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Primária endodérmico epitelial Cultura de Células da gema Sac Membrana de japoneses codorniz Embriões

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DOI:

10.3791/53624

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10 de março de 2016

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1Department of Animal Science and Technology, National Taiwan University

Neste artigo

Resumo

Para estudar o mecanismo de utilização de lipídios nas membranas do saco vitelino durante os estágios finais do desenvolvimento embrionário aviário, estabelecemos um sistema primário de cultura de células epiteliais endodérmicas embrionárias de codorna japonesa.

Resumo

Nós estabelecemos um modelo de cultura de células epiteliais endodérmico (CEE) para estudar a função de certas enzimas e proteínas na mediação de utilização de nutrientes por embriões de aves durante o desenvolvimento. Fertilizados ovos de codorniz Japonesa foram incubadas a 37 ° C durante 5 dias e, em seguida, yolk sac membranas (YSM) foram recolhidas para se estabelecer o sistema de cultura de CEE. Isolamos a camada endoderma embrionário de YSM, e cortado da membrana em 2 - 3 mm pedaços e parcialmente digerido com colagenase antes de semear em placas de cultura de 24 poços. O EECS proliferam para fora do tecido e estão prontos para os estudos de cultura de células. Descobrimos que o EECS tinha características típicas de YSM in vivo, por exemplo, acúmulo de gotículas lipídicas, expressão de esteróis O-aciltransferase e lipoproteína lipase. O tratamento a digestão parcial aumentou significativamente a taxa de sucesso da cultura CEE. Utilizando o EECS, foi demonstrado que a expressão de SOAT1 foi regulado pelo AMPc dproteína quinase ependent Um caminho relacionado. Este sistema de cultura de codorna japonesa CEE primária é uma ferramenta útil para estudar o transporte de lipídios embrionário e para esclarecer o papel de genes envolvidos na mediação de utilização de nutrientes em YSM durante o desenvolvimento embrionário aviária.

Introdução

O recurso principal nutricional do embrião aviário é gema, composto de 33% de lípidos, proteínas 17%, e 1% de cinzas. 1 durante o desenvolvimento embrionário, a membrana vitelina (YSM) cresce a partir de dentro da cavidade abdominal embrionário e cobre gradualmente a gema superfície. Começando no dia embrionário 2, a expressão de genes associados com o metabolismo dos lípidos e a angiogénese é gradualmente aumentada em YSM, e o YSM desenvolve lentamente projecções das vilosidades semelhantes. Estas projecções 8,9 aumentar a absorção de nutrientes gema para suportar o desenvolvimento embrionário. O YSM é um tecido extra-embrionário que contém três camadas germinativas, endoderme, mesoderme e ectoderme. 14 do ectoderma saco vitelino enfrenta a clara e links com a membrana vitelina para cobrir suavemente o saco vitelino. As células epiteliais da endoderme são confrontados diretamente para a gema de ovo e servir como portais de utilização de nutrientes. 6 À medida que a ADM se expande, células epiteliais endodérmico (EECS) pode ser dividido por shape e funcionalidade em dois grupos, a área vitelínicas e vasculosa área. 7

vitelina área é composta por células da endoderme e está distante do embrião; vasculosa área é composta por células mesodérmicas e cobre EECS diferenciadas com vasos sanguíneos e tecidos conjuntivos. Por dia embrionário 5, a gema é totalmente coberta por ectoderma e endoderma de YSM ea área vascular tem crescido rapidamente. O YSM absorve, recompõe e liberta lípidos (como-gema derivado lipoproteína de muito baixa densidade) e proteínas no sistema circulatório embrionário. 9, 2 Assim, foi estabelecido um embrionário sistema de codorniz japonesa primária endodérmica epitelial de cultura de células, para estudar os mecanismos de lípido utilização em YSM durante o desenvolvimento embrionário aviária.

Os lípidos tais como triglicerídeos, lecitina, de fosfolípidos e ésteres de colesterol (CE) são as fontes de energia primárias para embriões de aves. Nas fases iniciais de desenvolvimento, lípidos da gema são Composed de apenas 1,3% do CE e ele sobe para 10-15% a meio do período de desenvolvimento embrionário aviária 3, 11. éster de colesterol é sintetizado a partir do colesterol, esteróis O-aciltransferase 1 (SOAT1) em YSM embrião aviária. 4

A forma de armazenamento de colesterol é CE, CE é realizada nas lipoproteínas e lipoproteínas são transportados pela circulação para os tecidos. 13 Uma semana antes escotilha há um crescimento rápido dos embriões de aves. Aproximadamente 68% do conteúdo de lípidos restantes na gema são absorvidos durante esta fase. 10 O mecanismo pelo qual a gema de lípidos são utilizados pode ser clarificada por um modelo de pesquisa CEE. Um protocolo de cultura de frango CEE foi estabelecido para atingir este objectivo de pesquisa. 2, 9 No entanto, devido à baixa taxa de sucesso de explantes de tecidos, um processo de cultura de células CEE melhorada é necessária para estudar a função de certas enzimas e proteínas na mediação de a utilização de nutrientes pelos embriões de aves durante o desenvolvimento.

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Protocolo

NOTA: Este procedimento é uma modificação de um protocolo de cultura modelo de galinha desenvolvido por Bauer et al 2013 e Nakazawa et al, 2011. 2,9..

1. Prepare Healthy Embryonic Dia 5 embriões de codorniz japonesa

  1. Coloque 1 do sexo masculino e 3 do sexo feminino sexualmente maduros codornas japonesas juntos na mesma gaiola. Alimentação de alimentação e água ad libitum. Ajustar a luz na sala de animal para 14 horas de luz e 10 horas de escuridão.
  2. Recolher os ovos fertilizados em sacos de plástico a cada dia no período da tarde e mantê-los em um 16 ° C geladeira para retardar a taxa de crescimento dos embriões.
  3. Após recolha de um número suficiente de ovos dentro de um período de duas semanas, incubar os ovos fertilizados de uma incubadora a 37 ° C com bom arejamento durante cinco dias.

2. Prepare Basal Médio e soluções de lavagem

  1. Use DMEM / F-12 (ajustado a pH 7,2) como meio de crescimento, e completá-locom o novo 10% de soro vitelo recém-nascido (NBCS) e 1% de Pen-Strep Ampho. Solução (PSA; penicilina, 10 5 unidades / L; estreptomicina, 100 mg / l; anfotericina B, 0,25 mg / L).
  2. Preparar a solução salina tamponada com fosfato (PBS) a uma concentração 10x para o armazenamento; usar a solução 1x PBS (contendo NaCl, 137,93 mM; KCl, 2.667 mM; KH 2 PO 4, 1.471 mM; Na 2 HPO 4 7H 2 O, 8,06 mM; acertar a pH 7,2) para lavar e umedecer o tempo membrana saco vitelino separação da endoderme de gema de ovo e albumina.
  3. Use meio DMEM (ajustado para pH 7,2) para re-suspender as pelotas endoderme.

3. Recolha de EECS primária de japoneses codorniz YSMs

  1. Incubar os ovos recolhidos durante 5 dias (passo 1.3). Examine os ovos por um candler ovo para confirmar o desenvolvimento embrionário normal.
    NOTA: No dia embrionário 5, o limite da YSM mesoderme é muito clara e as 3 camadas embrionárias são menos bem-ligados entre si, por isso é fácil de obendoderme Tain. Utilize apenas os ovos que apresentem o desenvolvimento normal circulação capilar para coleções YSM.
  2. Limpar a casca de ovo com cuidado usando água doce e 75% de etanol. Abra a casca de ovo a partir da posição das células de ar por um par de tesouras, descascar delicadamente fora e recolher toda a YSM por uma pinça e coloque em um prato de cultura 10 centímetros preenchido com 37 ° C 1x PBS.
  3. Utilizando um par de tesouras remover o embrião, gema e clara de ovo, e lavar cuidadosamente o YSM com 1x PBS três vezes e colocar YSM em solução de PBS numa placa de cultura de 10 cm.
  4. Use uma pinça e um par de tesouras para remover o ectoderme de YSM. Use 2 fórceps, um para segurar firmemente a camada de células endoderme, e a outra para segurar o mesoderme capilar.
  5. Sob um microscópio de dissecação, separar e separar a endoderme a partir da borda da mesoderme em direcção ao embrião. Recolhe-se o endoderme amarelo claro em 50 ml de tubos de centrífuga usando um conta-gotas e o lugar em 15 ml de meio de crescimento numa Wat 37 ° Cbanho er até que todas as coleções de tecidos estão concluídas.

4. A digestão do Endoderma fatias por digestão de colagenase

  1. Recentemente dissolver 6,5 unidades de colagenase tipo IV em 10 ml de DMEM.
  2. Centrifugar os tubos de 50 ml (3,4) a 130 xg durante 3 minutos à temperatura ambiente. Aspirar o meio e colocar toda a endoderme em uma placa de cultura de 6 centímetros, usando uma pipeta. Adicionar solução de colagenase 1 ml a esta placa de cultura.
  3. Cortar a endoderme recolhidos a partir de 2 embriões de codorniz com um par de tesouras curvas até que o tamanho de cada fatia é de aproximadamente 2 a 3 mm. Usar um conta-gotas, recolher todas as fatias para um tubo de centrífuga de 50 ml, juntamente com 9 ml de solução de colagenase fresco.
  4. Digerir o tecido com colagenase durante 30 minutos num banho de água com agitação a 37 ° C a 175 rpm. Esta digestão parcial com colagenase é utilizado para melhorar a proliferação de células dos explantes.
  5. Centrifugar a 130 xg durante 3 minutos à temperatura ambiente e suavemente remover a fracção do sobrenadante utilizando uma pipeta. Lava-se a pelete por suspensão em 20 ml de DMEM e remover a fracção do sobrenadante após a centrifugação de 130 x g durante 3 min.
  6. Re-suspender o sedimento com 12 ml de meio de crescimento (DMEM / F12 com 10% de NBCS e 1% de PSA) e sementes suavemente e igualmente numa placa de 24 poços (cada poço uma solução de células com 500 ul).
  7. Incubar explantes de tecido a 37 ° C em 5% de CO 2 em ar durante 2 dias para permitir que as células a proliferar para fora dos tecidos.
  8. Incubar as células por mais 2 dias e caracterizar quanto à viabilidade celular por um protocolo de ensaio de viabilidade celular. 15
    NOTA: Living células manter um ambiente de redução dentro do citoplasma. Resazurina, o ingrediente activo, é, de um composto não-tóxico permeável célula que é azul em cor e virtualmente não fluorescente. Quando adicionado a culturas de células, a Resazurina é reduzida a resorufina no citosol por enzimas mitocondriais. Resorufina é de cor vermelha e altamente fluorescente. As células viáveis ​​converter continuamente resazurina a resorufina, increasing a fluorescência global e cor do meio de cultura de células circundante.
  9. Realizar endoderme célula epitelial de isolamento de ARN total, a transcrição e quantitativa PCR em tempo real de expressão de ARNm de gene marcador reversa como descrito 16,17.
    1. Use de PCR de transcriptase reversa para detectar SOAT1 ARNm (sentido directo: 5'-GAAGGGGCCTATCTGGAACG-3 '; anti-sentido: 5'-ATCTGCACGTGACATGACCA-3'; produto de PCR = 168 pb) como um marcador específico para as células CEE. Use β-actina de ARNm (sentido directo: 5'-TGGTGAAGCTGTAGCCTCTC-3 '; anti-sentido: 5'-GTGATGGACTCTGGTGATGG-3'; produto de PCR = 151 pb), como um gene de manutenção e o controlo interno.
    2. Use electroforese em gel para detectar o tamanho do produto de RT-qPCR. Prepare 1% de gel de agarose, e misturam 10 jil do produto qPCR com 2 ul de corante de carga. Carga de 10 ul de mistura em cada poço em gel de agarose a 1%, e executar o gel por 100V durante 30 minutos.

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Resultados

A fim de alcançar o objetivo de estabelecer um modelo de celular consistente e útil, nós precisamos de alargar e estabilizar a taxa de proliferação e desempenho dos EECS aviária. Comparamos a incubação directa da endoderme sem digestão com enzima endoderme parcialmente digerido com enzimas proteolíticas, tais como colagenase ou colagenase mais 0,6 L de dispase. Dispase é um amino-endopeptidase que hidrolisa as ligações peptidicas N-terminais de resíduos de aminoácidos não-polares. Consid...

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Discussão

Uma vez que o sistema de cultura anterior tem apenas um sucesso limitado, é necessário um sistema de cultura melhor. A endoderme codornizes YSM japonesa requer tratamento com enzimas proteolíticas tais como a colagenase para soltar as junções célula-célula para alcançar um melhor desempenho do crescimento nos explantes ex-vivo. Os nossos dados mostram que o número de células de tratamento digestão parcial foi maior do que a partir da cultura de tecido não digerido após a sementeira, durante 2 dias (Figura 1).

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Divulgações

Não há interesses financeiros concorrentes ou outros conflitos de interesse. Não recebemos nenhum financiamento de nenhuma empresa privada.

Agradecimentos

O financiamento para o desenvolvimento de protocolo atual é particularmente apoiada por "Aim para o Plano Universidade Top", da Universidade Nacional de Taiwan, Taiwan (concessão ID-104R350144), bem como o Ministério da Ciência e Tecnologia de Taiwan (ID concessão: a maioria dos 104 -2313-B-002-039-MY3). Agradecemos especialmente o Centro de Biotecnologia da Universidade Nacional de Taiwan para fornecer uma sala de animais e espaço de laboratório para o estudo atual.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco da Life technologies12800-017 10 X 1 LPara lavar os pellets EECs
D-MEM/F-12Gibco da Life technologies12400-024 10 X 1 LComo meio basal na cultura de EECs
NBCSGibco da Life technologies16010-159Como o soro de fornecimento na cultura de EECs
Pen-Strep Ampho. SoluçãoBI (Indústrias Biológicas)03-033-1B 100 mlPara atenuar a possível infecção 
Colagenase Tipo IVGibco da Life technologies17104-019 1 g  A colagenase é uma protease com especificidade para a ligação entre um aminoácido neutro (X) e glicina na sequência Pro-XGly-Pro. Como a protease para dissociação de células do tecido primário.
placa de 24 poçosFALCON® REF-353047Para EECs para anexar e estender
tubos de centrífuga PP de 50 mlCorning® CentriStarTM430829Para transporte de membranas e digestão enzimática
Tubo de fundo cônico de 50 ml com tampaPRO TECHCT-50-PL-TWPara transporte de membranas e digestão enzimática Banho de
agitação recíprocaDEAGLESB302Para melhor digestão enzimática nas membranas

Referências

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