Introduction
Una rica historia de la investigación que abarca más de 50 años se ha centrado en la cuantificación de las propiedades mecánicas de los tejidos vasculares. Estos estudios nos permiten comprender mejor tanto el comportamiento fisiológico y patológico de los vasos sanguíneos, proporcionamos una base para evaluar la eficacia / compatibilidad de los dispositivos endovasculares, y la ayuda en el diseño y fabricación de vascular ingeniería construye 1.6. Medición precisa de la respuesta mecánica de los tejidos blandos y modelización constitutiva de sus propiedades mecánicas es inherentemente un reto debido a la mecánica heterogeneidad, anisotropía, y no linealidad exhibido por la mayoría de los tipos de tejidos. Por otra parte, las mediciones experimentales son a menudo confundidos por complejidades locales introducidas en las interfaces de la muestra de agarre en el transcurso de ensayos mecánicos (es decir, la flexión, la fricción, las concentraciones de esfuerzos, desgarro) y la transición inevitable de las propiedades mecánicas una vez que el tejido se escinde del animal vivo. </ p>
Un experimento de tracción uniaxial se encuentra entre los ensayos mecánicos simples que se pueden realizar en una muestra hecha de un material sólido, y con frecuencia se utiliza para evaluar la respuesta mecánica de tejido vascular. Los resultados de estos experimentos proporcionan información preliminar útil para ambas fuentes de tejidos nativos y artificiales, y pueden ser utilizados para comparar los efectos de ciertos tratamientos, estados de enfermedad, o compuestos farmacológicos en el comportamiento mecánico de la pared vascular 7-11.
Ensayos mecánicos uniaxial de los tejidos blandos se realiza típicamente en muestras con geometrías relativamente uniformes, que son más comúnmente de hueso de perro o en forma de anillo 7,8,12-14. Sin embargo, desviación significativa de estas geometrías idealizadas puede ocurrir debido a los desafíos asociados con la disección de tejidos, el aislamiento y sujeción dentro del sistema de prueba. Cualquier falta de uniformidad en la geometría en última instancia, dar lugar a estrés heterogénea y la tensióncampos cuando la muestra se somete a la extensión uniaxial, con el grado de depende de la forma real de la muestra heterogeneidad, así como tamaño de la muestra (en relación con los agarres) y las propiedades mecánicas del material 9,15,16. Cuando heterogeneidades de campo son significativos, los cálculos de deformación de la muestra en base a las posiciones de agarre relativos son inexactos y por lo tanto una base insuficiente para evaluar el comportamiento mecánico.
Sistemas de análisis de vídeo han sido ampliamente utilizados para las mediciones de deformación de los tejidos blandos, a menudo el uso de marcadores de colorante de alto contraste aplicados a la superficie de la muestra 17,18. Correlación de imágenes digital, una técnica metrológica óptico que mide la tensión superficial de campo completo mediante la comparación de valores de intensidad de nivel de gris en la superficie de la muestra antes y después de la deformación, se ha utilizado en conjunción con vídeo análisis de los tejidos blandos 19-21. Hay varias ventajas de la correlación de imágenes digitales en comparación con interferometric métodos que pueden ser empleados para las mediciones. En primer lugar, como una técnica de medición sin contacto, que minimiza los efectos de confusión de la modificación de las propiedades del material debido a la forma en que el sistema de medición afecta a la muestra. En segundo lugar, se requiere un ambiente mucho menos estrictas medición y tiene una gama más amplia de sensibilidad y resolución que otros métodos. En tercer lugar, dotado de la capacidad de captura de un campo de visión completo, esta técnica puede caracterizar tanto la media y las respuestas mecánicas locales. Para una explicación detallada del método, se anima a los lectores a ver el libro de Sutton 22.
Para obtener campos de deformación en la superficie de la muestra, una técnica de correlación digital de la imagen de dos dimensiones (2D-DIC) se puede utilizar. En pocas palabras, las imágenes de la muestra son capturados en estados cargados sin carga y diversos. La primera imagen se divide en cuadrados pequeños llamados subconjuntos (M × M píxeles) que forman una malla para su posterior cálculo deCampos de deformación 2D. Se obtiene la posición de cada plaza en la muestra deformados mediante un algoritmo de imagen coincidente. El movimiento de cada cuadrado es entonces seguido, imagen por imagen, produciendo campos de desplazamiento que luego pueden ser utilizados para derivar los gradientes de deformación y las tensiones a través de una variedad de métodos, incluyendo polinomio de montaje o de elementos finitos interpolación. En el presente manuscrito, proporcionamos una metodología detallada para la evaluación de los campos de tensiones superficiales en tejidos vasculares nativas a través de la integración de los ensayos de tracción uniaxial y 2D-DIC.
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Protocol
NOTA: Los procedimientos descritos a continuación se realizaron como parte de un protocolo aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Carolina del Sur en Columbia, Carolina del Sur.
1. Adquisición y disección de tejidos
- Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos antes de la disección de tejidos. Tijeras Autoclave quirúrgicos y pinzas estándar finas, así como cuchillas quirúrgicas bajo presión de 15 psi y temperatura de 121 ° C durante 15 minutos.
- Adquirir un conjunto de porcino fresca (7 meses de edad machos Landrace, 60-70 kg) riñones con la aorta intacta de un matadero local. Tejido transporte al laboratorio en solución salina tamponada (PBS) Solución de helado de fosfato 1%.
- Inmediatamente después de su llegada, aislar la aorta abdominal del tejido circundante utilizando tijeras quirúrgicas y pinzas.
- Lavar el recipiente tres veces utilizando una jeringa de 50 ml lleno de PBS (pH 7,2). El uso de las tijeras y pinzas, quite tanto tejido perivascular como possIble sin comprometer la integridad de la muestra.
- Verticalmente colocar una hoja de afeitar afilada en la sección central de la embarcación y asegúrese de que es perpendicular al eje longitudinal del vaso. Crear dos muestras de anillo cada uno con una anchura de aproximadamente 20 mm mediante la aplicación de tres cortes circunferenciales secuenciales con la hoja de afeitar.
- Verticalmente posicionar una hoja de afeitar afilada en una sola muestra de anillo de tal manera que la hoja se orienta en la dirección radial. Aplicar una fuerza aguda para producir un corte radial, que se traduce en una muestra en forma de tira para ensayos mecánicos uniaxial. Colocar la muestra en una placa de Petri de 100 mm de vidrio y sumergirse en PBS hasta que la aplicación de motas superficie. Repita el procedimiento para la segunda muestra el anillo.
2. Creación de la superficie del patrón moteado
- Conectar el aerógrafo a la válvula de presión.
- Ajuste el diámetro de la boquilla del aerógrafo para producir motas de 60 a 100 micras (rango apropiado para el diámetro de la boquilla debedeterminar a partir de estudios preliminares).
- Verter aproximadamente 2 ml de tejido negro tinta de marcado en el alimentador de gravedad de la aerógrafo.
- Coloque el aerógrafo aproximadamente 0,5 m de distancia de la muestra.
- Retire la muestra de la placa de Petri. Pulverizar colorante de marcación de tejido en la superficie de la íntima de la muestra durante aproximadamente 5 segundos bajo una presión de pulverización de 100 psi. Repetir tres veces para asegurar que el patrón de speckle cubre uniformemente la superficie de la muestra.
3. Realización de experimentos
- Fije cada extremo de la muestra a una tira de plástico (1 cm de anchura x 1 cm de longitud x 0,5 cm de espesor) usando un adhesivo tisular. Colocar la muestra en una tabla de cortar el tejido. Coloque la muestra de tal manera que quede plana y medir sus dimensiones usando un calibrador digital.
- Iniciar controles del sistema para la prueba mecánica. En el sistema controla la pantalla de inicio, seleccione "forma de onda" en la barra de tareas se encuentra en la pestaña "Configuración".
- Anunciosimplemente la posición de la empuñadura superior del probador mecánico a -4 mm (4 mm extensión relativa a la posición inicial designada en el sistema). Asegurar suavemente una tira de plástico (que se adjunta a la muestra de 3,1) en la empuñadura superior del probador mecánico y dejar que la muestra cuelgue libremente. Utilice el calibrador digital para asegurar que la distancia entre la muestra y el agarre superior es de menos de 2 mm.
- Ajustar manualmente la posición de la empuñadura inferior de modo que el extremo libre de la muestra puede ser asegurado sin extensión. Asegurar suavemente la tira de plástico unida al extremo libre de la muestra en el agarre inferior del probador mecánico.
- Utilice el calibrador digital para asegurar que la distancia entre la muestra y la empuñadura inferior es de menos de 2 mm. Cero la célula de carga del sistema. Mida la longitud de la muestra y utilizar esto como la longitud de referencia para el cálculo de tensiones circunferenciales globales.
- Introduzca el protocolo de ensayos mecánicos. El protocolo utilizado en tsu demostración implica 4 ciclos de desplazamiento uniaxial que se extienden la longitud de la muestra en un 18% a una velocidad de desplazamiento de 0,01 mm / seg.
- De forma intermitente rociar PBS sobre la muestra a lo largo del protocolo de pruebas restantes para asegurarse de que permanece hidratado.
- Monte la cámara (cámara de 5 mega píxeles, lente de 100 mm, tamaño de píxel de 3,49 micras) sobre un trípode que se sitúa 1,5 m del marco de carga. Asegurarse de la cámara y superficie de la muestra son perpendiculares ajustando la cámara en el campo disponible más bajo de la profundidad y la manipulación de su alineación de tal manera que todo el campo de vista está en foco.
- Abra el software de captura de imágenes.
- Seleccione "PGR-2" en la opción "Seleccionar sistema".
- Seleccione la ruta del proyecto para guardar las imágenes a analizar.
- Haga clic en el icono de "Time Square" y especifique el intervalo de adquisición como 5 seg.
- Ajuste la exposición, apertura numérica, y el enfoque de la lente con el fin de obtener una visión clara de la muestra.
- Ajuste la posición del LED para proporcionar la iluminación adecuada en la muestra.
- Haga clic en el icono "Inicio" en el software de captura de imagen para obtener una imagen de la superficie de la muestra.
- Abra el software de análisis de imágenes.
- Importe la imagen obtenida. Zoom en un moteado individual, y luego contar el número de píxeles dentro de este moteado individual.
Nota: Identificar un moteado negro representativa. Definir el tamaño speckle como la distancia lineal entre píxeles en ambos lados de la speckle que tienen altos valores similares. Para un tamaño de speckle aceptable, el número de píxeles a través de la anchura de un speckle típica debe ser mayor de 3 píxeles. Para mejorar la resolución espacial en las mediciones, la mayoría de manchas deben tener no más de 5-7 píxeles a lo ancho de la speckle, siempre que sea posible. Así, un moteado típico para este caso oscilaría entre 10 micras, con el más pequeño y 23 micras, con el más grande en dimensión lineal. Para determinar un subconjunto adecuadotamaño, un subconjunto típica debe tener al menos 3 blanco y 3 motas negras a través de su anchura. Si un speckle típica es de 5 píxeles en dimensión lineal, entonces cada subconjunto 31x31 sería al menos 105 m en la dimensión lineal. La separación entre centros de subconjuntos debe ser al menos 1/6 de la dimensión lineal. Por lo tanto, para un tamaño de 31x31 subconjunto, la distancia es de 5 píxeles que representa 18 micras de distancia lineal. - Después de verificar la calidad de patrón moteado, haga clic en el icono de forma simultánea "Ejecutar" en el sistema y el icono "Inicio" en el software de captura de imagen para iniciar la prueba.
- Captura de una serie de imágenes a lo largo de la prueba utilizando el software de la cámara y la captura de imágenes.
4. Procedimientos de limpieza después del experimento
- Coloque la muestra descartada en la bolsa de riesgo biológico y cerrar la bolsa. Llame al Departamento de Salud Ambiental y Seguridad (EHS) de la Universidad de Carolina del Sur para su eliminación adecuada.
- Preparar un fosfatosolución desinfectante libre con una relación 1:64 dilución de detergente desinfectante de agua destilada. Remojar las herramientas quirúrgicas en esta solución durante 20 min.
- Enjuague los artículos descritos en 4.2 con agua destilada. Seque las herramientas utilizando una toalla de papel y luego rociar con una solución de etanol al 70%. Una vez más, secar los instrumentos quirúrgicos utilizando una toalla de papel y volver a ponerlos en la caja de herramientas quirúrgica.
5. Análisis de Imágenes para medir el campo de deformación local
- Abra el software de análisis de imágenes.
- Haga clic en la pestaña "imágenes de moteado", seleccione todas las imágenes que deben ser analizados.
- Haga clic en la herramienta rectángulo y seleccionar el área de interés en la primera imagen.
- Introduzca el tamaño de subgrupo 41 × 41 píxeles y tamaño de paso 5 píxeles.
- Haga clic en Inicio pestaña análisis en el software, seleccione la interpolación como optimizada 8-trampa; seleccione el criterio de que las diferencias al cuadrado normalizados de cero y pesos subconjunto de opciones como Gauss.
- Configure las opciones de umbral como por defecto en el software.
- Haga clic en la ficha sub post-procesamiento en la ficha de análisis de inicio. Haga clic en la opción de la tensión de cálculo y dejar el tamaño del filtro y el tipo de filtro por defecto en el software. Seleccione tensor de tipo Lagrange.
- Seleccione la ficha de datos y, a continuación, seleccione cualquier imagen analizada para la visualización del campo de deformación superficial.
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Representative Results
Los datos mecánicos adquiridos a partir de una prueba de extensión uniaxial en rampa sobre el tejido vascular se compone de carga frente a las relaciones de desplazamiento muestra aplicada a una tasa de desplazamiento dado. En este estudio, 2D-DIC, en relación con ensayos mecánicos uniaxial se utiliza para medir los campos de deformación superficie de la muestra en direcciones ortogonales en varios estados deformados. La naturaleza viscoelástica de tejido vascular se manifiesta por la notable grado de histéresis en las curvas de carga-desplazamiento antes de preacondicionamiento mecánica. Para promover la reproducibilidad de los ensayos mecánicos y obtener una respuesta mecánica elástica, el tejido se acondiciona previamente a través de varios ciclos de carga-descarga en la que histéresis se disminuyó gradualmente (Figura 1). A pesar de la preparación de la muestra muy cuidadoso y de montaje, las mediciones 2D-DIC demuestran que el campo de deformación superficie intimal resultante es altamente heterogénea tanto en el direcciones circunferencial y longitudinal. Como era de esperar, los valores de deformación circunferencial locales aumentan con el desplazamiento de la muestra aplicada. La heterogeneidad en el patrón de tensión circunferencial generalmente produce valores que son inferiores cerca del centro de la muestra en comparación con cerca de la interfaz de la muestra de agarre, lo que refleja los efectos de la empuñadura en las cepas locales (Figura 2). En la dirección longitudinal, las cepas de compresión no uniformes resultantes sobre la superficie de la muestra de la íntima se incrementan como la muestra se extendió gradualmente, y el campo cepa resultante exhibe un grado más pronunciado de la heterogeneidad con respecto a la dirección circunferencial (Figura 3). Se calcularon los coeficientes de variación (CV) de los campos de deformación de superficie en direcciones ortogonales para reflejar el grado de heterogeneidad de campo en ciertos estados experimentales, y se encontró que disminuir monótonamente con el aumento de la extensión de la muestra (Tabla 1).
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Figura 1. Experimental preacondicionamiento de muestra de tejido vascular para ensayos de tracción uniaxial. Una muestra de forma rectangular se acondicionará previamente con tres ciclos de carga y descarga para obtener una respuesta elástica reproducible. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. campo de deformación circunferencial dentro del área de muestra de interés. (A) Ejemplo representativo de manchado superficie de la muestra de la íntima y el área identificada de interés. (B) yy ε deformación circunferencial local (%) dentro del área identificada de interés a aumentarniveles de tensión circunferencial mundial aplicada (aumento del 1,6% al 9% a 18%, de izquierda a derecha). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. campo longitudinal cepa dentro del área de muestra de interés. (A) Ejemplo representativo de manchado superficie de la muestra de la íntima y el área identificada de interés. (B) xx ε deformación longitudinal local (%) dentro del área identificada de interés a niveles crecientes de tensión circunferencial mundial aplicada (aumento del 1,6% al 9% a 18%, de izquierda a derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
Tabla 1. Los coeficientes de variación de los campos de deformación. Los coeficientes de variación (CV) de campos de tensiones superficie de la muestra de la íntima en tanto circunferencial (yy ε) y longitudinal (xx ε) direcciones a seleccione niveles de deformación circunferencial global aplicada.
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Discussion
Aunque estudios previos han utilizado una amplia gama de métodos de vídeo de tinte de seguimiento para evaluar la tensión de la muestra 18,20,21,23,24, nuestro objetivo actual es proporcionar una metodología integral para acoplar de ensayo de tracción uniaxial con 2D-DIC para la evaluación de cepas de superficie en muestras de tejido vascular. Con una cámara de alta resolución y el software de análisis de imágenes de la casa, el campo de deformación se puede medir dentro de una región de la superficie determinada como la muestra sufre carga uniaxial. De particular importancia para ensayos mecánicos de tejido vascular, la técnica presentada se puede adaptar directamente para evaluar cepas de superficie en las pruebas de bi-axiales planas que a su vez permitir la identificación de propiedades de los materiales constitutivos.
Con el fin de facilitar el análisis de correlación de imágenes digital, un patrón moteado se aplica a la superficie de la muestra. La pintura utilizada para speckling es un colorante de marcación de tejido que se adhiere fácilmente a la mayoría de superficies de tejidos blandos. Para lograr unabuena calidad de contraste y la densidad adecuada de la pauta de moteado, un tamaño óptimo de speckle de 60-100 micras y pulverización distancia de 0,5 m se realizan mediante el ajuste del diámetro de la boquilla del aerógrafo y la distancia entre la muestra y el aerógrafo. El tamaño moteado utilizado está directamente relacionado con la resolución de las mediciones resultantes 23,25. Cada moteado tiene que ser muestreado por al menos 3-5 píxeles para obtener la correlación de imagen aceptable. Dado un campo de 22 mm × 18 mm de vista y el tamaño speckle utilizado, la resolución del experimento presentado es 9 m / pixel.
Una tasa de carga de 0,01 mm / seg se utiliza para ensayos mecánicos con el fin de obtener una serie de estados de equilibrio deformada cuasi-estática para el tejido vascular 26,27. Dado que la cámara y la célula de carga de alta fidelidad son a la vez muy sensible a las vibraciones, no debe haber un mínimo movimiento durante el experimento; aunque pequeña, cuerpo rígido cámara / espécimen movimiento puede ocurrir y wmediciones en 2D basado en DIC enferma confunden. Del mismo modo, la deformación de la muestra puede ocurrir debido a la deshidratación del tejido, por lo tanto, es importante que PBS se aplica a través de pruebas para promover la exactitud de 2D-DIC.
Para 2D-DIC, especificaciones requeridas incluyen el tamaño subconjunto y el tamaño de paso utilizada en el algoritmo de imagen coincidente 22. A fin de obtener resultados precisos con sesgo insignificante, por lo menos 3 negro y 3 puntos blancos deben estar presentes en cada subconjunto, con cada speckle muestreada por lo menos 3-5 píxeles. Cada punto de datos en la salida proporciona información promediada sobre una caja que corresponde al tamaño subconjunto (41x41 píxeles), considerado como la resolución espacial del experimento. La distancia entre dos puntos de datos en términos de tamaño de paso es de 5 píxeles en este experimento. Con el fin de maximizar la precisión en las mediciones de deformación desplazamiento moteado / superficie, se aplica un método de interpolación spline 8-tap para obtener valores precisos de intensidad sub-pixel. La metanfetamina 8-tapod tiene algo mayor precisión en la obtención de cepas en comparación con los resultados obtenidos utilizando un 4-tap o filtro de interpolación 6-tap. El criterio de correlación "diferencias al cuadrado normalizados" fue seleccionado para el juego, ya que no se ve afectada por un cambio de escala en la iluminación (por ejemplo, cuando un subconjunto deforme es 30% más brillante que la referencia). Esta opción es la selección por defecto en el software y por lo general ofrece la mejor combinación de flexibilidad y da como resultado 28. Ponderación subconjunto, que controla cómo se ponderan los píxeles dentro del subconjunto en la casación, se selecciona como Gauss. Con pesos uniformes, cada píxel dentro del subconjunto se considera por igual; Pesos Gaussianos proporcionan la mejor combinación de resolución espacial y resolución de desplazamiento.
Los coeficientes de variación del campo de deformación superficial se calcularon con el software de análisis de imágenes de la casa y se utilizan para cuantificar el grado de heterogeneidad cepa. El coeciente de variación del campo de deformación en las direcciones circunferencial y longitudinal disminuyó con el aumento cepa circunferencial global, que se ha observado previamente en pruebas mecánicas análogas en otros tipos de tejidos vasculares (resultados no publicados). En base a esta tendencia persistente, es razonable esperar que los campos de deformación de superficie podrían homogeneizar suficientemente por encima de un cierto grado crítico de extensión de tal manera que las mediciones globales y locales convergen. Sin embargo, es probable que este valor crítico es tejido- y muestra específica, apoyando así el uso de medidas de deformación locales para la identificación precisa de las propiedades del material constitutivos.
Varias limitaciones deben ser considerados para la correcta interpretación de nuestra metodología y los resultados presentados. Nos recetó un rango moderado de la tensión circunferencial global, por lo tanto nuestras magnitudes de deformación locales realizadas en ambas direcciones circunferenciales y longitudinales fueron significativamente menores que los valores observados in vivo. Además, se evaluó la respuesta mecánica uniaxial bajo una única orientación de la muestra, y por lo tanto generar datos suficientes para identificar propiedades de los materiales constitutivos de tejido vascular 29,30. Sin embargo, nuestro objetivo no es realizar un análisis de mecánica integral de la aorta porcina, sino más bien para demostrar un protocolo experimental para acoplar 2D-DIC a una prueba mecánica uniaxial en los tejidos blandos. La técnica presentada en este documento se puede ampliar fácilmente para ensayos mecánicos biaxial y por lo tanto la cuantificación de las propiedades mecánicas constitutivas de los tejidos vasculares 31-33. El método DIC-2D sólo captura un campo de deformación planar correspondiente a la superficie de la muestra. Cuando la muestra se deforma fuera del plano, o cuando la muestra es una geometría no plana (por ejemplo, de los vasos sanguíneos), imagen estéreo-visión y una técnica de 3D DIC se puede aplicar para la medición de la tensión integral 23,25.
nt "> En resumen, el presente manuscrito se proporciona información detallada sobre la metodología para integrar ensayo de tracción uniaxial y la correlación de imágenes digitales para caracterizar la respuesta mecánica de tejido vascular nativa. El método presentado en este estudio se puede adaptar fácilmente para la caracterización mecánica de otra nativa y diseñado tejidos blandos, así como de hidrogel blando / materiales poliméricos, y es particularmente útil cuando el campo muestra cepa superficie exhibe una heterogeneidad significativa durante la prueba mecánica.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen conflictos de interés potenciales.
Acknowledgments
El software y el soporte técnico son cortesía de correlacionada Soluciones Incorporated (www.correlatedsolutions.com).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Uniaxial tensile mechanical tester | Enduratec | 3230 AT/HR | |
| Blue tissue marking dye | http://www.ebay.com/itm/Tissue-Marking-Dye-in-Bottles-2oz-Bottle-1-ea-/201193551510?pt=LH_DefaultDomain_0&hash=item2ed811f696 | ||
| Sprayer | Anest-iwata | CM-B | Custom Micron B |
| Camera | Point Grey | GS2-GE-50S5M-C | |
| Lens | Tokina | AT-X M100 | |
| Vascular tissue | Caughman Inc | ||
| 0.9% Sodium Chloride Injection PBS | BAXTER HEALTHCARE CORP. | ||
| Vic_snap | Correlated Solutions | ||
| Vic_2D | Correlated Solutions | ||
| Wintest 4.1 | Bose ElectroForce | ||
| Tissue adhesive | 3M Vetbond | 1469SB | |
| Disinfectant | Fisher Scientific | 04-355-13 | Decon BDD Bacdown Detergent Disinfectant |
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