Modelagem quimioterapia leucemia resistente In Vitro

Resumo

O presente relatório resume um protocolo que pode ser utilizado para modelar a influência do nicho do microambiente da medula óssea nas células leucêmicas, com ênfase no enriquecimento da subpopulação mais quimiorresistente.

Resumo

Está bem estabelecido que o microambiente da medula óssea fornece um local único de santuário para doenças hematopoiéticas que iniciam e progridem neste local. O modelo apresentado no presente relatório utiliza células estromais primárias da medula óssea humana e osteoblastos como dois tipos de células representativas do nicho da medula que influenciam o fenótipo das células tumorais. As condições de co-cultura in vitro descritas para células leucêmicas humanas com esses componentes primários de nicho suportam a geração de uma subpopulação quimiorresistente de células tumorais que podem ser eficientemente recuperadas da cultura para análise por diversas técnicas. Um cronograma de alimentação rigoroso para evitar fluxos de nutrientes seguidos pela recuperação de partículas de dextrana reticulada (G10) tipo 10 da população de células tumorais que migraram sob as células estromais da medula óssea aderente (BMSC) ou osteoblastos (OB) gerando uma população de células tumorais de "fase fraca" (PD), fornece uma fonte consistente de células leucêmicas resistentes à terapia purificada. Essa população clinicamente relevante de células tumorais pode ser avaliada por métodos padrão para investigar vias regulatórias apoptóticas, metabólicas e do ciclo celular, bem como fornecer um alvo mais rigoroso para testar novas estratégias terapêuticas antes de investigações pré-clínicas direcionadas à doença residual mínima.

Introdução

O objetivo geral do método descrito é fornecer uma abordagem in vitro eficiente e econômica que apoie a investigação dos mecanismos subjacentes à sobrevivência de células leucêmicas suportadas pela medula óssea durante a exposição à quimioterapia. Está bem documentado que as células tumorais residuais sobreviventes que persistem após o tratamento contribuem para a recidiva da doença que muitas vezes é mais agressiva do que no diagnóstico e muitas vezes é tratada de forma menos eficaz^1-8. Modelos que incluem células leucêmicas isoladamente, como aqueles limitados à cultura de células apenas em meios, para testes de abordagens terapêuticas, não levam....

Protocolo

1. Preparação avançada

1. A preparação de partículas do G10 dextrano.
   1. Prepare G10 pasta por adição de 50 ml de PBS 1X aos 10 partículas g G10. Misturar por inversão e permitir G10 para resolver fora de salina tamponada com fosfato (PBS) a 4 ° CO / N.
   2. No dia da separação coluna G10, aspirado PBS a partir de partículas do G10 assentados e adicionar 50 ml de PBS fresco. Misturar por inversão. Repita duas vezes, adicionando 50 ml PBS fresco às partículas do G10 assentadas e armazenar a 4 ° C até que esteja pronto para uso.
2. A cultura de BMSC e OB.
   1. Manter tanto a BMSC OB ou a 37 ° C em 6% de CO ₂ e cultivad....

Resultados

Configuração bem-sucedida e cultura deste modelo de co-cultura irá resultar no estabelecimento de 3 subpopulações de células leucémicas em relação ao aderente BMSC ou OB monocamada. A Figura 1 mostra como todos as células semeadas em uma monocamada BMSC inicialmente aparece como uma única população de suspenso células leucêmicas. Ao longo de 4 dias as células leucémicas interagem com a BMSC para formar 3 subpopulações de células leucémicas espaciais (suspensa (s), de fas.......

Discussão

doença residual mínima (MRD), que contribui para a recidiva da doença continua a ser um grande desafio para o tratamento clínico de refractário agressivo ALL, bem como, uma série de outras doenças malignas hematológicas. O microambiente da medula óssea é o local mais comum de recidiva em ALL ^3,8. Como tal, os modelos que modelam o microambiente da medula óssea são ferramentas vitais para testar hipóteses relacionadas com a sobrevivência das células tumorais leucêmicas e manutenção de MRD durante a exposição q.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Grânulos de sephadex G10	Sigma	G10120	Referido no manuscrito como gel tipo 10 partículas de dextrano reticuladas
Seringa estéril de 10 ml	BD	309604
lã de vidro	Pyrex	3950
torneiras de 1 via	World Precision Instruments, Inc.	14054-10
Tubos de centrífuga cônicos de 50 ml	Médicos	Mundiais 41021039	Usados como tubos de coleta
Tubos de centrífuga cônicos de 15 ml Produtos	Médicos	Mundiais 41021037	Usados para coleta de células
Soro Fetal Bovino	Sigma	F6178
0,05% Tripsina	Mediatech, Inc.	25-053-CI
100 x 20 mm Placas de Cultura de Células	Greiner Bio-One	664160
Meios de cultura
Meios de cultura de osteoblastos	PromoCell	C-27001	Para meios de osteoblastos humanos
RPMI 1640 mídia	Mediatech, Inc.	15-040	Para preparação de mídia tumoral
Linhas celulares
Células aderentes:
Osteoblastos humanos	PromoCell	C-12720	Os osteoblastos humanos foram cultivados de acordo com o fornecedor' s recomendações.
Células estromais de Morrow ósseo humano	WVU Biospecimen Core		Leucemia humana primária não identificada e células estromais da medula óssea (BMSC) foram fornecidas pelo Núcleo de Processamento de Bioespécimes do Mary Babb Randolph Cancer Center (MBRCC) e pelo Banco de Tecidos do Departamento de Patologia da Universidade de West Virginia. As culturas de BMSC foram estabelecidas conforme descrito anteriormente (*)
Células leucêmicas:
REH	ATCC	ATCC-CRL-8286	As células REH foram cultivadas de acordo com o fornecedor' s recomendações e mídia recomendada.
SD-1	DSMZ	ACC 366	SD-1 foram cultivados de acordo com o fornecedor' s recomendações e mídia recomendada.
(*) Gibson LF, Fortney J, Landreth KS, Piktel D, Ericson SG, Lynch JP. Interrupção da função das células estromais da medula óssea pelo etoposídeo. Transplante de medula sanguínea Biol J Am Soc Transplante de medula sanguínea. Agosto de 1997; 3(3):122-32.