugue tampa e torneira.
  2. Lava-se a resina com DCM. Adicionar DCM para a resina, durante 120 segundos (7 ml, 0 W, RT) e drenar a solução. Repita três vezes.
  3. Adicionar 15-25 mL de uma mistura de 1% de ácido trifluoroacético (TFA), 5% de triisopropilsilano (TIS), e 94% de DCM para o cartucho de polipropileno por grama de resina.
    Nota: TFA é um ácido forte e corrosivo e é extremamente irritante para a pele, os olhos, e tecido pulmonar.
    1. Manter as soluções concentradas de TFA na capa em todos os momentos.
    2. Use equipamento de proteção individual (protecção dos olhos, um casaco e luvas de laboratório) e trabalho em uma capa bem ventilado. Alterar luvas prontamentese eles entram em contato com TFA e imediatamente limpa-up de todos os derramamentos. Se a pele ou os olhos entram em contato com o ácido, lave a área afetada imediatamente com água e lavar por mais 15 min.
  4. Coloque o cartucho de polipropileno num agitador e agitar durante 5 min à TA.
  5. Drenar a solução a partir do cartucho de polipropileno por aplicação de vácuo.
  6. Repita os passos 4.3-4.5, três vezes.
  7. Lava-se a resina com DCM. Adicionar DCM para a resina, durante 120 segundos (7 ml, 0 W, RT) e drenar a solução. Repita cinco vezes.

5. A ciclização do péptido linear

  1. Lava-se a resina com DCM. Adicionar DCM para a resina, durante 120 segundos (7 ml, 0 W, RT) e drenar a solução. Repita cinco vezes.
  2. Em um tubo de polipropileno de 50 ml, dissolve-se 5 equivalentes de hexafluorofosfato de benzotriazol-1-ly-oxi-tris-pirrolidinofosfónio hexafluorphosphate (PyBOP) em Dibromometano (DBM, 5 mL) e adicionar 10 equivalentes de DIEA, para a solução (Tabela 1).
  3. Adicionar a mistura à resina e incubar durante 300 seg (25 W, 75 ° C, Tabela 2). Escorra a solução.
  4. Lava-se a resina com DCM. Adicionar DCM para a resina, durante 120 segundos (7 ml, 0 W, RT) e drenar a solução. Repita três vezes.

6. Clivagem e desprotecção de grupos de cadeia lateral

  1. Lava-se a resina com DCM e éter dietílico.
    1. Adicionar DCM para a resina, durante 120 segundos (7 ml, 0 W, RT) e drenar a solução. Repita mais duas vezes.
    2. Adicionar éter dietílico para a resina, durante 120 segundos (7 ml, 0 W, RT) e drenar a solução. Repita mais duas vezes.
  2. Seca-se a resina em exsicador de vácuo à temperatura ambiente durante pelo menos 3 h sobre hidróxido de potássio (KOH, 1-10 g).
  3. Pesa-se a resina seca e transferi-lo para um cartucho de polipropileno.
  4. Adicionar 10 ml de uma ácido trifluoroacético (TFA) cocktail de clivagem pré-arrefecido (por exemplo, 90% de TFA, 2,5% de água, 2,5% de TIS e fenol a 5%) para cada um grama de resina.
  5. Agitar por 3 hrà TA.
  6. Recolher a solução de clivagem de TFA, filtrando a resina para um tubo de polipropileno de 50 ml. Para a filtração, usar a frita que está no cartucho de polipropileno de 12 ml.
  7. Adicionar éter dietílico frio (35 ml) para o tubo.
  8. Centrifugar durante 5 min a 1207 xg, a 4 ° C.
  9. Decantar a camada de éter.
  10. Repita o passo 6,7-6,9, cinco vezes.

7. Secar a Cyclic Peptide Backbone

  1. Manter o péptido precipitado no mesmo tubo e secá-lo numa hote durante 30 min.
  2. Dissolve-se o péptido numa mistura 1: 1 de água e acetonitrilo (ACN).
  3. Congelar a solução do produto final em azoto líquido.
  4. Liofilizar o produto final.

8. Caracterização da Backbone cíclica Peptide

  1. Dissolve-se uma pequena amostra (1 mg) do produto em água (400 ul).
  2. Injectar o péptido dissolvido (10-200 ul) para uma fase inversa chromatograp líquida de alta eficiênciaHY sistema (RP-HPLC) para testar a pureza péptido 34.
  3. Verifique a massa do péptido utilizando espectrometria de massa assistida por matriz com dessorção por laser de ionização (MALDI-MS) 84.
    1. Misturar 1 ul (100 uM) de péptido em 1: 1 (v / v) mistura de acetonitrilo: água com 1 ul de matriz (ácido a 5 mg / ml, α-ciano-4-hidroxicinâmico) numa mistura 1: 1 (v / v) mistura de acetonitrilo: água com TFA (0,1%).
    2. Ponto 1 ml na placa MALDI-MS.
    3. Secar a amostra e colocá-lo no espectrómetro de massa.
  4. Pesa-se o péptido e o cálculo do rendimento percentual.
  5. Armazenar a -20 ° C.

9. Acompanhamento da Síntese

  1. Kaiser (ninidrina) teste 85
    1. Preparar as soluções de reagentes.
      1. Preparar a solução A por dissolução de 16,5 mg de cianeto de potássio (KCN) em 25 ml de água destilada. Dilui-se 1 ml da solução acima com 49 ml de piridina.
      2. Preparar a Solução Bpor dissolução de 1 g de ninidrina em 20 ml de etanol.
      3. Preparar a solução de C por dissolução de 40 g de fenol em 20 ml de etanol.
    2. Utilizar o ensaio de Kaiser para verificar a conclusão do acoplamento de aminoácidos ou a desprotecção do grupo de protecção.
      1. Transferir algumas esferas de resina para um tubo de ensaio.
      2. Adicionar três gotas (~ 100 uL) de cada solução (A, B e C) e misturar.
      3. Aquece-se a um tubo de ensaio no bloco de aquecimento a 110 ° C durante 5 min.
        Nota: grânulos coloridos azuis (resultado positivo) indicam reação de acoplamento incompleto ou desprotecção do grupo de protecção Fmoc.
  2. Teste de cloranil 86
    1. Preparar os seguintes reagentes frescos para cada teste.
      1. Prepara-se uma solução de 2% cloranil em DMF, a solução A.
      2. Prepara-se uma solução de 2% de acetaldeído em DMF, a solução B.
    2. Realizar o teste de cloranil para verificar a conclusão do acoplamento de aminoácidos ou tele desprotecção do grupo de protecção.
      1. Misturar 100 ml de solução A com 100 ml de solução B num tubo de 1,5 ml.
      2. Largue as contas e agitar suavemente durante 5 min.
        Nota: Os grânulos de cor castanha escuro (resultado positivo) indicam a desprotecção do grupo protector Fmoc, ou uma reacção de acoplamento incompleta.
  3. Reacção de cisão em pequena escala
    1. Retirar uma pequena quantidade de resina de polipropileno com um cartucho de 3 ml equipada com tampa da torneira e.
    2. Trata-se com uma mistura de 2 mL de 95% TFA, 2,5% de água e 2,5% de TIS.
    3. Agitar a mistura durante 30 min à temperatura ambiente.
    4. Remover a resina por filtração usando a frita do cartucho de polipropileno e evapora-se os solventes por uma corrente de azoto.
    5. Dissolve-se o resíduo em água e analisar o produto por HPLC e / ou MS.

10. Viabilidade de promastigotas de Leishmania donovani em Cultura Ensaio

  1. Leishmania donovani (L. donovani) condições de crescimento e tratamento
    1. Cultura L. promastigotas donovani em Modificação de Dulbecco do meio de Eagle (DMEM), com 4,5 g / l de glucose, L-glutamina, piruvato de sódio e a 26 ° C.
    2. Tratar o L. donovani promastigotas com péptidos cíclicos (100 uM) durante 24 h a 26 ° C.
  2. Leishmania donovani (L. donovani) ensaio de viabilidade
    1. Avaliar a viabilidade do parasita com 20 ul alamarBlue de acordo com o protocolo do fabricante.
    2. Determinar redução alamarBlue por medição da fluorescência (excitação a 570 nm e 590 nm de emissão). Valores de fluorescência mais altos indicam uma maior atividade metabólica e aumento da viabilidade do parasita.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui nós descrevemos o desenvolvimento de uma pequena biblioteca focada de backbone peptídeos cíclicos que visam especificamente os PPIs vitais do parasita Leishmania e atuar como agentes antiparasitários (para revisão sobre peptídeos que têm como alvo os IPP como agentes antiparasitários 87). Através da síntese de novel backbone péptidos cíclicos, são conservadas em farmacóforos um andaime de tamanho extensível. A força da biblioteca focada aqui proposto é a capacidade de variar tamanhos péptido de ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A síntese de uma biblioteca focada backbone de péptidos cíclicos derivados da proteína falta de parasita Leishmania usando a um sintetizador de microondas é descrita completamente automatizado. Uma biblioteca orientada de péptidos cíclicos foi desenvolvido com farmacóforos conservada e vários ligantes. A adição de vários ligantes, tais como o anidrido glutárico, anidrido succínico, ácido adípico, ácido pimélico, lisina, ornitina, e outros blocos de construção podem ser utilizados para aumentar a variedade do es...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos Lauren Van Wassenhove, Sunhee Hwang, e Daria Mochly-Rosen para discussões úteis. O trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde Grant NIH RC4 TW008781-01 C-IDEA (SPARK) para nq Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
REAGENTES
Suporte sólido, resina AM MLCBLBR-1330de carga: 0,49 mmol/g
Fmoc-Ala-OHAvançado ChemtechFA2100
Fmoc-Arg(Pbf)-OHAvançado ChemtechFR2136
Fmoc-Asn(Trt)-OHAvançado ChemtechFN2152
Fmoc-Asp (OBut) -OHAvançado ChemtechFD2192
Fmoc-Cis (Trt) -OHAvançado ChemtechFC2214
Fmoc-Gln (Trt) -OHAvançadoChemtech FQ2251
Fmoc-Glu (OtBu) -OHAvançado ChemtechFE2237
Fmoc-Gly-OHAvançado ChemtechFG2275
Fmoc-His (Trt) -OHAvançado ChemtechFH2316
Fmoc-Ile-OHAvançado ChemtechFI2326
Fmoc-Leu-OHAvançado ChemtechFL2350
Fmoc-Lys (Boc) -OHAvançado ChemtechFK2390
Fmoc-Met-OHAvançado ChemtechFM2400
Fmoc-Phe-OHAvançado ChemtechFF2425
Fmoc-Pro-OHAvançado ChemtechFP2450
Fmoc-Ser-(tBu)-OHAvançado ChemtechFS2476
Fmoc-Thr(tBu)-OHAvançadoChemtech FT2518
Fmoc-Trp(Boc)-OHAvançadoChemtech FW2527
Fmoc-Tyr(Mas)-OHAvançadoChemtech FY2563
Fmoc-Val-OHAvançado ChemtechFV2575
1-Metil-2-pirrolidinona (NMP)Sigma328634Cuidado< / forte> Tóxico / Altamente inflamável / Irritante.
N,N-Dimetilformamida (DMF)Alfa Aesar43465Cuidado Toxic.
Use DMF de alta qualidade para eliminar reações colaterais, como a remoção de Fmoc como resultado dos traços de dimetilamina da decomposição do DMF.
Diclorometano (DCM)SigmaD65100Cuidado
Dibromometano nocivo (DBM)SigmaD41868Cuidado
Ácido trifluoroacético nocivo (TFA)SigmaT62200Cuidado Ácido
trifluoroacético corrosivo/tóxico, grau HPLC (TFA)Sigma91707Cuidado Dietíleto corrosivo/tóxico
Sigma31690Cuidado
Triisopropilsilano (TIS)prejudicialSigma233781Cuidado Água irritante/inflamável
, grau HPLCSigma270733
Acetonitroila, grau HPLC (ACN)Fisher ScientificA998-4Cuidado Inflamável/Irritante/Prejudicial
N,N-Diisopropiletilamina (DIEA)Sigma3440Cuidado Corrosivo/Altamente inflamável
PiperidinaSigma W290807Cuidado Tóxico/Altamente inflamável
PiridinaSigma270970Cuidado Etanol altamente inflamável/prejudicial
(EtOH)Sigma459844Cuidado Altamente inflamável/Irritante hidrato
de 1-hidroxibenzotriazol (HOBt)Sigma157260Cuidado Altamente inflamável/Irritante/Prejudicial
O-(Benzotriazol-1-il)-N,N,N′,N′ < / em>- hexafluorofosfato de tetrametilurônio (HBTU)Sigma12804< forte > Cuidado < / forte > Irritante / Prejudicial
Benzotriazol-1-ly-oxy-tris-pyrrolidinophosphonium hexafluorfosfato (PyBOP)Advanced ChemtechRC8602< forte > Cuidado < / forte > Irritante
NinidrinaSigma454044< forte > Cuidado < / forte > Prejudicial
FenolSigmaP3653Cuidado Corrosivo/Tóxico
Cianeto de potássio (KCN)Sigma11813Cuidado Hidróxido de potássio muito tóxico
(KOH)Sigma221473Cuidado Tóxico
N,N' -Diisopropilcarbodiimida (DIC)Sigma38370Cuidado Inflamável/Tóxico
4-Dimetilaminopiridina (DMAP)Sigma522805Cuidado Tóxico/Irritante
Anidrido glutáricoSigmaG3806Cuidado Inflamável/Irritante/Prejudicial
Anidrido succínicoSigma239690Cuidado Irritante/Nocivo
Ácido adípicoSigmaA26357Cuidado Tóxico/Irritante
Ácido pimélicoSigmaP45001Cuidado Tóxico/Irritante
CloranilSigma23290Cuidado Tóxico/Irritante
AcetaldeídoSigma402788Cuidado Inflamável/ Tóxico
EQUIPAMENTO
CentrífugaBeckman CoulterAllegra 6R centrífuga
LiofilizadorLabconcofreezone 4.5
Bomba de vácuoFranklin Electricmodelo 1101101416 com 3/4 HPAlcatel bomba com Franklin Motor 
Cartucho de polipropileno 12 mlSeparação aplicada2419
Tampão para cartucho de polipropileno de 12 mlSeparação aplicada8157
Cartucho de polipropileno 3 mlSeparação aplicada2413
Tampão para cartucho de polipropileno de 3 mlSeparação aplicada8054
Torneiras de parada PTFESeparação aplicada2406
Tubos planos, 50 mlVWR21008-240
Coletor de extração, 20 pos, tubos de 16 x 100 mmAgitadorde WAT200609
águas, misturador de nutador BD adamsFisher scientific22363152
Nalgene HDPE garrafas IP2 de boca estreita, 125  mlFisher scientific03-312-8
Erlenmeyer flaskFisher ScientificFB-501, 500 ml
Bloco de aquecimentoThermolyne1760 dri bath
Tubos de vidro borossilicato descartáveis com extremidade lisaFisher Scientific14-961-25
Micropipetas e pontas FinnpipetteThermo20; 200 e 100– 1.000 μ l
Frascos para HPLC - micro vl pp 400 e micro; l PK100   VWR69400-124
Frasco para HPLC - Tampa Snap-It AzulVWR66030-600
Coluna para HPLC analíticaPeeke ScientificU1-5C18Q-JJultro 120 5 µ m C18Q, coluna de HPLC de preparação de 4,6 mm ID 150 mm
, XBridge WatersOBD C18 5 µ m coluna19 mm &vezes; 150 mm
Espectrômetro de massaApplied BiosystemsVoyager DE-RP 
Dessecador
de cilindro
Sistema analítico RP-HPLC Shimadzu LC-20equipado com: controlador de sistema CBM-20A, detector SPD-20A, forno de coluna CTO-20A, 2 x unidade de entrega de solvente LC-20AD, amostrador automático SIL-20AC, desgaseificador DGU-20A5 (Shimadzu, MD, EUA).
Sistema preparativo RP-HPLC Shimadzu LC-20equipado com: controlador de sistema CBM-20A, detector SPD-20A, forno de coluna CTO-20A, 2 x unidade de entrega de solvente LC-6AD e coletor de frações FRC-10A (Shimadzu, MD, EUA).
de amida de pista altamente inflamável/ de de nitrogênio

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