Modelagem quimioterapia leucemia resistente In Vitro

Resumo

O presente relatório resume um protocolo que pode ser utilizado para modelar a influência do nicho do microambiente da medula óssea nas células leucêmicas, com ênfase no enriquecimento da subpopulação mais quimiorresistente.

Resumo

Está bem estabelecido que o microambiente da medula óssea fornece um local único de santuário para doenças hematopoiéticas que iniciam e progridem neste local. O modelo apresentado no presente relatório utiliza células estromais primárias da medula óssea humana e osteoblastos como dois tipos de células representativas do nicho da medula que influenciam o fenótipo das células tumorais. As condições de co-cultura in vitro descritas para células leucêmicas humanas com esses componentes primários de nicho suportam a geração de uma subpopulação quimiorresistente de células tumorais que podem ser eficientemente recuperadas da cultura para análise por diversas técnicas. Um cronograma de alimentação rigoroso para evitar fluxos de nutrientes seguidos pela recuperação de partículas de dextrana reticulada (G10) tipo 10 da população de células tumorais que migraram sob as células estromais da medula óssea aderente (BMSC) ou osteoblastos (OB) gerando uma população de células tumorais de "fase fraca" (PD), fornece uma fonte consistente de células leucêmicas resistentes à terapia purificada. Essa população clinicamente relevante de células tumorais pode ser avaliada por métodos padrão para investigar vias regulatórias apoptóticas, metabólicas e do ciclo celular, bem como fornecer um alvo mais rigoroso para testar novas estratégias terapêuticas antes de investigações pré-clínicas direcionadas à doença residual mínima.

Introdução

O objetivo geral do método descrito é fornecer uma abordagem in vitro eficiente e econômica que apoie a investigação dos mecanismos subjacentes à sobrevivência de células leucêmicas suportadas pela medula óssea durante a exposição à quimioterapia. Está bem documentado que as células tumorais residuais sobreviventes que persistem após o tratamento contribuem para a recidiva da doença que muitas vezes é mais agressiva do que no diagnóstico e muitas vezes é tratada de forma menos eficaz^1-8. Modelos que incluem células leucêmicas isoladamente, como aqueles limitados à cultura de células apenas em meios, para testes de abordagens terapêuticas, não levam em consideração esses sinais críticos ou a heterogeneidade da doença que ocorre em resposta à disponibilidade de pistas derivadas de nicho nas quais subpopulações de células tumorais com interações muito específicas com células de nicho obtêm proteção aprimorada. Modelos de co-cultura 2D padrão que co-cultivam células estromais derivadas da medula óssea e células leucêmicas abordaram um pouco a contribuição do nicho da medula óssea e mostraram que a interação com as células do microambiente da medula óssea aumenta sua resistência à quimioterapia e altera suas características^{de crescimento 9-14}. Esses modelos, no entanto, muitas vezes não conseguem recapitular a sobrevida a longo prazo das células tumorais e não informam com precisão os resultados associados às populações de células leucêmicas mais resistentes que contribuem para a DRM. Os modelos in vivo permanecem críticos e definem o "padrão ouro" para a investigação de terapias inovadoras antes dos ensaios clínicos, mas muitas vezes são desafiados pelo tempo e custo necessários para testar hipóteses relacionadas a tumores resistentes e recidiva da doença. Como tal, o desenvolvimento de modelos 2D mais informativos seria benéfico para as investigações piloto para melhor informar o projeto do projeto pré-clínico subsequente baseado em murinos.

O modelo 2D in vitro apresentado neste relatório carece da complexidade do verdadeiro microambiente in vivo, mas fornece um meio econômico e reprodutível para interrogar as interações do tumor com o microambiente que se presta especificamente ao enriquecimento da subpopulação quimiorresistente de células tumorais. Essa distinção é valiosa, pois a avaliação de toda a população de células tumorais pode mascarar o fenótipo de um grupo menor de células tumorais resistentes à terapia que compreendem o alvo mais importante. Uma vantagem adicional é a escalabilidade do modelo para se adequar à análise de interesse. As culturas em massa podem ser estabelecidas para as análises que requerem recuperação significativa de células tumorais, enquanto as coculturas em pequena escala em placas de vários poços podem ser utilizadas para análises baseadas em PCR ou avaliações baseadas em microscopia.

Com base nessa necessidade, desenvolvemos um modelo in vitro para abordar a heterogeneidade da doença que é característica da leucemia linfoblástica aguda (LLA) da linhagem B. Demonstramos que as células LLA, que compartilham muitas características em comum com suas contrapartes saudáveis, localizam-se em compartimentos distintos de co-cultura de BMSC ou OB. São geradas três populações de células tumorais que possuem fenótipos distintos que são valiosos para a investigação da resposta terapêutica. Especificamente, demonstramos que as células (LLA) recuperadas da população de "fase dim" (PD) da co-cultura são consistentemente refratárias à terapia com sobrevida que se aproxima das células tumorais que não foram expostas a agentes citotóxicos. Essas células LLA, de linhagens celulares estabelecidas ou amostras primárias de pacientes, migram sob células estromais aderentes ou camadas de osteoblastos, mas podem ser capturadas após tripsinização de culturas e separação de tipos de células pela utilização de colunas de partículas de dextrana reticulada tipo 10 (G10)¹⁵.

Aqui apresentamos uma configuração de uma co-cultura 2D que pode ser empregada para modelar interações entre células estromais do microambiente da medula óssea (BMSC/OB) e células leucêmicas. De particular importância é a observação de que as células leucêmicas formam três subpopulações espaciais em relação à monocamada de células estromais e que a população de DP representa uma população tumoral resistente à quimioterapia devido à sua interação com o BMSC ou OB. Além disso, demonstramos como isolar efetivamente as populações de células leucêmicas por colunas G10. É importante observar que descobrimos que o isolamento dessas subpopulações permite a análise a jusante da população de DP mais resistente para determinar os modos potenciais de resistência que são conferidos a essas células devido à sua interação com as células estromais ou osteoblastos do microambiente da medula óssea. As técnicas que utilizamos a jusante desse modelo de co-cultura e isolamento incluem avaliação de citometria de fluxo, análise proteômica e avaliação de expressão de proteína direcionada, bem como ionização por eletrospray de ablação a laser (LAESI) desenvolvida mais recentemente e análise de cavalos-marinhos para avaliar perfis metabólicos. Através do uso deste modelo em combinação com as técnicas acima, descobrimos que a população de células leucêmicas com DP tem um fenótipo resistente à quimioterapia que é único quando comparado às células leucêmicas cultivadas apenas em meio ou aquelas recuperadas de outras subpopulações na mesma co-cultura. Como tal, este modelo se presta a uma avaliação mais rigorosa para testar estratégias direcionadas às células leucêmicas mais resistentes à quimioterapia que derivam seu fenótipo resistente por meio da interação com o microambiente da medula óssea.

Protocolo

1. Preparação avançada

1. A preparação de partículas do G10 dextrano.
   1. Prepare G10 pasta por adição de 50 ml de PBS 1X aos 10 partículas g G10. Misturar por inversão e permitir G10 para resolver fora de salina tamponada com fosfato (PBS) a 4 ° CO / N.
   2. No dia da separação coluna G10, aspirado PBS a partir de partículas do G10 assentados e adicionar 50 ml de PBS fresco. Misturar por inversão. Repita duas vezes, adicionando 50 ml PBS fresco às partículas do G10 assentadas e armazenar a 4 ° C até que esteja pronto para uso.
2. A cultura de BMSC e OB.
   1. Manter tanto a BMSC OB ou a 37 ° C em 6% de CO ₂ e cultivadas em placas de cultura de tecidos de 10 cm até 90% de confluência é atingido.
   2. Trypsinize BMSC ou células de OB e dividir 1: 2 para novos cm placas de 10. As células são cultivadas com estas normas até ser necessário para a co-cultura leucémicas.

2. Estabelecer e manter Co-cultura

1. Adicionar 5-20 x 10 ⁶ células leucémicas in 10 ml de tumor meios de cultura específicos para um 80% -90% confluentes BMSC ou placa OB.
   NOTA: O nosso laboratório mantém co-culturas a 37 ° C em 5% de O ₂ para melhor recapitular o microambiente da medula óssea, o que tem sido demonstrado que variam de 1% a 7% ^16-18. No entanto, a manutenção de co-culturas neste tensão de oxigênio não é crítica para o estabelecimento das três subpopulações leucêmicas e fica a critério do laboratório.
2. Cada ^4º dia remover todos, mas 1 ml de mídia (incluindo células leucêmicas em suspensão) e substituir com 9 ml meio de cultura leucêmica fresco. Ao remover 9 ml de mídia da placa, tome cuidado para não perturbar a camada aderente BMSC ou OB.
   1. Remova a mídia pela inclinação placa para o lado e aspirado de mídia no canto da placa. Além disso, quando a adição de meio fresco, não se esqueça de adicionar gota a gota, no canto da placa contra a parede lateral para garantir o mínimo de interrupção da camada aderente BMSC ou OB.
3. Após ^o 12º dia da co-cultura, lavar as células leucêmicas BMSC ou camada OB pipetando meios de cultura de prato cima e para baixo suavemente sobre o prato de aproximadamente 5 a 10 vezes e, em seguida, recolher no tubo de 15 ml. Propagar novamente para nova 80% -90% confluentes BMSC ou placa de OB como descrito na etapa 2.1.
   NOTA: O enxaguamento suave da co-cultura, tal como descrito na etapa 2.3 irá remover as células leucémicas S e PB, sem perturbar a monocamada de BMSC ou OB. Isto permite que apenas as células de tumor a ser transferido para a próxima placa de co-cultura. Este ciclo de 12 dias pode ser repetido tantas vezes quanto necessário, com base nas necessidades do usuário.

3. Preparar Colunas G10 Bead

NOTA: Se a análise a jusante estéril ou cultura é necessária após a separação coluna G10 os seguintes passos devem ser realizados utilizando uma técnica estéril e colunas G10 deve ser configurado em uma capa biológica estéril.

1. Pré-warm meio de cultura celular a 37 ° C em banho de água (~ 30 mL por coluna). Usando uma seringa descartável ml 10, remover e descartar o êmbolo. Adicionar a lã de vidro para seringa.
2. Com uma pinça, puxe a lã de vidro em fios soltos finas. Adicionar várias camadas de lã de vidro ligeiramente embalado para a seringa até 2/3 da seringa é preenchido com lã de vidro.
   NOTA: A lã de vidro é crucial para evitar que partículas soltas do G10 de contaminar a recolha de células leucêmicas. Certifique-se de lã de vidro é embalado o suficiente para suportar as partículas do G10, mas não muito densamente para bloquear o fluxo de mídia através da coluna.
3. Anexar uma torneira de sentido para a ponta de seringa na posição fechada.
4. Braçadeira coluna seringa para anel ficar alto o suficiente para um tubo de 50 ml (tubo de coleta) pode ser colocado debaixo torneira. Coloque tubo de coleta na coluna seringa.
5. Usando a 10 ml pipeta adicionar, gota a gota, partículas do G10 novamente suspensas em PBS para a coluna na parte superior doa lã de vidro. Continue a adição de partículas até um G10 ml sedimento ~ 2 (tal como medido por graduações na seringa) de G10 formas partículas na parte superior da lã de vidro.
6. Equilibrar a coluna G10 com mídia pré-aquecido.
   1. Adicionar 2 ml de meio de pré-aquecida até à coluna. Abra a válvula de torneira lentamente, de modo que a mídia flui para fora da coluna de gota a gota.
   2. Repetir o passo 3.6.1, até um total de 10 ml de meio pré-aquecido ter sido atravessou a coluna.
      NOTA: Se as partículas G10 são vistos no fluxo de passagem no tubo de recolha, ou 1) adicionar mais partículas G10 para manter ~ 2 ml de sedimento para garantir que não há partículas adicionais G10 escapar a partir da coluna ou 2) substituir coluna com um um não utilizada e de repetição passos 3.4-3.6.1.
   3. Depois que os drenos de mídia pré-aquecido a partir da coluna, feche a torneira e descartar tubo de coleta com fluxo através. Adicionar um novo tubo de recolha na coluna. Coluna está pronta para ser carregada com meios + mistura de células.
      NOTA: Colunasdeve ser utilizado imediatamente e não deixa-se secar.

4. Separar 3 subpopulações dentro Co-cultura

1. Coleção de subpopulação de suspensão (S) tumor.
   1. media aspirado de placa co-cultura com pipeta e suavemente voltar a aplicar os mesmos meios para lavar o prato e recolher a mídia contendo células leucêmicas em um tubo de 15 ml. As células leucémicas são recolhidos a subpopulação S.
2. Coleção de subpopulação tumor Fase Bright (PB).
   1. Adicionar 10 ml de mídia fresco de volta para placa co-cultura. Lavar vigorosamente pipetando mídia adicionados cima e para baixo cerca de 5 vezes para remover as células leucêmicas aderentes, mas não forte o suficiente para desalojar aderente BMSC / OB componente.
   2. Aspirar com pipeta e recolher meios de comunicação em um tubo de 15 ml. As células são recolhidas a subpopulação PB.
3. Coleção de subpopulação tumor Fase Dim (PD).
   1. placa de lavagem com 1 ml PBS para remmídia restante ove. Tripsinizar placa de co-cultura com 3 ml de tripsina e o local em 37 ° C incubadora durante 5 min.
   2. Retire a placa para fora da incubadora e bata suavemente os lados da placa para desalojar aderente BMSC / OB.
   3. Adicionar 1 ml de soro fetal de bovino (FBS) e pipeta cima e para baixo 3-5 vezes para quebrar grandes agregados celulares.
   4. Recolhe meios de comunicação com as células num tubo cónico de 15 ml. Estas células são o subpopulação PD não purificado com BMSC / OB bem.
4. Centrifugar 3 isolado subpopulações a 400 xg durante 7 minutos. Aspirar e elimine o sobrenadante em seguida, ressuspender individualmente pelotas em 1 ml de mídia pré-aquecido. As células estão prontas para serem carregadas numa coluna G10.

5. Carregando Co-cultura de células nas G10 Coluna

NOTA: Certifique-se de torneira está completamente fechada antes de adicionar as células de mídia contendo a coluna G10. Além disso, cada subpopulação deve ser executado através de uma coluna G10 separada de modo a não Introducum e qualquer preconceito entre as populações na análise a jusante.

1. Com uma pipeta de 1000 mL, adicione 1 ml de cada uma das subpopulações de células em meios de pré-aquecido a uma coluna G10 separada gota a gota. Certifique-se de que a mídia contendo as células permanece em cima ou dentro de pellet G10. Permitir que as células a incubar em pelete G10 durante 20 min à TA.
   NOTA: Torneira permanece fechado para a duração da incubação.

6. Coleta de células leucêmicas de G10 Coluna

1. Adicionar 1-3 media ml pré-aquecido a cada coluna G10. Abra a válvula de torneira e deixar a mídia para sair lentamente gota a gota a coluna.
   NOTA: É crucial para manter uma taxa de fluxo lento a partir da coluna ou o pellet contendo G10 BMSC / OB pode lavar para fora da coluna e contaminam as células leucémicas isoladas.
2. Continuar a adicionar meios pré-aquecido em pequenos incrementos (1-2 ml) a coluna G10 até um total de 15 a 20 ml foi executado através da coluna e foi recolhido. Fechar a torneira vatubo de recolha de lve e boné.
   NOTA: Se um pellet G10 partícula é visto na parte inferior do tubo de coleta, remover suavemente a mídia do tubo deixando G10 grânulo de partícula imperturbado e transferência para o novo tubo.
3. Centrifugar meios recolhidos a 400 xg durante 7 minutos à TA. Remover o sobrenadante e ressuspender sedimento de células em tampão apropriado para aplicação a jusante.
4. As células são agora uma população pura de células leucêmicas livres de BMSC ou contaminação OB e está pronto para ser aplicado a aplicações a jusante, a critério do usuário.
   NOTA: viabilidade celular de leucemia devem permanecer inalterados ao passar células através de colunas do G10.

Resultados

Configuração bem-sucedida e cultura deste modelo de co-cultura irá resultar no estabelecimento de 3 subpopulações de células leucémicas em relação ao aderente BMSC ou OB monocamada. A Figura 1 mostra como todos as células semeadas em uma monocamada BMSC inicialmente aparece como uma única população de suspenso células leucêmicas. Ao longo de 4 dias as células leucémicas interagem com a BMSC para formar 3 subpopulações de células leucémicas espaciais (suspensa (s), de fas...

Discussão

doença residual mínima (MRD), que contribui para a recidiva da doença continua a ser um grande desafio para o tratamento clínico de refractário agressivo ALL, bem como, uma série de outras doenças malignas hematológicas. O microambiente da medula óssea é o local mais comum de recidiva em ALL ^3,8. Como tal, os modelos que modelam o microambiente da medula óssea são ferramentas vitais para testar hipóteses relacionadas com a sobrevivência das células tumorais leucêmicas e manutenção de MRD durante a exposição q...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Grânulos de sephadex G10	Sigma	G10120	Referido no manuscrito como gel tipo 10 partículas de dextrano reticuladas
Seringa estéril de 10 ml	BD	309604
lã de vidro	Pyrex	3950
torneiras de 1 via	World Precision Instruments, Inc.	14054-10
Tubos de centrífuga cônicos de 50 ml	Médicos	Mundiais 41021039	Usados como tubos de coleta
Tubos de centrífuga cônicos de 15 ml Produtos	Médicos	Mundiais 41021037	Usados para coleta de células
Soro Fetal Bovino	Sigma	F6178
0,05% Tripsina	Mediatech, Inc.	25-053-CI
100 x 20 mm Placas de Cultura de Células	Greiner Bio-One	664160
Meios de cultura
Meios de cultura de osteoblastos	PromoCell	C-27001	Para meios de osteoblastos humanos
RPMI 1640 mídia	Mediatech, Inc.	15-040	Para preparação de mídia tumoral
Linhas celulares
Células aderentes:
Osteoblastos humanos	PromoCell	C-12720	Os osteoblastos humanos foram cultivados de acordo com o fornecedor' s recomendações.
Células estromais de Morrow ósseo humano	WVU Biospecimen Core		Leucemia humana primária não identificada e células estromais da medula óssea (BMSC) foram fornecidas pelo Núcleo de Processamento de Bioespécimes do Mary Babb Randolph Cancer Center (MBRCC) e pelo Banco de Tecidos do Departamento de Patologia da Universidade de West Virginia. As culturas de BMSC foram estabelecidas conforme descrito anteriormente (*)
Células leucêmicas:
REH	ATCC	ATCC-CRL-8286	As células REH foram cultivadas de acordo com o fornecedor' s recomendações e mídia recomendada.
SD-1	DSMZ	ACC 366	SD-1 foram cultivados de acordo com o fornecedor' s recomendações e mídia recomendada.
(*) Gibson LF, Fortney J, Landreth KS, Piktel D, Ericson SG, Lynch JP. Interrupção da função das células estromais da medula óssea pelo etoposídeo. Transplante de medula sanguínea Biol J Am Soc Transplante de medula sanguínea. Agosto de 1997; 3(3):122-32.