Um método rápido e eficiente para a purificação de células da endoderme Gerado de células estaminais embrionárias humanas

Summary

Aqui, descrevemos um método para a purificação de células-tronco embrionárias humanas diferenciadas que estão comprometidos para a endoderme definitiva para a melhoria das aplicações a jusante e outras diferenciações.

Abstract

As capacidades de diferenciação de células estaminais pluripotentes, tais como células estaminais embrionárias (CES) permitem uma aplicação terapêutica potencial para terapias de substituição de células. Terminalmente tipos de células diferenciadas pode ser utilizado para o tratamento de várias doenças degenerativas. Diferenciação in vitro destas células no sentido de tecidos do pulmão, fígado e pâncreas requer como um primeiro passo na geração de células da endoderme definitivas. Este passo é para a posterior diferenciação em direcção tipos de células terminalmente maturados tais como células beta produtoras de insulina, hepatócitos, ou outros tipos de células derivadas de endoderme limitante da velocidade. As células que são comprometidas com a linhagem endoderme altamente expressar uma grande variedade de factores de transcrição, tais como Foxa2, Sox17, HNF1B, membros da família GATA, e o receptor da superfície CXCR4. No entanto, os protocolos de diferenciação são raramente de 100% eficiente. Aqui, nós descrevemos um método para a purificação de uma população de células CXCR4 + após a diferenciaçãona DE usando microesferas magnéticas. Esta purificação remove adicionalmente células de linhagens indesejados. O método de purificação suave é rápido e fiável e pode ser usado para melhorar as aplicações a jusante e diferenciações.

Introduction

As células estaminais pluripotentes, tais como células estaminais embrionárias (CES) têm a capacidade de se diferenciar em virtualmente qualquer tipo de células do corpo humano. Assim, os protocolos in vitro de diferenciação podem ser usadas para gerar numerosos tipos de células, tais como adultos cardiomiócitos ^{1, 2} hepatócitos, células beta ^{3, 4} ou epitelial de pulmão de células neuronais ^5. Isso faz com que os CES uma ferramenta valiosa para o tratamento potencial de várias doenças degenerativas ^3.

A diferenciação in vitro dos CES no sentido de tecidos ....

Protocol

1. Diferenciação de ESC Humano para o Endoderma Definitive

1. Cultivar as células estaminais embrionárias humanas (CES) em uma incubadora a 37 ° C e 5% de CO _2.
2. Revestimento um novo 6 poços da placa de cultura de células com 1 ml de uma matriz de membrana basal e incubar a cultura-louças durante pelo menos 30 min à temperatura ambiente. Para obter detalhes específicos por favor, ligue com as instruções dos respectivos fabricantes.
3. Confirmar que os CES humanas cultivadas atingiram 80% -90% de confluência ao microscópio utilizando uma ampliação baixa (por exemplo, 4X). Aspirar o meio das cavidades por sucção fora o meio c....

Results

Após a diferenciação CES sofrer alterações drásticas no gene e a expressão da proteína. A Figura 1 representa genes marcadores típicos que podem ser utilizados para verificar uma diferenciação endoderme bem sucedida. Alvos principais para a análise de expressão gênica são GSC, Foxa2 e Sox17. Em uma análise de expressão gênica relativa especialmente Foxa2 e Sox17 são aumentados em> 2.000 vezes quando compa.......

Discussion

protocolos de diferenciação utilizados actualmente raramente resultam em células diferenciadas 100%. Por razões que ainda têm de ser abordadas algumas células resistir ao processo de diferenciação. Dependendo da eficiência do protocolo utilizado diferenciação e a propensão do CES alinhar um certo número de células pluripotentes residuais são vulgarmente observadas mesmo após a diferenciação em endoderme definitiva. Estas células residuais pode prejudicar diferenciações a jusante ou uma análise mais aprofundada, como tra.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Linha de células-tronco embrionárias humanas Hues8	Harvard Departamento de células-tronco e biologia		Linha celular adequada para geração de endoderme
Linha de células-tronco embrionárias humanas Hes3	ES Cell International		Linha celular adequada e robusta para geração de endoderme
mTeSR1	Stemcell Technologies	5850	ESC meio de cultura
FCS	Biowest	S1860
Advanced RPMI 1640	Life Technologies	12633012
CD184 (CXCR4)-APC, humano	Miltenyi Biotec	130-098-357
anti-APC MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-090-855
Separador OctoMACS	Miltenyi Biotec	130-042-109	campo magnético
Y-27632	Selleck Chemicals	S1049	inibidor de ROCK
CHIR-99021	Tocris Bioscience	4423
Activin A	Peprotech	120-14
Reagente de Dissociação Celular Suave	Stemcell Technologies	7174	Sem enzimas solução de passagem, alternativa: Matriz de tripsina / EDTA
* Matriz	de 354277	Corning	< br / > * resolver e armazenar em alíquotas a -80 ° C conforme descrito no manual do fornecedor. Após o uso, descongele no gelo, dilua em 25 ml de nocaute gelado DMEM/F-12. Adicione 1 ml a cada poço de uma placa de 6 poços e incube por 45 min em temperatura ambiente. Remova o matrigel e use imediatamente.
Separador MACS	Miltenyi Biotec	30-042-201
	Columns Miltenyi Biotec	130-042-302
Human FOXA2 FW gggagcggtgaagatgga	Life Technologies	NA
Human FOXA2 REV tcatgttgctcacggaggagta	Life Technologies
Human GSC FW gaggagaaagtggaggtctggtt	Life Tecnologias
Human GSC REV ctctgatgaggaccgcttctg	Life Technologies
SOX17 Ensaio TaqMan	Applied Biosystems	Hs00751752_s1
Human SOX7 FW gatgctgggaaagtcgtggaagg	Life Technologies
Human SOX7 REV tgcgcggccggtacttgtag	Life Technologies
Humano POU5F1 FW cttgctgcagaagtgggtggagg	Life Technologies
Humano POU5F1 REV ctgcagtgtgggtgtcgggca	Life Technologies
Human Nanog FW ccgagggcagacatcatcc	Life Technologies
Human Nanog REV ccatccactgccacatcttct	Life Technologies
Human TBP FW caa cag cct gcc acc tta cgc tc	Life Technologies
Human TBP REV agg ctg tgg ggt cag tcc agt g	Life Technologies
Human TUBA1A FW ggc agt gtt tgt aga ctt gga acc c	Life Technologies
Human TUBA1A REV tgt gat aag ttg ctc agg gtg gaa g	Life Technologies
Human G6PD FW agg ccg tca cca aga aca ttc a	Life Technologies
Human G6PD REV cga tga tgc ggt tcc agc cta t	Life Technologies
Anti-SOX2	Santa Cruz Biotechnology	sc-17320
Anti-FOXA2	MerckMillipore	07-633
Anti-SOX17	R& D Systems	AF1924