Acompanhando as células GFP em peixes-zebra transgénicos Usando o Sistema Photoconvertible PSmOrange

Carlo A. Beretta; Nicolas Dross; Ulrike Engel; Matthias Carl

doi:10.3791/53604

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Artigo de método

Acompanhando as células GFP em peixes-zebra transgénicos Usando o Sistema Photoconvertible PSmOrange

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DOI:

10.3791/53604

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5 de fevereiro de 2016

Carlo A. Beretta¹^,²^,³ , Nicolas Dross² , Ulrike Engel² , Matthias Carl¹

¹Medical Faculty Mannheim, Department of Cell and Molecular Biology, Heidelberg University, ²COS and Nikon Imaging Center at the University of Heidelberg, Heidelberg University, ³Excellenzcluster CellNetworks, University of Heidelberg

Neste artigo

Resumo

Estabelecemos o sistema PSmOrange fotoconversível como uma ferramenta poderosa, direta e barata para rastreamento de células in vivo em fundos transgênicos GFP. Este protocolo descreve sua aplicação no sistema modelo de peixe-zebra.

Resumo

O rápido desenvolvimento de embriões transparentes de peixe-zebra (Danio rerio) em combinação com marcações fluorescentes de células e tecidos permite visualizar os processos de desenvolvimento à medida que acontecem no animal vivo. As células de interesse podem ser marcadas usando um promotor específico do tecido para conduzir a expressão de uma proteína fluorescente (FP) para a geração de linhagens transgênicas. O uso de proteínas fotoconversíveis fluorescentes para esse fim também permite seguir com precisão estruturas definidas dentro do domínio de expressão. Iluminar a proteína na região de interesse, altera seu espectro de emissão e destaca uma determinada célula ou aglomerado de células, deixando outras células transgênicas em sua cor original. Uma grande limitação é a falta de promotores conhecidos para um grande número de tecidos no peixe-zebra. Por outro lado, as telas de armadilhas de genes e intensificadores geraram enormes recursos transgênicos, rotulando discretamente literalmente todas as estruturas embrionárias, principalmente com GFP ou, em menor extensão, FPs vermelhos ou amarelos. Uma abordagem para seguir estruturas definidas em tais fundos transgênicos seria introduzir adicionalmente uma proteína fotoconversível onipresente, que poderia ser convertida na(s) célula(s) de interesse. No entanto, as proteínas fotoconversíveis disponíveis envolvem um estado de emissão verde e / ou menos frequentemente vermelho¹ e, portanto, muitas vezes não podem ser usadas para rastrear células no fundo FP de linhagens transgênicas existentes. Para contornar esse problema, estabelecemos o sistema PSmOrange para o peixe-zebra^2,3. A simples microinjeção de mRNA sintético que codifica uma forma nuclear desta proteína marca todos os núcleos celulares com fluorescência laranja / vermelha. Após a fotoconversão direcionada da proteína, ela muda seu espectro de emissão para vermelho distante. A eficiência quântica e a estabilidade da proteína tornam o PSmOrange uma excelente ferramenta de rastreamento de células para peixes-zebra e possivelmente outras espécies de teleósteos.

Introdução

Melhorar exponencialmente as técnicas de imagem permite acompanhar os processos de desenvolvimento ao longo de períodos de tempo de até cerca de quatro dias consecutivos³. No peixe-zebra e em muitos outros sistemas de modelos animais, células, tecidos, estruturas axonais ou vasculares específicas são marcadas por proteínas fluorescentes transgênicas verdes ou às vezes vermelhas ou amarelas para facilitar a visualização. No entanto, na maioria das linhagens transgênicas, o transgene não é expresso especificamente nas células de interesse, mas também em estruturas adicionais, o que dificulta o rastreamento preciso de, por exemplo, células individuais ou grupo....