Artigo de método

Acompanhando as células GFP em peixes-zebra transgénicos Usando o Sistema Photoconvertible PSmOrange

DOI:

10.3791/53604

⸱

5 de fevereiro de 2016

 ,  ,  , 
1Medical Faculty Mannheim, Department of Cell and Molecular Biology, Heidelberg University, 2COS and Nikon Imaging Center at the University of Heidelberg, Heidelberg University, 3Excellenzcluster CellNetworks, University of Heidelberg

Neste artigo

Resumo

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Estabelecemos o sistema PSmOrange fotoconversível como uma ferramenta poderosa, direta e barata para rastreamento de células in vivo em fundos transgênicos GFP. Este protocolo descreve sua aplicação no sistema modelo de peixe-zebra.

Resumo

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O rápido desenvolvimento de embriões transparentes de peixe-zebra (Danio rerio) em combinação com marcações fluorescentes de células e tecidos permite visualizar os processos de desenvolvimento à medida que acontecem no animal vivo. As células de interesse podem ser marcadas usando um promotor específico do tecido para conduzir a expressão de uma proteína fluorescente (FP) para a geração de linhagens transgênicas. O uso de proteínas fotoconversíveis fluorescentes para esse fim também permite seguir com precisão estruturas definidas dentro do domínio de expressão. Iluminar a proteína na região de interesse, altera seu espectro de emissão e destaca uma determinada célula ou aglomerado de células, deixando outras células transgênicas em sua cor original. Uma grande limitação é a falta de promotores conhecidos para um grande número de tecidos no peixe-zebra. Por outro lado, as telas de armadilhas de genes e intensificadores geraram enormes recursos transgênicos, rotulando discretamente literalmente todas as estruturas embrionárias, principalmente com GFP ou, em menor extensão, FPs vermelhos ou amarelos. Uma abordagem para seguir estruturas definidas em tais fundos transgênicos seria introduzir adicionalmente uma proteína fotoconversível onipresente, que poderia ser convertida na(s) célula(s) de interesse. No entanto, as proteínas fotoconversíveis disponíveis envolvem um estado de emissão verde e / ou menos frequentemente vermelho1 e, portanto, muitas vezes não podem ser usadas para rastrear células no fundo FP de linhagens transgênicas existentes. Para contornar esse problema, estabelecemos o sistema PSmOrange para o peixe-zebra2,3. A simples microinjeção de mRNA sintético que codifica uma forma nuclear desta proteína marca todos os núcleos celulares com fluorescência laranja / vermelha. Após a fotoconversão direcionada da proteína, ela muda seu espectro de emissão para vermelho distante. A eficiência quântica e a estabilidade da proteína tornam o PSmOrange uma excelente ferramenta de rastreamento de células para peixes-zebra e possivelmente outras espécies de teleósteos.

Introdução

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Melhorar exponencialmente as técnicas de imagem permite acompanhar os processos de desenvolvimento ao longo de períodos de tempo de até cerca de quatro dias consecutivos3. No peixe-zebra e em muitos outros sistemas de modelos animais, células, tecidos, estruturas axonais ou vasculares específicas são marcadas por proteínas fluorescentes transgênicas verdes ou às vezes vermelhas ou amarelas para facilitar a visualização. No entanto, na maioria das linhagens transgênicas, o transgene não é expresso especificamente nas células de interesse, mas também em estruturas adicionais, o que dificulta o rastreamento preciso de, por exemplo, células individuais ou grupos de células.

As proteínas fotoconversíveis fluorescentes são adequadas para o rastreamento celular durante o desenvolvimento embrionário. Os pré-requisitos para a aplicação de tais proteínas são uma natureza de longa duração, uma faixa de emissão bem separada após a conversão e fluorescência brilhante. As proteínas fotoconversíveis disponíveis compreendem aquelas que mudam sua faixa de emissão após a conversão, como Kaede4, KiGR5, mEos26, PS-CFP2 ou Dendra27 e outras que são apenas fluorescentes quando fotoativadas (PAmCherry8, PAGFP9 ou PATagRFP10). Suas aplicações para rastrear células em animais transgênicos FP existentes são, no entanto, limitadas, pois geralmente envolvem um estado fluorescente verde ou não atendem a todos os critérios acima. Apenas recentemente, Subach e colegas relataram a proteína PSmOrange, que muda sua emissão de laranja / vermelho para vermelho distante após a fotoconversão e foi aplicada com sucesso em células em cultura e células cultivadas injetadas em camundongos2.

Para investigar a adequação da proteína para rastreamento celular em um embrião vivo, geramos uma construção de expressão para a microinjeção de H2B-PSmOrange marcado com energia nuclear em embriões de peixe-zebra. Descobrimos que a proteína preenche todos os pré-requisitos para o rastreamento celular bem-sucedido em fundos transgênicos GFP durante os primeiros 4 (e possivelmente mais) dias de desenvolvimento embrionário do peixe-zebra. Durante esse período, a maioria dos eventos migratórios celulares é concluída em peixes, tornando o sistema PSmOrange um excelente complemento para o kit de ferramentas do peixe-zebra.

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Protocolo

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1. H2B-PSmOrange mRNA transcrição in vitro e mRNA Purificação

  1. Linearizar o H2B-PSmOrange contendo pCS2 + plasmídeo utilizando a enzima de restrição NotI de acordo com as instruções do fabricante.
    Nota: Execute as seguintes etapas usando proteções adequadas, tais como luvas e bata de laboratório para evitar a contaminação e degradação do mRNA.
  2. Purifica-se o ADN linearizado utilizando um kit de purificação ou de fenol-clorofórmio PCR métodos baseados acordo com os protocolos dos fabricantes.
  3. Use 1 ug de ADN molde linearizados para transcrição sp6-ARNm de acordo com as instruções do fabricante.
  4. Remover o DNA pela adição de 1,0 U de RNase livre ADNasel durante 10-20 min a 37 ° C.
  5. Limpar o mRNA usando um RNA limpar kit de acordo com o protocolo do fabricante.
  6. Para aumentar a pureza e concentração de ARNm, o ARNm de precipitar por adição de 6 ul de acetato de sódio (3,0 M, pH 5,2) e 150 ul de etanol a 96%. Incubar a mixed solução a -20 ° C durante pelo menos 30 minutos e até 24 h.
  7. Recolhe-se o ARNm por fiação da solução a 18,407 xg durante 45 min a 4 ° C. Descartar o líquido e ressuspender o ARNm em 150 ul de etanol a 70%. Misturar e centrifugar a solução durante mais 15 min a 4 ° C. Descartar o líquido, secar o sedimento durante 5 minutos em gelo e ressuspender o ARNm em 20 ul de ARNase ultrapura água livre.
  8. Avaliar a concentração e pureza do ARNm por medição fotométrica de uma diluição 1: 100 de ARNm (ARNm 1 ul em 99 ul ultrapura RNase isenta de água).
  9. Para armazenagem a curto prazo, manter a solução de ARNm a -20 ° C. Para armazenamento a longo prazo, manter o ARNm a -80 ° C.

2. H2B-PSmOrange mRNA microinjeção em embriões Zebrafish

  1. Configurar o acasalamento pares na noite antes da injeção usando tg (FOXD3: GFP); tg (FLH: GFP) peixes transgénicos casal (ou qualquer outro peixe transgénico GFP). Deixar o peixe separada por colocação de um espaçadorentre eles para controlar o tempo de acasalamento.
  2. Remova o espaçador na manhã de injecção e deixar o companheiro de peixe para 20 min.
  3. Durante o acasalamento tempo, dilui-se o ARNm H2B-PSmOrange até à concentração final de 130 pg / NL (em RNase isenta de água) e a transferência de 6 ul de solução de injecção para um capilar de microinjecção utilizando uma ponta de microloader. Verifique o volume de injeção com uma lâmina de vidro calibrado. Ajuste a pressão de injeção para injetar 2 solução mRNA nl (260 pg).
  4. Recolher os ovos em uma placa de petri de plástico esterilizado contendo Embryo 1x médio (E3).
  5. Transferir 20 a 30 embriões de um prato de injecção, utilizando uma pipeta de pasteur de plástico.
  6. Injectar 2 nl de ARNm contendo uma solução para a célula ou apenas abaixo da célula na gema no estádio de uma célula-11.
  7. Transferência de embriões injetado em uma-placa de petri contendo meio 1x E3, retire os embriões que se desenvolveram normalmente não fertilizados ou não e cultivá-las a 28 ° C.
    Nota: A proteção Luz of os embriões não é necessário durante todo o experimento.
  8. Elevar embriões de peixe-zebra em meio 1x E3 e adicionar PTU 0,2 mM (1-fenil-2 tioureia) após a gastrulação para inibir a pigmentação. Mudar o meio duas vezes por dia para minimizar o perigo de contaminações bacterianas.

3. Embryo Embedding

  1. Seleccione a GFP (verde) e PSmOrange (laranja / vermelho) embriões co-expressando usando um microscópio binocular equipado com uma lâmpada fluorescente e filtros de emissão adequados. Transferir os embriões positivos em uma placa de petri estéril contendo meio 1x E3.
  2. Embriões Dechorionate sob um microscópio estereoscópico com a pinça 12.
  3. Transferência de um embrião em um tubo de 1,5 ml contendo 1,0 ml de pré-aquecido 1,0% de agarose de baixa fusão (LMA) preparadas em água ultrapura, utilizando uma pipeta de corte de ponta (P200). Nota: Aquecer o LMA a 80 ° C e arrefecer durante 3-5 minutos à temperatura ambiente antes de incorporar o embrião.
  4. Transferir o embrião em 150 ul LMA numacompartimentado lamela e ajustar a orientação do embrião, por exemplo, o lado dorsal para baixo na experiência descrita para o laser confocal de varredura microscópio invertido A1R + (ou qualquer outro microscópio adequado), utilizando uma ponta de plástico fino. Quando o LMA é polimerizado, encher a câmara com água de peixe contendo PTU 0,2 mM e 0,02% de acetato de 3-aminobenzoato metanossulfonato (tricaina) para a anestesia.
  5. Antes de imagem da amostra, esperar 15 min para determinar o efeito de tricaina. A anestesia impede movimentos embrião, que pode ser monitorado usando um estereomicroscópio equipado com iluminação de campo claro.
    Nota: As câmaras podem ser reutilizado duas vezes.

4. PSmOrange fotoconversão

  1. Colocar a amostra sob o microscópio confocal e digitalizar a amostra para identificar a área para photoconvert usando 488 nm e 561 nm lasers para geração de imagens GFP e PSmOrange respectivamente.
    Nota: Use o confocal de varredura a laser do microscópio invertido A1R + no sta invertidoge TiEcontrolled pelo software de imagem de microscópio e equipado com 488 nm, 561 nm e 640 nm lasers para fotoconversão e imagem. No entanto, a aplicação, certamente, não está restringido a esta microscópio, enquanto as linhas de laser para a conversão e de imagem estão disponíveis.
    1. Coloque o objectivo de ar 20X no lugar (NA: 0,75; WD: 1,0 mm; FOV: 0,64 x 0,64 mm).
    2. Use as seguintes configurações microscópio para detectar a proteína PSmOrange antes fotoconversão: 561 nm laser, 0,74 mW medido no plano de foco acima do objetivo.
      Nota: Isto corresponde a 40% neste sistema (de medida no plano do foco é a única forma de determinar a potência efectiva). Ajustar a potência de laser de acordo com as necessidades experimentais como a eficiência de injecções H2B-PSmOrange pode variar.
    3. Adicionar fatores de zoom para destacar a área de interesse. ampliações reduzir o tempo de aquisição de imagem e, portanto, fototoxicidade.
  2. Adquirir uma z-stack que cubra a estruturas de interesse utilizando 488 nm e 561 nm lasers no modo sequencial (modo de linha 1-> 4). Fixar o z-passo entre 1,0 e 2,0 mm. média linha ea frequência de scaneamento pode ser usado para otimizar a qualidade da imagem.
  3. Digitalizar a amostra e selecione a região de interesse ferramenta (ROI) para realçar a área para photoconvert. Fixar o ROI como área de estimulação. Selecione o módulo Foto Activation / Branqueamento, ativar o laser de 488 nm, marcando a respectiva caixa de e definir o laser de 488 nm a 80% (potência do laser 1 mW medida no objetivo). Defina a velocidade de digitalização para 0,5 seg / Frame.
  4. Abra o utilitário fotoconversão (ND Stimulation) e especifique as configurações fotoconversão.
    1. Clique no comando "Adicionar" para especificar o protocolo de fotoconversão.
    2. Ajuste "Fase" 1 no menu "Aquisição / Estimulação" a "Aquisição" e indicar o número de imagens a serem adquiridos antes fotoconversão no menu "Loops".
    3. Ajuste "Fase" 2 para "Stimulation "e digite o número de eventos de estimulação a ser realizada.
    4. Ajuste "Fase" 3 como descrito para "Fase" 1. Opcionalmente, insira uma espera "Phase" depois de "Phase" 2 digitando o tempo de espera antes da última rodada de aquisição de imagem.
    5. Uma vez que todos os parâmetros são definidos, aplicar a definição estimulação e executar o fotoconversão.
      Nota: A potência do laser, a frequência de digitalização e número de iterações para cada rodada de fotoconversão pode variar e ser diferente de embrião para embrião. Uma configuração para começar com é mostrado na Tabela 1.
  5. Adquirir uma z-stack final usando 488 nm, 561 nm e 640 nm lasers de aplicar as configurações como acima. Definir o laser de 640 nm para visualizar a PSmOrange convertido utilizando alta potência do laser (até 4,5 mW).

5. Desmontar Embrião de LMA

  1. Remover o embrião contendo câmara do microscópio. Remova cuidadosamente o embrião do u agarosecantar fórceps.
  2. Transferência do embrião para um novo plástico esterilizado placa de petri ou em um de 6 poços de placa esterilizada contendo 1x E3 e UTP 0,2 mM. Incubar o embrião a 28 ° C até à fase de desenvolvimento desejado.

6. Analisando o Fate of Photoconverted PSmOrange proteína células que expressam

  1. Re-inserir o embrião como descrito nos pontos 3.3 e 3.4.
  2. Colocar a amostra sob o microscópio confocal e digitalizar a amostra para identificar as células photoconverted (640 nm) na estrutura transgênica GFP de interesse (488 nm).
  3. Adquirir uma z-stack cobrindo as estruturas de interesse utilizando 488 nm, 561 nm e 640 nm lasers no modo sequencial (modo de linha 1-> 4). Fixar o z-passo entre 1,0 e 2,0 mm. média linha ea frequência de scaneamento pode ser usado para otimizar a qualidade da imagem.
  4. Use um dos seguintes métodos para identificar células, que GFP co-express e a proteína photoconverted.
    1. personalizado feito Imagem automática FijiJ 3 Macro
      1. Convolve a pilha original usando o plugin "GaussianBlur" (→ Processo → Filtros → GaussianBlur) e subtrair as pilhas lisas do original usando o plugin "Calculadora de Imagens" (→ Processo → Calculadora de Imagem). Usar este passo de visualizar as estruturas de interesse e reduzir o tempo de processamento para a análise.
      2. Aplicar limites específicos para os canais verde e vermelho-distante, a fim de destacar as células photoconverted (→ Imagem → Ajuste → Threshold). Use o "Analisar Particles" ferramenta para detectar as áreas de limiar com um ambiente adequado (→ Analisar → Analisar Partículas).
      3. Abra o plugin "Calculadora Imagem" e exibir os ROIs sobrepostos no canal verde e vermelho-distante em amarelo (→ Processo → Calculadora de Imagem).
    2. software de imagem de microscópio para avaliação de dados 3D
      1. Mostrar a pilha no3D utilizando a opção view show de volume (→ 3D Menu de visualização → Mostrar Volume View). Use a interface gráfica para selecionar os canais verde, vermelho e far-vermelhos, ajustar o brilho eo contraste e recortar a pilha 3D para destacar a área photoconverted (Figura 1).
        Nota: métodos similares para analisar os dados estão disponíveis na maior parte do software comum para análise de imagem.

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Resultados

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A Figura 1 ilustra um exemplo do sistema PSmOrange fotoconversão. O complexo pineal é uma estrutura conservada no diencéfalo dorsal vertebrado. Como em muitos outros vertebrados, esse complexo é constituído por o órgão pineal no centro do diencéfalo e as células parapineal do lado esquerdo. Experimentos uncaging elegantes, mas demoradas mostraram que as células parapineal originam na parte anterior do órgão pineal 13. Em tg (FOXD3: GFP); tg (FLH: GFP) embriões...

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Discussão

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embriões transgénicos portadores de repórteres fluorescentes têm ajudado fundamentalmente para entender o desenvolvimento embrionário. No entanto, existe ainda a necessidade essencial de promotores de facilitar a visualização específica de estruturas particulares. Na sua ausência, os pesquisadores dependem de técnicas como a fotoconversão de proteínas fluorescentes para saber mais sobre a origem eo desenvolvimento de sua estrutura de interesse. Esta por sua vez é um pré-requisito fundamental para identificar os mecanism...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

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Agradecemos a O. Subach por fornecer o plasmídeo H2B-PSmOrange original e nossa equipe de instalações de peixes para o cuidado dos peixes. Somos gratos ao Nikon Imaging Center da Universidade de Heidelberg pelo acesso ao equipamento de microscopia e software de análise. Reconhecemos o apoio do Core Facility Live Cell Imaging Mannheim no CBTM (DFG INST 91027/10-1 FUGG). Este trabalho foi apoiado pelo Excellenzcluster CellNetworks, EcTop Coordenação espaço-temporal de processos de sinalização (EcTop 2), Universidade de Heidelberg para C.A.B. e a Faculdade de Medicina de Mannheim da Universidade de Heidelberg e a DFG (FOR 1036/2, 298/3-1 e 298/6-1) para M.C.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Kit de Purificação PCRQiagen28104
mMESSAGE mMACHINE SP6 Kit de TranscriçãoAmbionAM1340
RNeasy MiniElute Kit de limpezaQiagen74204
Plastic Pasteuralpha laboratoriesLW4000
Original H2B-PSmOrange PlasmidAddgene31920O plasmídeo descrito no artigo é disponível no laboratório Carl
Microinjetor FemtoJetEppendorf5247 000.013
Fórceps (5 Inox)NeoLab2-1633
Lab-Tek II Chambered #1.5 Sistema de Cobertura de Vidro Alemão Nunc155382
Nikon A1R+Nikon GmbH AlemanhaSem Número
Nikon PLAN Apo λ Objetiva de ar 20X Nikon GmbH AlemanhaSem Número
NIS Elements Software AR (v. 4.30.02)Nikon GmbH Alemanha/Imagens de LaboratórioSem Número

Referências

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