Análise quantitativa da expressão da proteína para estudar Especificação Lineage no mouse Preimplantation Embriões

Summary

Este protocolo apresenta um método para realizar, de uma única célula quantitativa análise in situ da expressão de proteínas para o estudo especificação das linhagens em embriões de rato pré-implantação. Os procedimentos necessários para a coleta de blastocistos, toda montagem de detecção de imunofluorescência de proteínas, a imagem latente de amostras em um microscópio confocal, e segmentação nuclear e análise de imagem são descritos.

Abstract

Este protocolo apresenta um método quantitativo para executar, de uma única célula in situ análises de expressão de proteínas para o estudo especificação linhagem em embriões pré-implantação do mouse. Os procedimentos necessários para a coleta de embriões, imunofluorescência, a imagem latente em um microscópio confocal, e segmentação de imagens e análise são descritos. Este método permite a quantificação da expressão de vários marcadores nucleares e a espacial (XYZ) coordenadas de todas as células no embrião. Ela tira proveito de MINS, uma ferramenta de software segmentação de imagens desenvolvido especificamente para a análise de imagens confocal de embriões pré-implantação e colônias de células-tronco embrionárias (ESC). MINS realiza segmentação nuclear sem supervisão entre o X, Y e Z dimensões, que produz uma informação sobre a posição da célula no espaço tridimensional, bem como os níveis de fluorescência nuclear para todos os canais de entrada do utilizador com o mínimo. Embora este protocolo foi optimizado para a análise de imagensde pré-implantação de embriões fase de ratinho, que pode ser facilmente adaptado para a análise de quaisquer outras amostras que apresentam uma boa relação sinal-ruído e onde a densidade nuclear elevada coloca um obstáculo para a segmentação de imagens (por ex., análise de células estaminais embrionárias expressão (ESC ) colônias, células em cultura, embriões de outras espécies ou estágios, etc.) de diferenciação.

Introduction

O embrião de rato pré-implantação é um paradigma para estudar a formação e a manutenção da pluripotência in vivo, bem como um modelo para o estudo da especificação destino celular e epitelização de novo em mamíferos. Os estágios pré-implantação de desenvolvimento dos mamíferos são dedicados à criação das três linhagens de células que compõem o blastocisto, ou seja, o epiblasto pluripotentes - que dá origem à maioria dos tecidos somáticos e células germinativas - e duas linhagens extraembryonic, o trofectoderma (TE) ea endoderme primitiva (PRE) (Figura 1A) ^1,2. Este protocolo descreve os procedimentos para (1) embriões colheita e corrigir estágio de pré-implantação do rato, (2) realizar imunofluorescência para identificar proteínas de interesse, (3) realizar todo-montagem de imagens usando um microscópio confocal com capacidades de seccionamento z e (4) realizar segmentação nuclear de imagens confocal e análises subsequentes imagem quantitativa. Este gasoduto permite tele imparciais medição dos níveis de proteína para a atribuição de identidades celulares para caracterizar subpopulações de células in situ. Este protocolo pode ser levada a cabo em tão pouco quanto 3-4 dias para um único ninhada (geralmente até 10 embriões de ratinho), a partir de colheita de embriões para a análise de dados (Figura 1B). A análise simultânea de várias ninhadas aumentaria a imagem e análise de dados a carga do tempo, aumentando assim o comprimento total do protocolo.

O embrião pré-implantação fase do rato é um sistema experimentalmente tratável que, dada a sua pequena dimensão e morfologia estereotipada ^3, é bem adequado para em imagem toto de processos celulares com resolução de uma única célula. Para realizar uma análise dos sistemas de nível imparcial de um número estatisticamente relevante de embriões, um gasoduto de análise quantitativa automatizada é desejável. No entanto, devido à densidade elevada nuclear da massa celular interna (ICM) do blastocisto ( Figura 1A, 2D), plataformas de segmentação de imagem convencionais não conseguem fornecer uma precisão suficiente para estabelecer um fluxo de trabalho automatizado ou semi-automático. Por outro lado, a segmentação manual, ao mesmo tempo precisa, não permite o tratamento de grandes grupos de células e de embriões, nem é adequado para uma determinação reprodutível, imparcial das identidades das células - o que é especialmente crítico quando se estuda estágios de desenvolvimento onde os padrões de marcador expressão ainda não totalmente resolvida (por exemplo, não apresentam uma distribuição de binário através de uma população). Temos recentemente desenvolvido e validado um método de segmentação de imagens sob medida para embriões em estágio de pré-implantação do mouse e de células-tronco embrionárias (CES), que alcança alta precisão, enquanto que exigem intervenção mínima do usuário ^4-8.

O gasoduto análise aqui apresentada gira em torno da ferramenta de segmentação de imagens baseado em MATLAB Modular interactivo Segmentação Nuclear ^(MIN) 4. MINS performs segmentação nuclear sem supervisão em grandes lotes de Z-pilhas confocal depois que o usuário tenha estabelecido um número mínimo de propriedades da imagem, usando uma interface gráfica de usuário (GUI) (Tabela 1) ^4. Este oleoduto tem-se mostrado eficiente para a geração de dados de alto rendimento sobre a expressão da proteína e localização de células em ambos os tipo selvagem, tratados experimentalmente e os embriões e os CES ^5-7 geneticamente modificado. No presente protocolo, descrevemos a aplicação de minutos para a segmentação de imagens de embrião pré-implantação de estágio. Para exemplos de desempenho minutos na CES consulte a ^4,7. O passo de segmentação nuclear automatizado reduz significativamente a carga do tempo do processo de identificação de células, ao passo que as medições de intensidade espacial e de fluorescência permitem uma determinação imparcial de identidades de células e a geração de mapas tridimensionais dos domínios de expressão do gene e a posição da célula no embrião (figura 1C ). Além disso, a escalabilidade desse fluxo de trabalho faz com que seja aplicável à análise das ninhadas individuais através de grandes grupos de embriões tratados experimentalmente, ou embriões de diferentes origens genéticas ^5,6. MINS está livremente disponível em http://katlab-tools.org (o software requer uma licença MATLAB).

Nenhuma abordagem desenvolvida até à data permite a geração desses dados aprofundados sobre a expressão da proteína e localização de células em embriões de rato pré-implantação. Todas as tentativas até agora a quantificar estes tipos de dados foram restritos à determinação manual e quantificação do número de células para diferentes populações no embrião (seja inteiramente manualmente ou software assistida) ^9-19. Esta abordagem (incorporando software minutos) foi adaptado e testado em embriões pré-implantação do mouse e CES; no entanto, o seu desempenho em outros sistemas com a densidade nuclear de alta, embora ainda não foi testada, é esperado para ser equivalente.

Protocol

declaração de ética: Todo o trabalho animal, incluindo agricultura, criação de animais e sacrifício foi aprovado pelo Comitê Memorial Sloan Kettering Cancer do Centro Institucional animal Cuidado e Uso (IACUC), protocolo nº 03-12-017.

Coleção 1. Embrião

Nota: Todos os trabalhos animais devem ter sido aprovados pelas autoridades institucionais e locais e em conformidade com as regras locais e institucionais.

1. Companheiro um rato fêmea virgem com um macho parafuso prisioneiro fértil dos genótipos desejados.
   Nota: Se a criação de acasalamentos naturais, a seleção de fêmeas na fase estro do ciclo estral aumenta as chances de cópula na data desejada. Se induzir superovulação, consulte os protocolos descritos no ^20.
2. Verifique a presença de um rolhão vaginal na parte da manhã, utilizando uma sonda romba. Idealmente, faça isso antes do meio-dia (12:00), como plugs de cópula são perdidas ao longo do dia. considere nooN de detecção do dia embrionário rolhão vaginal (E) 0.5.
3. No dia e hora do desenvolvimento embrionário desejado, aquecer M2 ou exploração de lavagem médio (FHM) para RT ou, de preferência, 37 ºC. Nota: Ou M2 ou FHM pode ser utilizado para lavagem e manipulação de embriões. Quando não estiver em uso, guarde estes meios a 4 ºC. Estimar a utilização de ~ 2 mL de meio para cada útero.
4. Descongelar congelado paraformaldeído a 4% (PFA) em tampão fosfato salino (PBS) ou preparar alguns solução fresca. Estimar a 500 ul de solução a 4% de PFA por poço de uma placa de quatro poços. Fix uma maca em cada poço de uma placa de quatro poços. Nota: Em alternativa, uma placa de 96 poços pode ser usado para fixar e armazenar embriões. Se utilizar uma placa de 96 poços, 100 ul de usar solução PFA por poço.
5. Puxe uma pipeta Pasteur de vidro usando uma chama aberta para desenhar um final capilar na ponta.
6. Sacrifício do sexo feminino por deslocamento cervical ou _inalação de CO 2, ou como exigido pelos regulamentos locais e institucionais. É muitas vezes desirable para confirmar a eutanásia do animal por deslocamento cervical.
7. Spray de barriga do animal com etanol a 70% para minimizar a queda de cabelos e executar uma incisão abdominal, em primeiro lugar através da pele e, subsequentemente, através da parede do corpo (peritoneu) para expor as vísceras.
   Nota: Os passos seguintes descrevem o procedimento para recolher blastocistos do útero de um rato fêmea grávida em qualquer fase entre E3.25 e E4.5 (Figura 1A). Para protocolos de recolha de embriões pré-implantação mais cedo do que E3.25, referem-se a ^20.
8. Localize o útero e remover do animal. Segurando a extremidade cervical do útero, com um par de pinças, cortar através do colo do útero e puxar-se suavemente para esticar ambas as trompas uterinas.
9. Apare gordura do útero, tendo o cuidado de não perfurar a parede uterina. Isto pode ser feito facilmente no momento da remoção, enquanto ainda ligado ao corpo do animal, como o útero pode ser esticada para fora. Alternativamente, elepode ser feito mais tarde, sob um microscópio de dissecção, em PBS temperatura ambiente. Para um protocolo mais detalhado na dissecção do útero, ver Protocolos 5 & 8 ²⁰
10. Cortar acima das tubas uterinas, abaixo dos ovários, para liberar todo o útero, coloque em um prato de petri e cubra com PBS.
    Nota: Esta etapa também permite a lavagem do excesso de sangue ou outros detritos do útero, o que facilita a colheita blastocisto subsequente.
11. cornos uterinos separadas tanto por corte através da extremidade proximal, em ambos os lados do colo do útero e descartar o colo do útero. Separa-se cada oviduto do útero por corte abaixo do istmo que eles (Figura 1A) se conecta. Transferir ambos os chifres a uma gota de meio de manipulação (ou M2 ou FHM) para a coleta e manipulação dos embriões.
12. Sob um microscópio de dissecção, com descarga blastocistos para fora do útero e para o meio, forçando 0,5 - 1 ml de M2 ​​ou FHM através de cada trompa uterina da abertura cervical. Use um 1ml seringa com uma agulha hipodérmica. Nota: A agulha pode ser atenuada usando uma pedra de arquivamento para evitar rasgar o útero, embora isto não seja crítico. Um diagrama detalhado para lavagem uterina pode ser encontrado em ^21.
13. Utilizando o microscópio de dissecação, localizar os blastocistos, que serão espalhados por toda a gota de meio. Permita-se para 1-2 min para blastocistos a afundar para o fundo do recipiente após a lavagem. Usando o, pipeta Pasteur de vidro controlado por via oral com um final capilar, recolher todos os blastocistos e transferir para uma queda fresca da mídia.
14. Lavar blastocistos, movendo-os através de 2 - 3 gotas de M2 ​​fresca ou FHM. Mover os embriões em grupos de 5 - 10 blastocistos de cada vez.
    Observação: Mover grupos maiores a qualquer momento irá acelerar o processo, mas que também irá aumentar as chances de acidentalmente perder muitos embriões. Se não treinados no uso de pipetas controlada na boca, praticando manipulação de embriões e transferência devem ser considerados antes beginning o experimento.
15. Remover a zona pelúcida (ZP) a partir de blastocistos eclodidos (geralmente
16. Tenha cuidado ao manusear blastocistos desnudas, como eles aderem muito facilmente para superfícies de vidro e plástico. meio de manipulação contém 4 mg / ml de albumina de soro bovino (BSA) para impedir a fixação, mas o ácido Tyrode do ou PBS não, portanto, para reduzir o risco de danos ou perda dos embriões não pegar mais de 2 - 5 blastocistos desnudas num momento em que manipulá-los em BSA-livre ou sem soro PBS ou ácido Tyrode do.
    Observação: Como alternativa, o revestimento pipeta de vidro com 1% de BSA antes da utilização para reduzir a aderência dos embriões à superfície do vidro.

Cubra o fundo de cada poçode um 4-bem placa de cultura de tecido com uma camada fina de agar 1%, NaCl a 0,9% para prevenir a embriões de aderir ao plástico. Alternativamente, adicionar 4 mg / ml de BSA para o PBS (PBS-BSA).

Encher uma cavidade do 4-bem placa de cultura de tecido revestido com 500 ul de PBS temperatura ambiente (ou PBS-BSA) e outro poço com 500 mL de 4% de PFA em PBS.

Enxaguar em blastocistos RT PBS e fixar em 4% de PFA em PBS durante 10 min à TA. Transferência para PBS (ou PBS-BSA) após a fixação.

Se os embriões não vão ser processados ​​imediatamente, cubra a PBS contendo os embriões com uma camada de óleo mineral para evitar a evaporação (levando a dessecação da amostra) e guarde a placa a 4 ºC.
Nota: Diferentes métodos de fixação e os tempos podem ser usados, dependendo da experiência, os epitopos de interesse e os anticorpos a ser utilizados. Qualquer que seja o método de escolha, ser consistentes ao longo de experiências equivalentes para facilitar a posterior comparação dos resultados de coloração.
Nota: Pausaponto: os embriões podem ser armazenadas a 4 ° C em PBS durante até várias semanas antes de prosseguir para o próximo passo. Certifique-se de PBS é estéril e / ou adicionar 100 U / ml de penicilina + 100 ug / ml de estreptomicina (Pen-Strep) para evitar a contaminação bacteriana (especialmente quando utilizando PBS-BSA) que antecipando armazenamento prolongado.

2. imunofluorescência

1. Execute imunofluorescência usando qualquer protocolo que tenha sido previamente testado e provou ser robusto para todo-mount imunofluorescência. Nota: Recomendamos aqueles descritos em ^{22 e 11.} No presente artigo, o primeiro vai ser descrito. Qualquer que seja o método de escolha, ser consistentes ao longo de experiências equivalentes para facilitar a comparação dos resultados de coloração.
2. Usar um flexível, polivinilo, claro, com fundo em U de placas de 96 poços para levar a cabo os passos sequenciais do protocolo de imunofluorescência. Encher cada poço com 50 - 100 ul de solução e se mover de uma solução de embriõespara outro usando uma pipeta de boca em forma de L. Nota Esta abordagem minimiza o uso de reagentes e facilita as etapas de acompanhamento, bem como a coloração paralelo de vários grupos experimentais.
   1. Opcional: revestir o fundo dos poços com uma camada fina de agar 1%, NaCl a 0,9%, para impedir a adesão de embriões para o plástico. Não adicione BSA a soluções de imunofluorescência.
3. Prepare a PBX (0,1% de Triton X-100 em PBS). Se antecipando a realização de diversas experiências de imunofluorescência, preparar 50 ml de PBX e armazenar a 4 ºC entre os experimentos.
4. Preparar a solução de permeabilização (0,5% de Triton X-100, glicina 100 mM em PBS). Faça 1 ml (ou qualquer valor necessário) de solução de permeabilização fresco para cada experimento.
5. Preparar solução de bloqueio (soro de cavalo a 2% (HS) ou 20% de soro fetal de bovino (FBS) com Pen-Strep em PBS). Preparar 10 ml e armazenar a 4 ºC entre os experimentos.
   1. Não foram observadas diferenças entre ambos osTipo de soro, no entanto, ser consistentes na escolha da solução utilizada para as experiências de bloqueio equivalentes.
6. Lavar embriões fixados durante 5 min à temperatura ambiente em PBX (~ 100 mL).
7. Permeabilizar embriões durante 5 min à temperatura ambiente em solução de permeabilização (~ 100 mL).
8. Lavar embriões durante 5 min à temperatura ambiente em PBX (~ 100 mL).
9. Bloco para embriões de 30 min a 1 h à temperatura ambiente em ~ 100 ul de solução de bloqueio. Cobrir a solução com uma camada de óleo mineral para evitar a evaporação ou manter numa câmara humidificada.
   Nota: Os embriões podem ser bloqueadas para até O / N períodos a 4 ºC sem melhora notável ou prejuízo quando comparado com medidas de bloqueio 30 min.
10. Incubar os embriões O / N a 4 ºC em anticorpo primário / anticorpos diluídos em solução (~ 100 mL) de bloqueio. Cobrir a solução com uma camada de óleo mineral para evitar a evaporação ou manter numa câmara humidificada.
    1. Determinar a diluição óptima para cada anticorpo primário de antemão. veja dISCUSS secção Materiais e para diluições testadas de uma série de anticorpos.
11. Depois de O / N incubação, lave embriões 3x por 5 minutos cada à temperatura ambiente no PBX (~ 100 mL).
12. Bloco para embriões de 30 min a 1 h à temperatura ambiente em ~ 100 ul de solução de bloqueio. Cobrir a solução com uma camada de óleo mineral para evitar a evaporação ou manter numa câmara humidificada.
13. Incubar os embriões durante 1 a 2 horas a 4 ° C em anticorpo secundário / anticorpos diluídos a 4 ug / mL em ~ 100 ul de solução de bloqueio. Cobrir a solução com uma camada de óleo mineral para evitar a evaporação ou manter numa câmara humidificada.
14. Lavar embriões 2x por 5 minutos cada à temperatura ambiente no PBX.
15. Mover embriões para corar o ADN preferido. Se usando Hoechst 33342, diluído para 5 ug / ml em PBS. Cobrir a solução com uma camada de óleo mineral para evitar a evaporação ou manter numa câmara humidificada.
    Nota: Pausa ponto: Se os embriões não estão sendo fotografada imediatamente, eles podem ser mantidos por up para várias semanas em solução de coloração nuclear. Neste caso, garantir PBS é estéril e / ou adicionar Pen-Strep ou azida de sódio para prevenir o crescimento bacteriano e contaminação.

3. Imagem Confocal

Nota: As configurações de microscópio confocal individuais vai exigir parâmetros de aquisição específicas para ser ajustado para o sistema e software no lugar. No entanto, a secção seguinte fornece um conjunto de regras gerais a seguir que deve ser aplicável a qualquer instalação.

1. Usando uma pipeta de boca fina, faça microgotas de PBS ou solução nuclear mancha na superfície do vidro de um prato com fundo de vidro 35 mm e cobrir com óleo mineral. Como alternativa, use uma lamela regular com separadores de silicone para evitar danificar os embriões e cobrir com uma lâmina de vidro. Nota: Ao utilizar uma lamela regular, os embriões não podem ser posteriormente reposicionada ou recuperados para genotipagem, portanto, recomendamos o uso de vidro de fundopratos.
2. embriões lugar no microgotas e organizar de forma coerente, de preferência com o eixo ICM-cavidade paralelo à superfície do vidro. Configurar o prato no suporte de microscópio. Nota: Imagens obtidas em varredura a laser microscopia confocal sofrem de uma perda eixo Z-associado da intensidade de fluorescência. Portanto, a consistência no sistema é importante para a comparação de intensidades entre regiões equivalentes em diferentes embriões.
3. Configurar os parâmetros de referência utilizando embriões tipo selvagem que não tenham sido sujeitos a qualquer tipo de tratamento que pode alterar a expressão genética.
   1. Adquirir imagens utilizando uma objectiva grande aumento (ou seja, 40X ou superior), a fim de obter dados que irão facilitar a segmentação precisa usar a ferramenta MINS ^4.
      Nota: Usando o zoom digital em um objetivo 20X não produzirá imagens de resolução adequada para a segmentação usando mins. Deve-se notar também a distância de trabalho (WD) do objectivo, como deve sersuficiente para permitir a aquisição de um Z-pilha que se estende por todo um blastocisto, então uma longa WD (~ 130-150 uM) objectivo é normalmente necessário. As imagens mostradas nas Figuras 2 - 4 foram adquiridos utilizando um 40X / NA objectiva de imersão em óleo de 1,30 com uma distância de trabalho de 210? M.
   2. Usar a menor saída do laser que proporciona uma relação forte sinal-ruído, sem branqueamento os fluoróforos.
   3. Ajustar o ganho e deslocamento para obter a mais ampla gama dinâmica sem a superexposição da amostra. Expondo as imagens para cobrir a maior parte, ou todos os espectros escala, cinzento irá facilitar a detecção de pequenas diferenças de intensidade entre imagens.
   4. Usar um pequeno (1 uM) Z-passo, desde resolução do eixo z é crítica para a segmentação preciso com mins.
      Nota: dimensões XY não afetam o processo de segmentação nuclear, apenas o tamanho do arquivo de imagem. Geralmente, 512 x 512 pixels é uma resolução XY suficiente para imagens de qualidade para publicação sem compromicantar espaço no disco rígido.
   5. Passo crítico: Manter imagiologia parâmetros consistentes dentro e entre as sessões de imagem da mesma experiência de modo a ser capaz de comparar amostras.
4. A imagem latente lotes de embriões:
   1. grupos de imagem coerente (ninhadas, experiências) em uma única sessão sempre que possível.
   2. Mantenha parâmetros consistentes dentro e entre as sessões de imagem de repetições do mesmo experimento.
   3. embriões de imagem em toda (toda eixo Z) para capturar todas as células.
      Nota: Se desejado, embrião genotipagem pode ser feito depois de formação de imagens conforme descrito em ^23. A necessidade de PCR interna tem de ser determinada empiricamente e dependerá do local a ser analisada e os iniciadores utilizados.
5. Certifique-se de ser capaz de igualar os embriões às imagens retrospectivamente.

4. Análise de Imagem e Pré-processamento de dados

1. Baixe e instale MINS ^{4 a partir de} http: // Katlab-tools.org (licença MATLAB necessário).
2. Execute segmentação de imagens:
   1. Siga a interface gráfica de usuário (GUI) de minutos para carregar uma imagem confocal ou pilha a partir do disco rígido, detectar os núcleos e segmento da imagem. Carregar o inteiro Z-pilha de dados brutos gerados pelo microscópio (.lsm, .lif, .oif, etc). Ver Tabela 2 para obter detalhes sobre cada etapa e instruções encontradas em http://katlab-tools.org e ^4. Depois de concluído, exibir o resultado de cada etapa clicando no botão correspondente 'View'. A etiqueta amarela acima do botão indica operação em processo, uma etiqueta verde indica operação foi concluída.
      Nota: MINS atualmente não suporta arquivos .czi, .tiff sequências ou ficheiros multi-posição - cada Z-stack precisa ser um arquivo independente.
   2. Depois de segmentação satisfatória, salvar o gasoduto criado para que ele possa ser usado directamente para outros embriões ou ninhadas.
3. segmentação lote-Mode:
   Nota: Siarquivos ngle pode ser segmentado individualmente. No entanto, dado que os embriões dentro de uma ninhada ou experiência são geralmente de estágio comparável, MINS pode aplicar o gasoduto segmentação criada para uma única imagem a um grupo de-los sem supervisão.
   1. A partir do menu Batch-Mode Run, clique em "Adicionar arquivos" e carregar todos os arquivos a serem processados ​​ao mesmo tempo. Nota: ficheiros de diferentes fontes podem ser adicionadas à fila de segmentação.
   2. Clique em "Iniciar Batch-Mode Run 'e dar tempo para o software para processar os arquivos. Nota: A saída Segmentação será salvo no mesmo diretório onde os arquivos originais onde se localiza.
4. avaliação de segmentação e correção manual
   Nota: MINS segmentos de imagens com uma precisão muito elevada (> 85%), no entanto, a qualidade da coloração e de imagem, assim como a fase de embrião, podem afectar o desempenho mins. Geralmente, quanto maior a densidade nuclear dentro do embrião, os erros de segmentação mais provavelmente vai levar PlacE (Figuras 2D, 3). Assim, a segmentação precisão deve ser avaliada para cada amostra e corrigidos manualmente, se necessário. Dois tipos de erros ocorrem normalmente: o excesso de segmentação e sub-segmentação.
   1. Resolver sobre-segmentação:
      1. Identificar falsos positivos - vesículas apoptóticas (Figura 3A a, b, d, asteriscos) ou outros elementos que não são núcleos intactos, mas que podem ter sido identificado como tal por mins.
         Nota: Em geral, tais falsos positivos têm um tamanho menor do que núcleos reais e pode, na maioria dos casos, ser facilmente identificados e classificados na folha de cálculo. No entanto, o exame visual é fortemente recomendado, como muitas vezes núcleos podem ser apenas parcialmente segmentada, resultando em uma, mas o volume segmentado válida menor (Figura 3A b, ponta de seta).
      2. Excluir os registros correspondentes para falsos positivos a partir do arquivo * statistics.csv. Preservar as estatísticas originais *.csv arquivo para referência futura e editar apenas uma cópia do mesmo.
      3. Se um núcleo tem sido mais segmentado e apresentado como 2 ou mais núcleos (Figura 3A c, seta e setas), ou mesclar os registros pela média de seu nível de intensidade ou, se semelhante, mantenha um dos registros para essa célula e descartar o descansar.
   2. Resolver sub-segmentação:
      1. Identificar eventos onde MINS falhou para detectar a fronteira entre dois ou mais núcleos segmentados e consequentemente os como um único núcleo (Figura 3A d, seta e 3B). Nota: Isto coloca um problema para uma contagem de células precisas, mas o mais importante, para quantificar os níveis de proteína, tal como os níveis medidos será a média das células que foram erroneamente fundidos, e que podem pertencer a diferentes linhagens.
      2. Identificar eventos onde MINS não conseguiu detectar um núcleo completamente.
      3. Nestes casos (4.4.2.1 e 4.4.2.2), medir os níveis de cinza média de fou cada canal na célula (s) sub ou un-segmentado usando uma ferramenta alternativa, tais como ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/), e substituir o registo errado com os níveis corretos. Preservar o arquivo statistics.csv * original para referência futura e editar apenas uma cópia do mesmo. Para fazer isso usando ImageJ, siga estes passos:
         1. Abra a pilha multi-canal relevante em ImageJ e importar o arquivo overlaid.tiff * correspondente gerada por minutos como uma pilha virtual ( 'Arquivo'> 'Importar'> 'TIFF pilha virtual ...').
         2. Encontrar uma seção medial do núcleo sub ou un-segmentado.
         3. Utilizando a ferramenta de seleção à mão livre delinear o perímetro do núcleo sub ou un-segmentado no canal da mancha DNA.
         4. Imprensa Crl + M (Cmd + M em um Macintosh) ou vá para o menu Análise e selecione 'Medida'. Esta acção irá gravar o valor de cinza médio para a área delineada e vai exibi-lo em uma nova janela. Ir para "Analisar">9; medições Set ... 'e certifique-se "significa valor de cinza' é selecionado. Escolha quaisquer outros parâmetros a serem medidos.
         5. Usando a mesma área delineada no passo 4.4.2.3.3, repetir a medição para cada um dos canais de fluorescência de interesse. Os resultados serão anexados ao anterior na janela As medições 'Resultados'.
         6. Use as medidas obtidas para substituir os registros errados no arquivo * statistics.csv. Se o núcleo não tinha sido segmentado, inserir uma nova linha, atribuir um novo ID celular e introduzir os valores obtidos no ImageJ na coluna correspondente para cada canal. Esta célula não terá coordenadas espaciais (e Z valores X, Y). Se o núcleo tinha sido undersegmented, duplicar a sua linha, atribuir diferentes a identificação de células a cada nova célula e introduzir os valores obtidos no ImageJ na coluna correspondente. Neste caso, ambas as células irão partilhar coordenadas espaciais.
            Nota: Se a distribuição espacial é para ser analisado, recommend excluindo a coordenadas XYZ destas células, à medida que se sobrepõem. Para este fim, ao criar novos registros, atribua a identificação de células para eles que são facilmente distinguidos dos originais (para números de exemplo, não inteiro).
   3. Pontuação células em divisão. Nota: MINS detecta mitótico, bem como núcleos interfase, mas não pode distinguir entre os dois.
      1. Se núcleos mitóticas devem ser considerados separadamente na análise, marcar manualmente estes e adicione essas informações para o arquivo de dados. Para gravar células mitóticas, adicionar uma nova variável (coluna) para o arquivo de dados statistics.csv * e atribuir valores diferentes para mitose e interfase núcleos.
5. Dados pré-processamento.
   Nota: Uma vez que as planilhas foram corrigidos para a sobre e sub-segmentação eles estão prontos para serem analisados. O processo de análise e de apresentação de dados vai depender da experiência específica. No entanto, abaixo estão algumas transformações de dados geraisrecomendamos a realização antes da análise:
   1. Transformar os valores de intensidade de fluorescência para o seu logaritmo ou raiz quadrada para reduzir a dispersão dos dados. Isto também ajuda a visualização, como os dados brutos tendem a concentrar próximo dos eixos da trama (ver Figura 4B, C).
   2. Corrigir a atenuação associada-Z de fluorescência:
      Nota: A intensidade da fluorescência na varredura a laser imagens de microscopia confocal diminui a mais profunda sobre o eixo Z uma fatia está localizado (Figura 4E, F).
      1. Se um dos epitopos detectados nas amostras é um marcador nuclear de arrumação ubíqua e homogeneamente expressa, normalizar as intensidades de fluorescência dos outros epitopos dividindo-se os valores em cada célula pelo valor correspondente do marcador de arrumação.
      2. Na ausência de um tal marcador de referência, compensar a perda associada-Z de fluorescência da seguinte forma:
         1. Traçar os valores de cada marcador (Yeixo do gráfico) sobre a posição Z (eixo X do gráfico) para visualizar a diminuição da intensidade ao longo Z - trama juntos os valores para todos controlo, embriões de tipo selvagem (Figura 4F).
         2. Ajustar um modelo linear (curva de regressão) para o lote obtido na etapa anterior (intensidade os valores superiores a Z) para cada um dos marcadores (Figura 4F).
         3. Corrigir todos os valores para cada marcador usando a seguinte fórmula:
            log (valor original) + Z * declive do modelo (Figura 4D, L).
            Nota: Os passos específicos para efectuar esta correcção vai depender do software de análise usado (R, Matlab, etc.). Se estiver usando R, execute o seguinte fórmula para ajustar um modelo linear aos dados:
            > Lm (log (canal) ~ Z, data = trama de dados)
            em que, o canal é o canal de fluorescência a ser corrigido, Z é o eixo Z e de trama de dados é a tabela que contém todos os valores para o embrião desejado (s) (a * Statistics.csv arquivo gerado pelo minutos ou uma modificação do mesmo).
            Nota: A saída da fórmula acima irá ter o seguinte formato:
            (Intercept) Z
            4,76373 -0,01947
            em que, o valor de Z é o declive da linha de regressão para o conjunto de dados que, o que deve ser valor absoluto utilizado para modificar o valor original com a fórmula dada no 4.5.2.2.3 (ver Figura 4G para um exemplo).

Results

Para facilitar a interpretação e apresentação de dados, deve ser tomado cuidado para não danificar os embriões durante a coleta e manipulação, de modo que todas as células e sua posição relativa pode ser analisada Figura 2A -. D mostra exemplos de blastocistos intactos em diferentes fases com uma cavidade expandida. Deve danificar ocorrer, cuidados extras devem ser tomados ao analisar e interpretar resultados.

...

Discussion

O presente protocolo descreve um método para realizar uma análise quantitativa de toda mount-imunofluorescência na pré-implantação embriões estágio do mouse. Um protocolo de imunofluorescência robusta ²² é seguido de alta resolução, todo-mount imagem confocal e por segmentação de imagens usando um pedaço sob medida de software ^4. Embora a escolha do protocolo de imunofluorescência não é crítica, nós encontramos o apresentado aqui ²² para ser rápido, fiável e para fornecer sinal robusto p...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Coleta de embriões
Sonda romba para verificação de plugue	Roboz	RS-9580
Fórceps	Roboz	RS-4978
Tesoura cirúrgica	Roboz	RS-5910
Pipetas Pasteur de vidro	Fisher	13-678-20C
Tubo aspirador pré-montado e bocal	Sigma	A5177
Tubo de borracha mais longo	Fisher	14-178-2AA
M2	Millipore	MR-015-D
FHM	Millipore	MR-024-D
Solução de Tyrode Ácido	Millipore	MR-004-D
Penicilina/Estreptomicina	Gibco	15140
Soro Bovino Albumina	Placas de	A9647
	Nunc/Thermo-Fisher	12-566-300
Imunofluorescência
96 poços Placas de fundo em U	Fisher	14-245-73
Triton X-100	Sigma	T8787
Glicina	Sigma	G7403
Soro de cavalo	Sigma	H0146
Anticorpos primários			concentração
CDX2	Biogenex	AM392-5M	1:200
GATA6	R& D	AF1700	1:100
GATA4	Santa Cruz	sc-9053	1:100, fixação de 10 min
GATA4	Santa Cruz	sc-1237	1:100, fixação O/N
SOX17	R& D	AF1924	1:100
Nanog	ReproCELL	RCAB0002P-F	1:500
OCT4	Santa Cruz	sc-5279	1:100, 10 min para fixação O/N
DAB2	BD	BD-610464	1:200
Anticorpos secundários	Life	Technologies Various	1:500
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570
Imagem
Pratos com fundo de vidro de 35 mm	MatTek	P35G-1.5-14-C
Segmentação
Computador executando o sistema operacional		n/a	Verifique os requisitos mínimos do sistema em http://katlab-tools.org e em Lou et al., (2014) Relatórios de células-tronco
MATLAB (software)	Mathworks	n/a
MINS (software)	Grátis	n/a	http://katlab-tools.org