Apresenta-se um protocolo para obter matrizes derivadas de células ricas em proteínas da matriz extracelular, utilizando Crowders macromoleculares (MMC). Além disso, apresentamos um protocolo que incorpora MMC na geração de co-cultura de pele organot�ica 3D, o que reduz o tempo de cultura, mantendo a maturidade da construção.
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Neste artigo
Resumo
Resumo
A família das glicoproteínas de colágenos representa as principais proteínas estruturais do corpo humano, e são componentes essenciais de biomateriais utilizados em engenharia de tecidos modernos. Um gargalo técnica é a deposição de colagénio in vitro, como é notoriamente lenta, resultando numa sub-óptima formação de tecido conjuntivo e subsequente coesão tecido, particularmente em modelos de pele. Aqui, nós descrevemos um método que envolve a adição de co-polímeros de sacarose diferencialmente porte a culturas de pele para gerar macromolecular aglomerando (MMC), o que resulta num aumento dramático da deposição de colagénio. Particularmente, os fibroblastos dérmicos depositada uma quantidade significativa de colagénio I / IV / VII e fibronectina sob MMC em comparação com os controlos.
O protocolo também descreve um método para decellularize camadas de células aglomeradas, expondo quantidades significativas de matriz extracelular (ECM), que foram retidas na superfície da cultura como evidenciado por immunocyimuno. Total de padrão de massa de matriz e distribuição foi estudada usando microscopia de interferência reflexão. matrizes Curiosamente, f ibroblastos, queratinócitos e co-culturas produzidas derivadas de células (CDM) de composição variada e morfologia. MDL podem ser usados como "bio-andaimes para" semear célula secundária, em que a utilização actual de revestimentos ou andaimes, tipicamente a partir de fontes animais xenogénicas, pode ser evitado, movendo-se assim, para aplicações mais clinicamente relevante.
Além disso, este protocolo descreve a aplicação de MMC durante a fase submersa de um modelo 3D-organotípicas pele de co-cultura que foi suficiente para aumentar a deposição de ECM na junção dermo-epidérmica (JDE), em particular, colagénio VII, o componente principal das fibrilas de ancoragem. A microscopia eletrônica confirmou a presença das fibrilas de ancoragem em culturas desenvolvidas com MMC, em comparação aos controles. Isto é significativo como fibrilas de ancoragem amarrar da derme para a epiderme, daí,tendo um pré-formado madura JDE podem beneficiar receptores de enxertos de pele em termos de estabilidade do enxerto e da cura de feridas em geral. Além disso, o tempo de cultura foi condensado a partir de 5 semanas a 3 semanas para obter uma construção madura, quando se utiliza MMC, reduzindo os custos.
Introdução
A pele constitui uma barreira de protecção, impedindo a perda de água e entrada de agentes patogénicos. Ele é constituído por três componentes principais; derme ricos do estroma 1, uma epiderme estratificada 2,3,4 em cima dela, e a junção dermo-epidérmica entre 5,6. A derme é composta em grande parte de colágeno e fibras elásticas e é pouco povoada com fibroblastos 7. Em contraste, a epiderme rica de células é constituída por várias camadas de queratinócitos. Os queratinócitos da camada mais interior são proliferativa e fornecer novas células basais que renovam e substituir os queratinócitos terminalmente diferenciados que ....
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Protocolo
1. Macromolecular Crowding em 2D culturas de células da pele
- 50.000 células de sementeira (fibroblastos primários ou queratinócitos primários ou co-cultura de fibroblastos e queratinócitos primários) por poço de uma placa de 24 poços. Semear as células em 1 ml de meio de crescimento tipo de célula correspondente.
- Permitir que as células a aderir durante a noite, numa incubadora a 37 ° C em 5% de CO 2.
- Descartar a velha mídia e substituir com 1 ml de meio fresco contendo Crowders macromoleculares e ácido ascórbico 100? M. Use de um cocktail consistindo Crowder de 37,5 mg / ml de Ficoll 70 e 25 mg / ml de Ficoll meios 400. Util....
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Resultados
Aglomeração macromolecular foi capaz de aumentar a deposição de ECM, em particular, fibroblastos depositado mais colagénio I, IV e fibronectina, em comparação com culturas de controlo (Figura 1, camada celular; 1A, colagénio I; 1B, colagénio IV; 1C, fibronectina). Após a descelularização, era evidente que os fibroblastos eram os principais depositantes de colagénio I, IV e fibronectina, em comparação com os queratinócito.......
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Discussão
A matriz extracelular aprimorada é obtida após a introdução de aglomeradores macromoleculares na cultura de células, devido ao efeito de volume excluído que aumenta a clivagem do propeptídeo pelas proteinases. Isso resulta em matriz extracelular, em particular colágeno, a ser processada mais rapidamente e depositada na superfície da cultura. Enquanto outros grupos obtiveram camadas espessas de células de fibroblastos, isso envolveu um tempo de cultura de várias semanas20. Em contraste, o MMC descrito neste Pro.......
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Divulgações
Os autores não têm interesses conflitantes a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Conselho de Pesquisa Biomédica, Cingapura, por meio do apoio básico ao Instituto de Biologia Médica e da concessão SPF2013/005. M.R. foi apoiado por uma bolsa do Comitê de Pesquisa do Corpo Docente da NUS (Engenharia em Medicina) (M.R.) R-397-000-081-112 e o Programa de Engenharia de Tecidos da NUS (NUSTEP). Os autores gostariam de agradecer à professora Irene Leigh por fornecer o anticorpo colágeno VII. O trabalho de microscopia eletrônica foi realizado na Unidade de Microscopia Eletrônica da Universidade Nacional de Cingapura.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Ácido ascórbico | Wako | 013-12061 | Aditivo de mídia de cultura de |
| células Inserções de cultura de células (formato de 6 poços) | Greiner Bio-One | 657610 | Culturas organotípicas |
| Solução de citrato | Dako | S2369 | DakoSolução de recuperação de alvo de citomação Citrato, pH 6 (x10) |
| Colágeno (cauda de rato) | Corning | 354236 | Culturas organotípicas |
| CnT-57 | CELLnTEC | CnT-57 Meios de | cultura de células |
| DAB Substrato + kit de cromogênio | Dako | K3468 | Histologia |
| Placa de poço profundo (formato de 6 poços) | Corning | 355467 | Culturas organotípicas |
| Reagente de detecção ECL | GE Healthcare Life Sciences | RPN2106 | Amersham ECL Western Blotting Detection Reagent |
| Microscópio eletrônico (TEM) | JEOL | JEM-1010 (100kV) | Microscopia eletrônica de transmissão |
| Meios de fibroblastos (FM) | Alta glicose-DMEM + 10% de soro bovino fetal + 1% de estreptomicina penicilina | ||
| Ficoll PM70 | GE Healthcare Life Sciences | 17-0310-05 | Crowder macromolecular |
| Ficoll PM400 | GE Healthcare Life Sciences | 17-0300-05 | Crowder macromolecular |
| Meios sem soro de queratinócitos (KSFM) | Life Technologies | 17005-042 | Meio de cultura celular |
| Tampão de lise | ThermoFisher Scientific | 89900 | Tampão de lise para extração de proteínas. Um inibidor de protease (Roche, # 11836170001) foi adicionado a este tampão de lise. |
| Microscópio | Zeiss | LSM510 | Canais vermelhos, verdes e azuis para visualizar imunocolorações fluorescentes AF594, AF488 e DAPI (40X mag). |
| Mídia de montagem (Hydromount) | National Diagnostics | HS-106 | Coloração fluorescente |
| Mídia de montagem (Cytoseal) | ThermoFisher Scientific | 8310-16 | Histologia (HRP) |
| Composto OCT (Tissue Tek) | Sakura | 4583 | Incorporação para criotomia |
| Antibióticos penicilina-estreptomicina | Sigma Aldrich | A5955 | Aditivo de mídia de cultura celular |
| Anticorpos primários | |||
| Anti-Colágeno I anticorpo | Abcam | #ab6308 | |
| Anti-Colágeno Tipo IV | Novocastra | #NCL-COLL-IV | |
| Anti-colágeno VII | LH7.2 (in house) | ||
| Anticorpo anti-fibronectina | Abcam | #ab2413 | |
| Agente redutor | ThermoFisher Scientific | NP0009 | Western blot |
| Tampão de amostra | ThermoFisher Scientific | NP0008 | Western blot |
| Anticorpos secundários (imunocoloração) | |||
| 4′,6-Diamidino-2-fenilindol dicloridrato (DAPI) | Sigma Aldrich | #D9542 | |
| AlexaFluor 594 cabra-anti-coelho | ThermoFisher Científico | #A-11037 | |
| AlexaFluor 594 cabra-anti-rato | ThermoFisher Scientific | #A-11005 | |
| AlexaFluor 488 galinha-anti-coelho | ThermoFisher Scientific | #A-21441 | |
| AlexaFluor 488 cabra-anti-rato | ThermoFisher Scientific | #A-11001 | |
| Anticorpos secundários (HRP) | Dako | Envision + System - Polímero Marcado com HRP Anti-Coelho e Anti-Rato | |
| desoxicolato de sódio | Prodotti Chimicie Alimentari | Descelularização | |
| Meios de estratificação | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Usado durante a interface ar-líquido de culturas organotípicas. Este meio é adicionado à parte externa do inserto de cultura de células. | ||
| Presunto' s F12 | Usado durante a interface ar-líquido de culturas organotípicas. Este meio é adicionado à parte externa do inserto de cultura de células. | ||
| 10% soro fetal bovino | Usado durante a interface ar-líquido de culturas organotípicas. Este meio é adicionado à parte externa do inserto de cultura de células. | ||
| 100 U/ml de penicilina e 100 U/ml de estreptomicina | Usado durante a interface ar-líquido de culturas organotípicas. Este meio é adicionado à parte externa do inserto de cultura de células. | ||
| 0,4 mg/ml de hidrocortisona | Usado durante a interface ar-líquido de culturas organotípicas. Este meio é adicionado à parte externa do inserto de cultura de células. | ||
| 5 mg/ml de insulina | Utilizada durante a interface ar-líquido de culturas organotípicas. Este meio é adicionado à parte externa do inserto de cultura de células. | ||
| 1,8&meio do ponto; 10-4 M adenina | Usado durante a interface ar-líquido de culturas organotípicas. Este meio é adicionado à parte externa do inserto de cultura de células. | ||
| 5 mg/ml de transferrina | Utilizado durante a interface ar-líquido de culturas organotípicas. Este meio é adicionado à parte externa do inserto de cultura de células. | ||
| 2· 10- 11 M triiodotironina | Usado durante a interface ar-líquido de culturas organotípicas. Este meio é adicionado à parte externa do inserto de cultura de células. | ||
| Trypsin | Biopolis | 0.125% Trypsin/Versene pH 7,0 + 0,3 | Usado para tripsinizar células |
Referências
- Breitkreutz, D., Mirancea, N., Nischt, R. Basement membranes in skin: unique structures with diverse functions. Histochem Cell Biol. 132 (1), 1-10 (2009).
- Lane, E. B., et al. mutation in the conserved helix termination peptide of keratin 5 in ....
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Reimpressões e permissões
