Este protocolo descreve o fabrico de uma grande escala, o ADN ou o anticorpo matriz bidimensional multiplexado, com aplicações potenciais em estudos de sinalização de células e detecção de biomarcador.
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Artigo de método
Flow-padrão Fabrication guiada de alta densidade Barcode Antibody Microarray
Neste artigo
Resumo
Resumo
O microarray de anticorpos como uma tecnologia bem desenvolvida é atualmente desafiado por algumas outras tecnologias de alto rendimento estabelecidas ou emergentes. Neste relatório, renovamos a tecnologia de microarray de anticorpos usando uma nova abordagem de fabricação e introduzindo novos recursos. A fabricação de nosso microarray de anticorpos de alta densidade é realizada por meio de padrões de fluxo perpendicularmente orientados de DNAs de fita simples e subsequente conversão mediada por conjugados de DNA-anticorpo. Este protocolo descreve as etapas críticas na padronização de fluxo do DNA, produzindo e purificando conjugados DNA-anticorpo e avaliando a qualidade do microarray fabricado. A uniformidade e a sensibilidade são comparáveis com os microarrays convencionais, quando nossa fabricação do microarray não exigir o auxílio de uma impressora da disposição e puder ser executada na maioria de laboratórios de pesquisa. A outra grande vantagem é que o tamanho de nossas unidades de microarray é 10 vezes menor do que o das matrizes impressas, oferecendo a capacidade única de analisar proteínas funcionais de células únicas ao fazer interface com designs genéricos de microchips. Essa tecnologia de código de barras pode ser amplamente empregada na detecção de biomarcadores, estudos de sinalização celular, engenharia de tecidos e uma variedade de aplicações clínicas.
Introdução
Os microarrays de anticorpos têm sido amplamente usados em estudos de proteómica durante décadas para examinar a presença de proteínas-alvo, incluindo os biomarcadores da proteína 1-3. Embora esse campo está actualmente a enfrentar grandes desafios de outros tecnologias de alta capacidade, tais como espectrometria de massa (MS), ainda há muito espaço para o utilitário de microarrays de anticorpos, principalmente porque estes dispositivos proporcionam interpretação de dados simples e fácil de interface com outros ensaios. Nos últimos anos, a integração de microarrays para andaimes microchip forneceu o microarray anticorpo uma nova oportunidade para prospe....
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Protocolo
Atenção: Vários produtos químicos utilizados neste protocolo são irritantes e são perigosos em caso de contacto com a pele. Consultar fichas de dados de segurança de materiais (MSDS) e usar equipamento de proteção pessoal adequado antes de executar esse protocolo. A solução piranha utilizado no Passo (1.1.1) é altamente corrosivo e deve ser preparada por adição do peróxido lentamente ao ácido com agitação. Lidar com esta solução com extrema cautela em um exaustor. Use proteção para os olhos adequada e luvas resistentes aos ácidos. Trimetilclorosilano (TMCS) é um produto químico corrosivo, inflamável usado em uma etapa opcional, depois (1.1.6). Lidar com este produto ....
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Resultados
Os desenhos para as PDMS moldes (Figura 1A-1B) foram elaboradas usando um programa CAD (AutoCAD). Dois projetos mostrados os canais de recursos para padrões de fluxo, um horizontal e um vertical. As partes esquerda e direita de cada projeto são simétricos; qualquer um deles poderia ser entradas ou saídas. Cada um dos 20 canais é de enrolamento a partir de uma extremidade até à outra extremidade. Cada design é impresso em um photomask cromo (Figura 1C). A.......
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Discussão
Padrão de fluxo de concepção é o primeiro passo crítico na fabricação da micromatriz 2-D. Para gerar dois padrões de ADN que se sobrepõem sobre um substrato de vidro, as características do canal do primeiro design deve ser perpendicular às da segunda (Figura 1A-B). Os projetos também considerar as aplicações a jusante do microarray. No caso de análise de uma única célula, o micro-arranjo é utilizado para detectar proteínas a partir de células individuais e fechadas em microcâmaras, por consegui.......
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Divulgações
Os autores não têm interesses conflitantes a divulgar.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer o fundo inicial da SUNY Albany e o acesso às instalações do Centro de Pesquisa do Câncer da Universidade de Albany.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Base de elastômero de silicone Sylgard 184 | Dow Corning | 3097366-1004 | |
| Agente de cura de elastômero de silicone Sylgard 184 Dow | Corning | 3097358-1004 | |
| SU-8 2025 fotorresistente | MicroChem | Y111069 | |
| Bolachas de silício | Wafers Universitários | 452 | |
| Lâminas de vidro revestidas com poli-L-lisina | Thermo Scientific | C40-5257-M20 | |
| Oligonucleotídeos | Integrated DNA Technologies | *Encomendado sob medida da Integrated DNA Technologies, consulte Tabela 2. | |
| Solução de estoque de adesivo de poli-L-lisina | Newcomer Supply | 1339 | |
| Bis (sulfosuccinimidil) suberado (BS3) | Thermo Scientific | 21585 | |
| 1x Fosfato tamponado salino, pH 7.4 | Qualidade Biológica | 114-058-101 | |
| Ä Sistema de Cromatografia Líquida de Proteína Rápida (FPLC) kta Explorer 100 | GE (Amersham Pharmacia) | 18-1112-41 | |
| Coluna Superose 6 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17-5172-01 | |
| Anticorpos de captura | vários | *A seleção de anticorpos depende da aplicação | |
| Succinimidil-6-hidrazino-nicotinamida (S-HyNic) | Solulink | S-1002 | |
| Succinimidil-4-formilbenzamida (S-4FB) | Solulink | S-1004 | |
| N,N-dimetilformamida | Sigma-Aldrich | 227056 | |
| Ácido cítrico, anidro | Hidróxido | ||
| de sódio | Fisher Scientific | S318 | |
| Amicon Ultra filtro de rotação 10 kDa MWCO | EMD Millipore | UFC201024 | |
| Revestidor de rotação | Laurell Technologies | WS-650-MZ | |
| Punção de biópsia com êmbolo (1,0 mm de diâmetro) | Ted Pella, Inc. | 15110-10 | |
| Escriba do diamante (estilo 60) | SPI fornece | 6004 | |
| Sigma Aldrich | 92361 | de Trimethylchlorosilane |
Referências
- Alhamdani, M. S. S., Schroder, C., Hoheisel, J. D. Oncoproteomic profiling with antibody microarrays. Genome Med. 1 (7), (2009).
- Angenendt, P. Progress in protein and antibody microarray technology. Drug Discov Today. 10 (7), 503-511 (2005).
- Sun, H. Y., Chen, G. Y. J., Ya....
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Reimpressões e permissões
