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Artigo de método

Tridimensional Cultura alginato-talão de células humanas adenoma pituitário

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DOI:

10.3791/53637

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18 de fevereiro de 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Biophysics and Neurosciences, Center for Research and Advanced Studies (CINVESTAV-IPN), 2Department of Experimental Pathology, Nacional Institute of Neurology and Neurosurgery

Neste artigo

Resumo

Cultura tridimensional em grânulos de alginato, devido à sua simplicidade e reprodutibilidade, foi escolhida para manter as células do adenoma hipofisário. Os procedimentos incluíram uma digestão enzimática inicial e dissociação mecânica do tecido tumoral, e a suspensão celular subsequente foi encapsulada em esferas de alginato.

Resumo

Um método de cultura tridimensional é descrito em que as células adenoma pituitário primário são cultivadas em drageias de alginato. O alginato é um polímero derivado de algas marinhas castanhas. Resumidamente, o tecido tumoral é cortado em pequenos pedaços e submetidas a uma digestão enzimática com colagenase e tripsina. Em seguida, uma suspensão de células é obtida. A suspensão de células tumorais é misturado com 1,2% de alginato de sódio e vertida numa solução de CaCl 2, e a suspensão de alginato / célula é gelificada em contacto com o CaCl2 para formar grânulos esféricos. As células embebidas nas drageias de alginato são fornecidos com nutrientes fornecidos pelos meios de cultura enriquecido com 20% de FBS. cultura tridimensional em drageias de alginato mantém a viabilidade das células de adenoma por longos períodos de tempo, até quatro meses. Além disso, as células podem ser libertados a partir do alginato por lavagem das pérolas com citrato de sódio e semeadas em lamelas de vidro para posteriores análises imunocitoquímicas. O uso de um celModelo L cultura permite a fixação e a visualização do citoesqueleto de actina com desorganização mínima. Em resumo, as drageias de alginato proporcionam um sistema de cultura de confiança para a manutenção de células de adenoma pituitário.

Introdução

Andaimes tridimensionais têm sido extensivamente utilizados em cultura de células porque proporcionam um suporte estrutural tridimensional de células de cultura e a manutenção de uma comunicação célula-a-célula. materiais poliméricos naturalmente derivados têm sido usados ​​para fazer suportes tridimensionais, incluindo colagénio do tipo I, a quitosana e alginato. O alginato é um polímero natural derivado do Macrocystispyrifera de algas marinhas castanhas (alga marinha). Este polímero é composto por unidades repetidas de ácido D-manurónico β-(M) e L-α-gulurónico ácido (L) 2 e forma geles estáveis ​​na presença de determinados catiões bivalentes, tais como cálcio e bário. Cloreto de cálcio (CaCl2) soluções são vulgarmente utilizados como o reagente de reticulação para formar as drageias de alginato. Soluções de alginato caiu em CaCl2 formar imediatamente géis esféricas tridimensionais. Quando a solução de alginato é misturada com as células, as células são encapsuladas em alginato bEADS 3.

O alginato tem propriedades que permitiram que ele seja utilizado como uma matriz para a encapsulação de uma grande variedade de células, incluindo condrócitos, mioblastos 4 5 esqueléticos e as células estaminais neurais 6. É um material inerte e permite a difusão de nutrientes, oxigénio e produtos metabólicos que manter a sobrevivência e função de células; Além disso, ao contrário de outros sistemas de cultura à base de gel, células cultivadas dentro de drageias de alginato pode também ser libertado a partir do andaime usando quelantes de cálcio, tais como citrato de sódio, e, em seguida, as células podem ser colhidas para investigações adicionais 7.

adenomas hipofisários são tipicamente tumores benignos com taxas de proliferação baixos. Linhas de células de pituitária de rato adenoma foram cultivadas com sucesso num sistema bidimensional de 8. No entanto, esta cultura de células de tumores humanos de secreção pituitária não é um desenvolvimento eficiente; células de pituitária tumor dispersos crescem malem cultura, as células exibem ligação limitada e difusão, e as células formam tipicamente agregados que flutuam na placa de cultura de 9,10.

Várias tentativas têm sido feitas para se obter uma suspensão de células de tumor da pituitária, incluindo uma abordagem enzimática e dispersão mecânica 11, uma abordagem dispersão unicamente mecânica 12 e a cultura de explantes de tumores 10. Com estas abordagens, diferentes autores obtiveram culturas aderentes viáveis ​​para diferentes períodos de tempo. As capacidades das células secretoras do tumor para sobreviver em tais sistemas bidimensionais dependem do tipo de tumor e as suas taxas de proliferação 9. No entanto, em culturas a longo prazo, as células de fibroblastos com fenótipos predominam 11,13. Este artigo descreve um método para a obtenção de uma cultura primária de células de adenoma pituitário encapsuladas em pérolas de alginato que liberta-los ainda mais a partir do alginato de andaime que permite análises detalhadas deaspectos de sua biologia celular, por exemplo, seus arranjos do citoesqueleto.

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Protocolo

Este estudo foi aprovado para o uso de material humano pelas comissões éticas locais do estabelecimento de saúde e do Centro de Pesquisa e avançar nos estudos do Instituto Politécnico Nacional.

Aquisição Amostra 1. Tumor

  1. Obter a biópsia de tecido adenoma pituitário de um paciente através de um procedimento cirúrgico trans-esfenoidal 14.
  2. Recolha da amostra adenoma pituitário e colocá-lo em um frasco de vidro estéril contendo 50 ml de fresco 199 de meio de cultura (M199) enriquecido com 10% de soro fetal de bovino (FBS), 0,6 mg / ml de bicarbonato de sódio, 2,4 mg / mL de Hepes e 1% antibióticos (penicilina / estreptomicina) a pH 7,4. Manter a amostra em um frasco de vidro no gelo.
    Nota: O tecido tumoral pode ser processado várias horas após a cirurgia.
  3. Transportar a amostra de tumor para o laboratório do frasco de vidro em gelo.

2. Preparação das soluções enzimáticas Tissue dissociação, oSolução de tripsina inibidor e as soluções de alginato

Nota: Antes do processo de cultura celular preparar as seguintes soluções. Filtro de todas as soluções que utilizam um filtro de membrana de 0,22 um, antes do uso.

  1. Preparar solução de colagenase a 1% por dissolução de 5 mg de colagenase (tipo I), em 5 ml de livre M199-soro.
  2. Preparar solução de tripsina a 0,01% por dissolução de 0,01 g de tripsina em 10 ml de PBS-EDTA a 0,3%.
  3. Preparar a solução de inibidor de tripsina a 0,1% por dissolução de 2 mg de inibidor da tripsina de soja em 20 ml de livre M199-soro.
  4. Preparar a solução de ADNase por dissolução de 20 ul de ADNase I 134 U / ml em 4 ml de solução de inibidor de tripsina.
  5. Preparar a solução de EGTA (1,2 M) por dissolução de 22,8 mg de EGTA em 40 ml de NaCl 155 mM. Ajustar o pH para 7,4. Continuar a um volume final de 50 ml.
  6. Preparar a solução de HEPES (20 mM) por dissolução de 238 mg de HEPES em 50 ml de NaCl 155 mM.
  7. Preparar a solução de alginato a 1,2% por dissolução de 1,2g de alginato de sódio em 100 ml de solução HEPES. Autoclave a solução de alginato.
  8. Preparar a solução de cálcio (102 mM) dissolvendo 750 mg de CaCl 2 em 50 ml de solução HEPES, ajustar o pH a 7,4

3. célula primária Cultura e alginato Encapsulation

  1. Dentro de uma câmara de fluxo laminar, colocar o tecido de tumor em 35 milímetros uma placa de Petri contendo aproximadamente 20 ml de PBS Ca 2+ e Mg 2+ livre, pH 7,4 (PBS *).
  2. Tome o tecido com uma pinça cirúrgica e colocá-lo em outra placa de Petri contendo PBS fresco *, lavar cuidadosamente o tecido. Repita este passo até que as células vermelhas do sangue e detritos são removidos.
  3. Usando uma pinça cirúrgica, segure o tecido adenoma pituitário, e com uma pequena tesoura cirúrgica, cortá-la em pedaços pequenos. Com uma pipeta de Pasteur com bordas arredondadas, transferir os fragmentos de tecido e o PBS * para um tubo de 15 ml, de centrifugação a 68 xg durante 10 min à temperatura ambiente.
    Nota: Para arredondar as bordas de um Pasteurpipeta, chama ligeiramente a ponta da pipeta em um bico de Bunsen.
  4. Remover o PBS * usando uma pipeta de Pasteur e adicionar 3-5 mL da solução de colagenase (cerca de 5 ml para 65 milímetros de tecido 3), misturar duas a três vezes através da inversão. Incubar o tecido na colagenase durante 30 minutos a 37 ° C em rotação constante.
  5. Centrifuga-se o tubo a 68 x g durante 10 min à temperatura ambiente e remover a colagenase, com uma pipeta de Pasteur.
  6. Adicionar 5 ml de DNase e misturar duas a três vezes por inversão, depois centrifugar o tubo a 68 x g durante 10 min à TA.
    Nota: Se o tecido não é completamente dissociada, executar uma segunda digestão enzimática com tripsina durante 3 min a 37 ° C. Parar a digestão através da adição de 2 volumes de solução de inibidor de tripsina.
  7. Aspirar o sobrenadante com uma pipeta Pasteur e descartar. Re-suspender o sedimento em 1 volume de solução de EGTA e misturar-se com 2 volumes de solução de alginato.
  8. Misture suavemente a suspensão de células e alginatopipetando com uma pipeta de Pasteur. Dê uma seringa estéril com uma agulha G 21, retire o êmbolo; usar uma pipeta para carregar a seringa com a solução de alginato e de células.
  9. Suavemente inserir o êmbolo para dentro da seringa e dispensar cuidadosamente gota-a-gota a solução de células de alginato em um copo de vidro contendo cerca de 30 ml da solução rica em cálcio.
  10. Coloque a agulha da seringa de cerca de 5 cm acima da solução de CaCl 2. Os géis de alginato de suspensão de células em contacto com o CaCl2 para formar grânulos esféricos. Manter as drageias de alginato de cálcio na solução durante 5 minutos.
    Nota: Misture o copo de vidro em que as contas são descartados. Mova-se lentamente com a mão em movimentos circulares, para evitar que grudem uns aos outros.
  11. Remova cuidadosamente a solução de cálcio com uma pipeta Pasteur, e lavar as contas duas vezes com 3-5 ml de M199 enriquecido com 20% de FBS.
  12. Transferir as drageias de alginato em uma cultura de tecidos T25 regularesflask usando uma espátula estéril, adicionar 4-5 mL de M199 enriquecido com 20% de FBS e incubou-se a 37 ° C numa incubadora humidificada com 5% de CO 2. Mudar o meio de cultura a cada terceiro dia.

4. Libere células a partir do alginato

Nota: Antes de libertar as células a partir das pérolas de alginato, revestimento lamelas 13 mm de diâmetro com poli-D-lisina.

CUIDADO: SULPHURIC ACID é um ácido altamente corrosivos, e APTS PODE CAUSAR IRRITAÇÃO NOS OLHOS E PELE. Use luvas de látex para lidar com esses reagentes.

  1. Numa hotte, com uma pinça ponto de imergir as lamelas numa placa de Petri de vidro contendo ácido sulfúrico aquoso a 20% durante 1 h à TA.
  2. Decanta-se o ácido sulfúrico, e lava-se as lamelas cinco vezes com água destilada durante 5 minutos cada. Usando um lugar ponto de pinça as lamelas limpos em uma placa de petri contendo NaOH 0,1 M durante 5 min a RT 15.
  3. Decantar o NaOH e lavar uma vez com destilarágua levou, aspirar a água e seque as lamelas.
  4. Usar uma micropipeta para revestir as lamelas com APTS (aminopropil-trietoxissilano) durante 4 min (use 500 ul durante 6 lamelas) inundar o prato de Petri com água destilada. aspirar rapidamente a água e continuar a lavar com água destilada, movendo-se as lamelas com uma pinça de ponto para permitir que a água penetre por baixo.
  5. Aspirar a água e seque as lamelas, usando um lugar ponto de pinça as lamelas em um prato limpo Petri e esterilizá-los dentro do microondas durante 3 vezes, 45 segundos cada. Adicionar 1000 mL de água estéril para 100 ug de poli-D-lisina (0,1 mg / ml).
  6. Incubam-se as lamelas com aproximadamente 50 ul de poli-D-lisina durante 5 min à TA. Aspirar o poli-D-lisina completamente.
    Nota: Isto é importante porque solúvel poli-D-lisina em meio de cultura pode inibir a proliferação celular.
  7. Lavar as lamelas cinco vezes com água estéril durante 5 minutos cada. Aspirar o stágua e deixe erile lamelas para secar dentro de uma câmara de fluxo laminar.
  8. Para analisar o citoesqueleto de actina, libertar as células de pituitária do alginato. Tomar algumas das drageias de alginato a partir do frasco de cultura utilizando uma ponta de pipeta de 1 ml e coloca-os em um tubo de 15 ml.
  9. Adicionar 5 ml de citrato de sódio 55 mM (dissolver-se 323,6 mg de Na 3 C 6 H 5 O 7, 2 H2O em 20 ml de solução HEPES) e centrifugação a 68 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante e descartar.
  10. Re-suspender o sedimento em 1 ml de M199 quente enriquecido com 20% FSB; misturar suavemente a suspensão de células com uma pipeta de Pasteur.
    CUIDADO: phalloidin E DAPI são tóxicos. Utilize luvas para manusear estes reagentes.
  11. Para contar as células, transferir 125 ul de 0,4% solução de azul de Trypan a um tubo de 1,5 ml. Adicionar 75 ul de M199 e 50 ul da suspensão de células obtida na última etapa (factor de diluição = 5). Homogeneizar.
  12. Use uma ponta de micropipeta para place cerca de 10 uL da suspensão de células com azul de Tripano na câmara de hemocitómetro.
  13. Contar as células no contador hemocitómetro utilizando um microscópio invertido com iluminação de contraste de fase. Contagem de todas as células, na praça central 1 mm e quatro esquinas 1 mm. Obter a densidade de células por mililitro multiplicando a contagem média por metro quadrado por o factor de diluição, -. 10 4 Por exemplo, se as contagens médias por quadrados é de 45 células x 5 x 104 = 2,25 x 106 células / ml.
    Nota: Contar as células em dez praças da câmara de hemocitômetro. Não conte células que tocam na linha do meio em lados direito e inferior.
  14. Semente 35.000 células em lamelas de vidro de 13 mm de diâmetro cobertos com poli-D-lisina.

5. citoesqueleto de actina Arranjo

  1. Após 48 h em cultura, remover o meio de cultura com uma pipeta de Pasteur e adicionar rapidamente 500 ul por lamela de PBS, imediatamente remover o PBS.
  2. Corrigir e permeabilizar tele células com 500 ul por lamela de tampão de fixação (0,1 M Pipes, pH 6,75, 4% de PEG-6000, EGTA 1 mM, MgSO 1 mM de 4, 0,5% de Triton X-100 e 2% de formaldeído) durante 10 min a 37 ° C
  3. Remover o tampão de fixação e adicionar 500 ul por lamela de 3,5% de paraformaldeído em PBS durante 30 min à TA. Remover a solução de paraformaldeído.
  4. Lavam-se as lamelas três vezes por adição de 500 ul por lamela de PBS durante 5 min cada. Lavar as lamelas à temperatura ambiente, com agitação constante.
  5. Incubam-se as células com cloreto de amónio a 50 mM durante 10 min, aspirar a solução de cloreto de amónio e repetir o passo 5.4.
  6. Incubam-se as células com 1% de BSA (IgG-livre, livre-proteases) em PBS durante 30 min, remover a solução de BSA e repetir o passo 5.4.
  7. Incubar as células com 50 mM de phalloidin rodamina conjugada de 7 min a RT, repita o passo 5.4.
  8. Incubam-se as células com 255 ^ M de DAPI diluído em PBS durante 5 min à temperatura ambiente, repita a etapa 5.4. Finalmente montar tele lamelas com um meio de montagem e selá-los com unha polonês.
  9. Adquirir imagens dos acordos de actina do citoesqueleto, utilizando um microscópio confocal de varrimento laser com um objetivo 63X, em 541 nm de comprimento de onda de excitação.

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Resultados

Este protocolo foi aplicado com sucesso na cultura e a manutenção de células de adenoma pituitário em drageias de alginato para diferentes períodos de tempo, A Figura 1 mostra células incorporados em drageias de alginato depois de três meses.; estas células exibem formas arredondadas bi-refracção sob um microscópio de luz invertida (Figura 1). A Figura 2 mostra a localização de N-caderina em células de adenoma pituitária de rato embebido...

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Discussão

Este protocolo tem várias etapas críticas. A primeira é a homogeneidade do grânulo de tamanho, o que é necessário para manter as mesmas condições de difusão de nutrientes e gases em toda a cultura de células. Na nossa experiência, a utilização de uma agulha de 21 G para fazer as esferas de alginato permite a aquisição de uma cultura eficiente de tamanho uniforme do grânulo. O segundo factor importante é a distância a partir da agulha; esta distância deve ser superior a 5 cm da solução de cálcio para evitar pérolas defor...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Agradecemos ao Sr. O. Rios por sua assistência técnica.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Reagente 
199 meio de cultura Invitrogen 31100-027Para a cultura, aqueça em um 37 &graus; C banho-maria antes de usar 
Soro fetal bovinoPAAA15-751
Bicarbonato de sódio (NaHCO3)Merck106329
N-(2-Hidroxietil) piperazina-N&agudo;-2ácido etanossulfônico (HEPES)Sigma H-4034
Penicilina/EstreptomicinaPAAP11-010
PBS (Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco)Invitrogen 21600-044
Colagenase tipo IWorthington4176
Tripsina Invitrogen 27250-018
Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)Research Organics3002E
Inibidor de tripsina de Sorbean Invitrogen 17075-029
DNAseWorthington2139
Ácido algínico, de Macrocystis Pyrifera (Kelp)Sigma A-2158
Cloreto de cálcio (CaCl2)J.T. Baker1332
Citrato de sódio (Na3C6H5O7)J.T. Baker3646
Piparazina-N,N′-bis(ácido 2-etanossulfônico) (PIPES)Research Organics9624P
Polietilenoglicol 6000 (PEG 6000)Calbioquímico528877
Etileno ácido glicol tetracético (EGTA)Research Organics9574E
Sulfato de magnésio (MgSO4)J.T. Baker2500
Triton-X 100SigmaX100
FormaldeídoJ.T. Baker2106
ParaformaldeídoSigmaP6148
Cloreto de amônio (NH4Cl)J.T. Baker660
BSA Albumina de Soro Bovino Livre de IgGJackson Immuno Research001-000-161
Faloidina– Isotiocianato de tetrametilrodamina BSigmaP1951tóxico. Use luvas para manusear este reagente 
4',6-Diamidino-2-Fenilindo, Dicloridrato (DAPI)Invitrogen D1306Tóxico. Use luvas para manusear este reagente 
Ácido sulfúrico (H2SO4)J.T. Baker9681Altamente corrosivo. Use luvas para manusear este reagente 
Hidróxido de sódio (NAOH)Merck1.06498Pode causar irritação nos olhos e na pele. Use luvas para manusear este reagente 
(3-Aminopropil)trietoxissilano (APTS)SigmaA-3648
Bromidrato de poli-D-lisinaSigmaP7280
Solução azul de tripanoSigmaT8154 
Nome    Company  Número do catálogo  Comentários
Equipamento  Tóxico: Pode causar câncer. Use luvas para manusear este reagente 
Rotador Modelo 230300da Boekel Scientific
DuPont Corporation Modelo sorvall TC6
shaker Instrumentos de linha de laboratórioModelo 314-820 
Centrífuga

Referências

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