Nós apresentamos um protocolo sobre como utilizar de alto rendimento tomografia crio-eletrônica para determinar alta resolução em estruturas in situ de máquinas moleculares. O protocolo permite que grandes quantidades de dados a serem processados, evita gargalos comuns e reduz o tempo de inatividade de recursos, permitindo que o usuário se concentrar em questões biológicas importantes.
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Artigo de método
Usando Tomoauto: Um Protocolo de métodos de alta capacidade automatizada Cryo-Electron Tomografia
Neste artigo
Resumo
Resumo
A tomografia crioeletrônica (Cryo-ET) é uma poderosa técnica de imagem tridimensional (3-D) para visualizar complexos macromoleculares em seu contexto nativo em nível molecular. A técnica envolve inicialmente preservar a amostra em seu estado nativo, congelando rapidamente a amostra em gelo vítreo, depois coletando uma série de micrografias de diferentes ângulos em alta ampliação e, finalmente, reconstruindo computacionalmente um mapa de densidade 3D. A amostra hidratada congelada é extremamente sensível ao feixe de elétrons e, portanto, as micrografias são coletadas em doses de elétrons muito baixas para limitar os danos causados pela radiação. Como resultado, o criotomograma bruto tem uma relação sinal-ruído muito baixa, caracterizada por uma imagem intrinsecamente ruidosa. Para visualizar melhor os indivíduos de interesse, a análise de imagem convencional e a média do subtomograma em que os subtomogramas do sujeito são extraídos do tomograma inicial e alinhados e calculados são utilizados para melhorar o contraste e a resolução. Grandes conjuntos de dados de séries tilt são essenciais para entender e resolver os complexos em diferentes estados, condições ou mutações, bem como obter uma coleção grande o suficiente de subtomogramas para média e classificação. A coleta e o processamento desses dados podem ser um grande obstáculo que impede uma análise mais aprofundada. Aqui descrevemos um protocolo crio-ET de alto rendimento baseado em um microscópio crioeletrônico de 300kV controlado por computador, uma câmera de dispositivo de detecção direta (DDD) e uma biblioteca de wrapper de software de pipeline de processamento de imagem semi-automatizada altamente eficaz que a tomoauto desenvolveu internamente. Este protocolo tem sido efetivamente utilizado para visualizar o sistema de secreção tipo III intacto (T3SS) em minicélulas de Shigella flexneri. Pode ser aplicável a qualquer projeto adequado para crio-ET.
Introdução
Tipo III sistemas de secreção (T3SS) são determinantes de virulência essenciais para muitos patógenos gram-negativas. O injectisome, também conhecido como o complexo de agulha, é a máquina central de T3SS necessária para a translocação directa de proteínas efectoras a partir da bactéria em células hospedeiras eucarióticas 1, 2. A injectisome compreende uma agulha extracelular, uma basal do corpo, e um complexo citoplasmático também conhecida como o complexo de triagem 3. Estudos anteriores elucidado estruturas 3-D de injectisomes purificadas de Salmonella e Shigella, juntamente com as estruturas atômicas de grandes proteínas do....
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Protocolo
1. Preparação Minicell
- Para fazer com que S. minic�ulas flexneri, transformar 1 ml de plasmídeo pBS58, o que expressa constitutivamente genes divisão celular Escherichia coli ftsQ, FTSA, e FtsZ a partir de um baixo-cópia espectinomicina resistente plasmídeo em 5 jul electrocompetentes Estreptomicina resistente 5a sorotipo (M90T-Sm) células por eletroporação a 2,5 kV para 5 ms em cuvetes de 1 mm.
- Armazenar minic�ula amostras a -80 ° C em glicerol a 15% em 1,5 ml de um microtubo criogénico. Quando pronto para uso, raspar aproximadamente 5 jul de células a partir do microtubo unthawed utilizando uma p....
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Resultados
Amostras de S. minic�ulas flexneri foram coletadas e processadas conforme mostrado na Figura 1 esquema usando tomoauto seguindo o gasoduto detalhado na Figura 2. Tilt-série foram coletados por meio SerialEM 10, que permite a aquisição de alto rendimento tilt-série em pontos designados pelo utilizador em mapas de montagem de baixa ampliação (Figura 3). As micrografias fora.......
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Discussão
O método de alto rendimento descrito aqui nos permitiu processar 1.917 crio tilt-série e produzir mais de 4.500 sub-tomograms do S. intacta flexneri injectisome 19. Os dados recolhidos conduziu à caracterização detalhada de injectisome em situ, incluindo o complexo citoplasmático triagem. O método também foi utilizado para visualizar várias células mutantes com deleção específica de componentes de proteína putativos, o que ajudou a elucidar a composição da plataforma de tri.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Agradecemos ao Dr. William Margolin para comentários. Somos gratos pelo apoio em SerialEM dos Drs. David Mastronarde e Chen Xu. DM, BH e JL foram apoiados por Grant R01AI087946 do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas, concessões R01GM110243 e R01GM107629 do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (NIGMS), e Grant AU-1714 da Fundação Welch. O detector eletrônica direta foi financiado pelo National Institutes of Award Saúde S10OD016279.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Glicerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Caldo de Soja Tirptico | Sigma-Aldrich | 22092 | |
| Espectinomicina | Sigma-Aldrich | S0692 | |
| Aparelho de Eletroporação | Bio-rad | 165-2100 | |
| Cubeta de 1 mm | BTX | 45-0124 | |
| Tubo criogênico de 1,5 ml | Termocientífico | 5000-1020 | |
| Tubo de Microcentrífuga de 1,5 ml | Sigma-Aldrich | Z336769 | |
| Holey Carbon Grids | Quantifoil (Ciências da Microscopia Eletrônica) | Q2100CR2 | R2/2 200 |
| Alternativa Comercial Interna | |||
| Disponível Dessecador a Vácuo | Sigma-Aldrich | Z119016 | Usado no dispositivo interno de descarga de brilho |
| Gerador de Alta Frequência | Produtos Eletrotécnicos | BD-10A | Usado em Dispositivo de Descarga de Brilho Interno. CUIDADO: Este dispositivo gera alto voltages. |
| Pinça de Centrífuga | |||
| Dumont (Ciências da Microscopia Eletrônica) | 72705-D | Estilo 5 Anti-magnético | |
| Coliodal Ouro | Aurion | BSA 10nm | |
| Papel de Filtro | Whatman | #2 | |
| Etano | Matheson Tri-Gas | UN1035 | |
| Nitrogênio | Matheson Tri-Gas | UN1977 | |
| Dispositivo de êmbolo | Alternativa comercial | interna | |
| Caixa de armazenamento de grade criogênica | Microscopia eletrônica Sciences | 71166-30 | |
| Microscópio eletrônico de transmissão | FEI | Tecnai Polara F30 (300 KeV) | |
| Dispositivo de Detecção Direta | Câmera Gatan | K2 | |
| Summit Tomogram Acquisiton Software | SerialEM | http://bio3d.colorado.eud/SerialEM Alternativas: Tomografia UCSF, Leginon, FEI Tomografia em lote | |
| Software de correção de movimento induzido por feixe | MOTIONCORR | http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html Requer >2 GB Nvidia GPU | |
| Tilt-Series Software | de alinhamentoAlternativas do IMOD | http://bio3d.colorado.edu/IMOD: XMIPP, | |
| software de modelagem automática de marcadores fiduciais | Alternativas IMOD | : RAPTOR (incluído no IMOD0 (utilizável no tomoauto) | |
| Software de determinação CTF | IMOD | : CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf (Utilizável no tomoauto) | |
| Software de reconstrução Tilt-Series | tomo3d | https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d Alternativas: IMOD, XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es, Software | |
| de processamento automatizado Protomo Tilt-Series | tomoauto | https://github.com/DustinMorado/tomoauto | |
| Software de coleta de partículas | i3 | http://www.electrontomography.org Alternativas: IMOD | |
| Alternativas ao software de média de subvolume | i3 | : PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET, Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch, PyTom http://pytom.org |
Referências
- Cornelis, G. R. The type III secretion injectisome. Nat. Rev. Microbiol. 4 (11), 811-825 (2006).
- Galan, J. E., Wolf-Watz, H. Protein delivery into eukaryotic cells by type III secretion machines. Nature. 444 (7119), 567-573 (2006).
- Kubori, T., et al.
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Reimpressões e permissões
