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Artigo de método

Monitoramento em Tempo Real de intracelular Bile Ácido Dynamics usando um sensor Ácido Bile baseado em FRET codificados geneticamente

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⸱

DOI:

10.3791/53659

⸱

4 de janeiro de 2016

 ,  , 
1Tytgat Institute for Liver and Intestinal Research, Department of Gastroenterology and Hepatology, Academic Medical Center, 2Laboratory of Chemical Biology, Institute of Complex Molecular Systems (ICMS), 3Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology

Neste artigo

Resumo

Fornecemos um protocolo detalhado para estudar a dinâmica dos ácidos biliares em células vivas usando um sensor BAS FRET geneticamente codificado. Este sensor de ácido biliar representa uma ferramenta única para estudar (regulação do) transporte de ácido biliar e ativação de FXR em uma ampla gama de tipos de células.

Resumo

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) tornou-se uma ferramenta poderosa para monitorar o dobramento, interação e localização de proteínas em células individuais. Os biossensores baseados no princípio do FRET permitiram a visualização em tempo real de eventos de sinalização subcelular em células vivas com alta resolução temporal e espacial. Aqui, descrevemos a aplicação de um sensor de ácido biliar (BAS) geneticamente codificado que consiste em dois fluoróforos fundidos ao domínio de ligação ao ligante do receptor X (FVR-LBD), formando assim um sensor de ácido biliar que pode ser ativado por um grande número de espécies de ácidos biliares e outros ligantes FXR (sintéticos). Este sensor pode ser direcionado a diferentes compartimentos celulares, incluindo o núcleo (NucleoBAS) e o citosol (CytoBAS) para medir as concentrações de ácidos biliares localmente. Permite a quantificação rápida e simples do influxo de ácidos biliares celulares, efluxo e distribuição subcelular de ácidos biliares endógenos sem a necessidade de marcação com etiquetas fluorescentes ou radionúcleos. Além disso, os sensores BAS FRET podem ser úteis para monitorar a ligação do ligante FXR. Finalmente, mostramos que este biossensor FRET pode ser combinado com imagens de outros fluoróforos espectralmente distintos. Isso permite a análise combinada da dinâmica dos ácidos biliares intracelulares e i) localização e/ou abundância de proteínas de interesse, ou ii) sinalização intracelular em uma única célula.

Introdução

Förster Ressonância Energia Transferência (FRET) é amplamente utilizado para obter uma melhor compreensão das funções celulares em células vivas com alta resolução temporal e espacial 1. Na FRET, a energia a partir de um fluoróforo dador animado é transferido para um fluoróforo aceitador. Eficiência de TERF é fortemente dependente da distância entre o fluoróforo dador e o aceitador e a sua orientação e é, por conseguinte, um visor sensível de mudanças conformacionais que afectam os dois fluoróforos. Este fenômeno é explorada para gerar biosensores baseados em FRET para a imagem de pequenas moléculas. Alterações na sua concentração pode ser monitorado à medida que aumenta / diminui na proporção de intensidade de emissão do aceitador em relação ao fluoróforo dador 2. Por exemplo, os biossensores de cálcio baseados em FRET permite a detecção rápida e estável de concentrações de cálcio livres nas células 3 viva. Outras vantagens de biosensores baseados em FRET são imagem latente em células vivas individuais, therdeiro não-invasivo, sua capacidade de ser direcionados para diferentes tipos de células e compartimentos celulares 4.

Muitos aspectos da dinâmica de ácidos biliares intracelular ainda são pouco conhecidos. Por exemplo, pouco se sabe sobre o mecanismo de regulação subjacente de transporte de ácido biliar conjugado e não conjugado. Técnicas existentes para monitorar este transporte fazer uso principalmente de repórteres à base de luciferase, ácidos biliares radiomarcados, ou fluorescentes análogos de ácidos biliares. O último requer a modificação de ácidos biliares, possivelmente afetando suas propriedades. Repórteres à base de luciferase tem resolução de tempo pobre. Além disso, estas técnicas de resultar em perda da amostra e não são aplicáveis ​​para a imagem latente em células individuais. Por isso, seria benéfico utilizar métodos que permitem a imagiologia de célula única ao vivo da actividade de transporte de FRET utilizando biossensores, especialmente uma vez que inclui a vantagem de a detecção raciométrica 5, 6. Embora variantes de CFP / YFP forma mais frequentemente utilizada pares FRET, novas estratégias usando Morange e mCherry transportando mutações auto-associação indutores levaram a uma expansão da caixa de ferramentas FRET com novos sensores, incluindo um sensor de ácido biliar vermelho-deslocada 7.

Nós previamente criado um FRET do sensor geneticamente codificado ácido biliar (BAS), que consiste de um fluoróforo dador (azul celeste) e um fluoróforo aceitador (citrino) que estão fundidos com o receptor X farnesoid (FXR) ligando de domínio de ligação (FXR-LBD) e um péptido que contém um motivo LXXLL 8. Este péptido associados com o FXR-LBD de um modo dependente-ácidos biliares. Após a activação FXR, a distância entre o citrino e azul celeste irá alterar devido a uma alteração conformacional. Em linhas celulares de mamíferos, FXR resultados da activação de um aumento claramente detectável na relação de citrino / azul celeste, enquanto o sensor purificada funciona no sentido oposto e leva a uma diminuição do rácio de FRET após activação FXR. Este sensor (CytoBAS)permite o monitoramento da dinâmica dos ácidos biliares citosólicas. Através da adição do terminal carboxilo de motivos alvo subcelulares, a construção pode ser BAS encaminhada para o núcleo (NucleoBAS) e peroxissomas (PeroxiBAS), permitindo medições de concentrações de ácidos biliares em diferentes compartimentos celulares. Embora a adição do motivo de direccionamento peroxissomal não prejudicar a sua capacidade de resposta aos ácidos biliares, células permeáveis ​​FXR-ligandos não induziu qualquer alteração de FRET PeroxiBAS dentro peroxissomas 8. Como a natureza dessa discrepância é desconhecida, o protocolo abaixo está focada em CytoBAS e NucleoBAS.

A utilização deste sensor de FRET geneticamente codificado foi recentemente demonstrada em células contendo os transportadores de ácido biliar hepáticas Na + / taurocolato de co-transporte polipéptido (NTCP) e soluto orgânico alfa / beta transportador (8) OSTαβ. PNCT é o principal importador de ácido biliar hepática e OSTαβ é um bile intestinal basolateraltransportador de ácido que pode funcionar tanto como um importador e exportador dependente do gradiente de concentração de ácido biliar eletroquímica 9, 10. Dados recentes mostraram que mediante transporte de ácido biliar por NTCP e / ou OSTαβ, respostas rápidas e robustas em relação FRET como um resultado da interacção ligando-FXR-LBD pode ser observada.

Aqui, descrevemos protocolos detalhados para métodos para medir FRET como a análise microscópica confocal e de células activada por fluorescência (FACS), realce passos críticos, face a eventuais problemas e discutir métodos alternativos. Usando este sensor de FRET geneticamente codificado, interacção de ácidos biliares com FXR-LBD pode ser quantificado e monitorada directamente em células vivas e proporciona um método rápido e simples de visualizar transporte de ácido biliar e dinâmica em tempo real. Plasmídeos de expressão de mamífero que codifica CytoBAS NucleoBAS e estão comercialmente disponíveis. Portanto, esse biosensor pode contribuir ainda mais para ocompreensão dos transportadores de ácidos biliares ou compostos que ativam FXR e fornecem uma visão mais profunda da biologia ácido biliar e sinalização.

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Protocolo

1. Transient Transfection

Nota: CytoBAS e NucleoBAS (Por favor veja Materiais Tabela) são utilizados com sucesso em vários tipos de células, (U2OS, Huh7, HepG2, H69, MDCK e células HEK293T). O principal requisito para utilizar o sensor é que ele tem de ser expresso, requer a ADN que codifica para entrar na célula.

  1. Células colheita de uma confluência de 80% 25 cm2 balão. Diluir as células em meio de cultura completo adequados para a linha celular específica (10% de FBS, 1% de L-glutamina, 1% de pen / strep para as células U2OS e Huh7).
  2. As células em placas a densidade desejada para uma estéril 8 bem compartimentado tampa de vidro (0,8 cm 2). Alvo para uma sub-confluentes (60-80% de confluência) camada de células no dia da experiência, embora isso não seja essencial.
  3. Adicionar meio de cultura completo para um volume final de 400 ul por poço. Permitir que as células aderir durante 24 horas.
  4. Preparar a mistura de transfecção em um tubo estéril por adição de 0,5 ng de NucleoBASou DNA CytoBAS para 100 ul de meio de cultura (soro / antibiótico livre). Vortex bem. Adicionar um reagente de transfecção e misture por vórtex. Reagentes de transfecção que dão máxima eficiência são tipo de célula dependente e pode exigir testes antes.
    1. Por exemplo, usar 2,5 ul de 1 mg / mL de polietilenimina (PEI) e incuba-se o ADN / PEI misturar durante 15 min à temperatura ambiente.
  5. Adicionar a mistura de transfecção em gotas para misturar as células e agitando suavemente a placa bem à mão. Adicionar 100 ul da mistura para um poço de 9,6 cm ~ 2. Utilizar 10 ul da mistura de transfecção para câmaras de imagem individuais para as células transf ectadas transitoriamente.
    Nota: Após 24-48 horas, as células irão expressar o sensor de ácidos biliares e pode ser utilizado para experiências.

2. Transfecção Estável

  1. Células colheita de uma confluência de 80% 25 cm2 balão. Diluir sedimento em meio de cultura completo adequado para a linha celular específica (10% Fetal Bovino Serum, 1% de L-glutamina, 1% de pen / strep para as células U2OS e Huh7) a uma concentração de 150.000 células por ml e adicionar cerca de 300.000 células por cavidade em uma placa de cultura de 6 poços (2 ml de volume final).
  2. Permitir que as células aderir durante 24 horas.
  3. Preparar a mistura de transfecção em um tubo estéril por adição de 0,5 ug de ADN ou CytoBAS NucleoBAS (Por favor ver Materiais Tabela) a 100 ul de meio de cultura (de soro / livre antibiótico). Vortex bem. Adicionar um reagente de transfecção e misture por vórtex.
    1. Por exemplo, usar 2,5 ul de 1 mg / mL de polietilenimina (PEI) e incuba-se o ADN / PEI misturar durante 15 min à temperatura ambiente.
  4. Adicionar 100 ul da mistura de transfecção em gotas para misturar as células e agitando suavemente a placa bem à mão. Sempre inclua um controle não transfectada ao criar uma linha celular estável.
  5. Cultivar células O / N a 37 ° C, 5% de CO 2.
  6. Tripsinizar as células de acordo com o protocolo do fabricante (Incubar as células a 37 ° C wom 1,5 ml pré-aquecido de tripsina por 25 de 2 cm de cultura de células) e colocá-los para baixo a 250 xg à temperatura ambiente durante 5 min. Remover as células e ressuspender em sobrenadante 13 ml de meio de cultura completo. Divida as células através de várias placas de cultura de 10 cm de diâmetro: 0,5 ml (baixa densidade), 1,5 ml (de média densidade), e 4,5 ml (alta densidade). Faça o mesmo para os restantes 6,5 ml.
  7. Adicionar meio de cultura a um volume final de 10 ml. Para células U2OS, utilizar 800 ug / ml de G418 para plasmídeos com a cassete de resistência à neomicina, tal como os CytoBAS e NucleoBAS constrói para seleccionar células positivas. Este tipo de célula concentrações é dependente e pode ser determinado pela selecção do menor antibióticos (G418) de concentração onde não transfectadas células morreram dentro de 2 dias a 10 (800 ug / ml de G418 para células U2OS).
  8. Atualizar o meio de cultura com o antibiótico adequado (G418) a cada 72 horas até que as células não transfectadas estão mortos.
  9. Examinar a placa de cultura sob o microscópio com uma objectiva de 20x decolónias positivas (fluorescência pode ser monitorado usando a maioria dos conjuntos de filtros usados ​​para verde, ciano ou fluorescência amarela).
  10. Marque as colónias positivas que estão isoladas de outras colônias com uma caneta na parte inferior exterior da placa de cultura.
  11. Lava-se a placa duas vezes com Solução Salina Tamponada com Fosfato (PBS) e aspira-lo. Tome cerca de 15 cilindros de clonagem estéreis e mergulhá-los em silicone estéril. Aplique-os em torno das colônias selecionados pressionando levemente a placa de petri e certifique-se que não mais de uma colônia está incluído no anel de clonagem.
  12. Pipetar 20 ul de tripsina pré-aquecido (1x, 0,25%) no cilindro de clonagem e incubar a 37 ° C até que a maioria das células foram arredondados para cima (observar com um microscópio).
  13. Adicionar 150 ul de meio de cultura com soro e o antibiótico adequado (FBS a 10% e 800 ug / ml de G418 para células U2OS e Huh7) no cilindro de clonagem e pipetar para cima e para baixo várias vezes para voltar a suspender as células e transferir para um 96-bem placa. Actualizar médio após 4-24 h e permitir que as células crescem confluente nos próximos dias (37 ° C, 5% de CO 2 por células U2OS e Huh7).
  14. Atualizar meio com antibiótico a cada 3 ou 4 dias. Quando as células cresceram confluentes, transferi-los para uma placa de maior. Repita este passo até que a cultura é grande o suficiente para experimentos. Criopreservar alguns frascos para backup. Meio de criopreservação consiste em 20% de FBS e 20% de DMSO em meio (DMEM) sem suplementos.
    Nota: Agora, a linha celular monoclonal e é considerada estável para expressar o sensor de ácidos biliares. Metade da concentração do antibiótico G418 (400 ug / ml) é agora suficiente para manter a expressão na linha de células estável.

3. Transdução Lentivirus

Nota: Alguns linhas de células são consideradas difíceis de transfectar por métodos mais tradicionais, tais como o método de polietilenimina (PEI). Transdução viral das células é uma ferramenta alternativa eficiente fou de administração de genes e expressão do transgene estável.

  1. Células colheita de uma confluência de 80% 25 cm2 balão. Diluir as células em meio de cultura completo, adequado para a linha celular específica (10% de FBS, 1% de L-glutamina, 1% de pen / strep para as células U2OS e Huh7) e adicionar cerca de 200.000 células por poço numa placa de cultura de 6 poços.
  2. Adicionar meio de cultura a um volume final de 2 ml por poço. Permitir que as células aderir durante 24 horas.
  3. Execute transduções virais por células incubação durante 4-6 horas com 500 ul CytoBAS lentivírus contendo meio (disponível mediante solicitação) cheia até um montante total de 1 ml com meio de cultura completo contendo 10 ug / ml de dietilaminoetilo (DEAE) -dextrano ou outro lentiviral intensificador de transdução. Não se esqueça de incluir um poço com células de controlo não transduzidas.
  4. Remover o meio e adicionar 2 ml de meio de cultura completo contendo o antibiótico desejado (500 ug / ml de higromicina). Utilize uma construção de lentivírus para CytoBAS transdução que fornecems às células resistência a higromicina. Cultivar células sob condições desejadas.
  5. Actualizar meio com (500 ug / ml de higromicina) antibiótico a cada 3 dias e dividir as células quando 80% confluentes, até que todas as células de controlo negativo são mortos (leva cerca de 1-2 semanas para a maioria das linhas de células). A linha de células é agora considerada estável para expressar o sensor de ácidos biliares.
    1. Em alternativa, utilize células para experiências de 1-3 dias após a transdução viral. Como o vírus vivo pode estar presente, isso requer equipamentos FRET-leitura em quartos com o nível de segurança adequado.
  6. Alternativamente, para rápido isolamento de linhas celulares estáveis, executar fluorescência de células activadas (FACS).
    1. Células colheita de um confluente 160 centímetros 2 balão.
    2. Diluir as células em meio de cultura de Leibovitz (meio L-15), com <5% de soro a uma concentração de no máximo 5 x 10 6 células por ml
    3. Para a coleta de células separadas, preencher tubos de FACS com 1 ml de meio de recolha (L-15 médio + 1,5% pen / strep, 1% de L-excesso e 20% de soro).
    4. Classificar células para citrino (520-580 nm) ou cerúleo (450-520 nm), excitados com 405 laser.
    5. Após a separação de aproximadamente 500.000 células, girar as células (5 min, 250 x g) e ressuspender-los em 5 ml de meio normal de cultura completo (10% de FBS, 250 ug / ml de higromicina para as células U2OS e Huh7 CytoBAS) e placa-los em uma cultura T25 Garrafa. Cultivar células sob condições desejadas (37 ° C, 5% de CO 2 por células U2OS e Huh7).

4. Imagens de células vivas do Sensor Ácido Bile

Nota: As células que contêm transportadores dos ácidos biliares podem ser cultivadas num meio com 1-10% de soro filtrou-carvão que remove compostos lipofílicos. Soro normal geralmente contém ácidos biliares que podem levar a acumulação de ácidos biliares intra e saturação do Sensor ácidos biliares.

  1. Medições FRET utilizando o microscópio confocal
    1. Placa as células de forma estável ou transiently expressando o sensor a uma densidade desejada para uma lamela esterilizada 8 bem fundo câmara de corrediça (0,8 cm 2). Cultivar células em meio de cultura completo (com soro filtrou-carvão), de modo que no dia da experiência, é de cerca de confluência de 60-70%.
    2. Lavam-se as células aderentes em câmara de corrediça, uma vez com 200 ul de 1x PBS ou Leibovitz L-15, meio de cultura.
    3. Aspirar e substituir com 300 ul de meio L-15 de Leibovitz cultura de modo que nenhum CO2 controlo é necessário.
      Nota: DMEM sem vermelho de fenol podem ser utilizados, assim como CO 2, mas requer condições tampão. Os shows de sensores de ácidos biliares (alguns) pH-sensibilidade de modo objetivo para manter o pH constante durante a coleta de dados.
    4. Dilui-se os compostos a serem utilizados na experiência de imagem confocal também em meio L-15 de cultura. Levar em conta que durante o exame, quantidades relativamente grandes de líquido nas câmaras têm que ser adicionados para assegurar uma mistura rápida da amostra (50-100 ul),assim que soluções 3-5x.
    5. Inicie o software de imagem de um microscópio confocal com uma temperatura de 37 ° C câmara de incubação e ligue o laser violeta 405 nm. Coloque uma gota de óleo de imersão para o objetivo e colocar a 8 câmaras em cima dela. Para imagens de células única de FRET, utilize o objetivo de petróleo 63X. O sensor tem sido utilizada com sucesso, à TA, mas o comportamento celular pode ser alterada.
    6. Defina as configurações do microscópio confocal corretamente.
      1. Defina o modo de aquisição: XYT (time-lapse imagem de plano focal único).
      2. Adquirir imagens em intervalos de 20 segundos para permitir que os compostos a ser adicionado entre as aquisições sem interromper a experiência.
      3. Definir faixa espectral para detecção de emissão: Cerulean: 450-520 nm; Citrino: 520-580 nm.
    7. Concentre-se na camada única célula usando a luz de transiluminação. Comece imagiologia e ajustar a posição z mais precisamente. Ajuste o ganho e offset para cada canal de distinguir sinal de fundo, enquanto permaneceming bem abaixo da saturação para todos os pixels em células de interesse.
    8. Desenhar círculos para definir a região de interesse (ROI). Selecione as células que mostram a intensidade de fluorescência semelhante. Evitar células que, obviamente, diferentes dos da célula média em tamanho e forma. Expor as células à luz durante um tempo tão curto quanto possível para minimizar a fotodegradação do sensor. É aconselhável chamar ROIs não muito perto do perímetro celular. Esta área é mais sensível às mudanças na intensidade de fluorescência devido à deriva focal (células que se deslocam em direção z) tornando-o mais difícil de monitorar as mudanças na proporção de fluorescência durante o experimento.
    9. Comece medidas com o microscópio confocal. Aguarde até que a fluorescência cerúleo e citrino é estável.
    10. Adicionar 50-100 ul ácidos biliares ou outros compostos em pontos de tempo seleccionados durante a medição. As quantidades relativamente altas de líquido (de um quinto a um terço do volume final) são necessárias para misturar fluidos de poço (dentro de 10 segundos) sem agitação / pipetting cima e para baixo. Certifique-se de não tocar na borda da câmara de 8 poços com a ponta da pipeta e adicionar o líquido lentamente, de modo que as células não sair de foco. Não adicione novos compostos antes da fase de platô é atingido. Isso leva cerca de 200 seg.
    11. Terminar cada experiência com a adição de 100 ul GW4064, concentração final de 5-10 | iM (dose de saturação do sensor) e esperar até que o sensor de fluorescência é estável.
    12. Salve o experimento e exportar os dados como um arquivo .AVI.
    13. Open in ImageJ ambos os arquivos AVI (canal 00, cerulean; canalizar 01, citrino) selecionando interleaver Plugins> Pilhas> Stack. Alternativamente, arquivo confocal de importação (por exemplo, .lsm ou arquivos .lif) diretamente em Image J usando plugins apropriados (disponíveis em http://www.openmicroscopy.org) e mover-se para a etapa 4.1.14.
      1. Para Stack 1: usar Canal 01 (citrino).
      2. Para Stack 2: usar Canal 00 (cerúleo).
    14. Clique em Editar> Seleção> Adicionara gerente, para abrir a janela do gerenciador de ROI. Marque a opção 'Mostrar Todos'.
    15. Desenhe algumas regiões de interesse (ROI), abrangendo células específicas com a ferramenta de seleção oval. Também desenhe um círculo numa zona fora das células ou no interior de uma célula que não expresse o sensor para determinar o sinal de fundo. É aconselhável chamar ROIs não muito perto do perímetro de células em experimentos quando as mudanças na intensidade de fluorescência devido à deriva focal (células que se deslocam em direção z) ou a migração de células eram óbvias.
    16. Selecione uma célula. Clique em Plugins> Rácio Profiler. Isso resultará em 3 telas: RAW, razão e Ratio_Profile. A janela RAW mostra o aumento da intensidade do citrino (linha azul) e uma diminuição no cerúleo (linha vermelha) se houver FRET. O Rácio de janela dá informação sobre a relação citrino / azul celeste, o que irá aumentar com o aumento da TERF. A janela Ratio_Profile dá o número real de intensidade de fluorescência medido em ambos os canais. Se microslidar arquivos específicos de configuração (por exemplo, .lsm ou .lif em vez de .avi) arquivos são usados ​​a ordem dos canais pode ser revertida.
    17. Copiar os dados a partir da janela Ratio_Profile da planilha em anexo como dados complementares. Faça o mesmo para todas as outras células e fundo (ROI).
      Nota: Na planilha on-line, todos os dados é normalizada para a condição em que se espera a ativação máxima BAS. Dado que é o GW4064 activador mais potente dos FXR, a taxa de fluorescência após a incubação com um excesso de GW4064 é definido como 1. Por conseguinte, é importante para terminar todas as experiências com a adição de GW4064. A vantagem disto é que os dados já não está dependente da intensidade do laser ou ganho do detector e experimentos em dias diferentes podem ser comparados com mais facilidade. Além disso, no diagrama inferior da folha de cálculo, uma média de execução pode ser usado para suavizar as curvas para o ruído experimental. No entanto, não use este gráfico ao analisar dados cinéticos, uma vez que o avera executandoA GE também respostas cinéticas rápidas lisas.
  2. FRET utilizando medições de fluorescência de células activadas (FACS)
    1. Dilui-se todos os compostos para o ensaio de FACS em tampão FACS estéreis absorção (EDTA 0,3 mM, 0,5% de BSA, 0,01% de NaN3 e 10 mM de D-glucose).
    2. Células colheita de um cm2 garrafa de cultura de célula 80% confluentes T-160 utilizando EDTA 5 mM em PBS. Centrifugar células a 250 xg durante 5 minutos. Lavar 2x sedimento celular em 5 ml de tampão de FACS absorção à temperatura ambiente.
    3. Contagem de células utilizando o contador de Coulter ou numa câmara de contagem.
    4. Diluir em tampão de captação de grânulo de FACS a uma concentração de 1 x 10 6 células / ml. Pipeta cima e para baixo para criar uma suspensão homogénea de células individuais. Se as células são difíceis de desagregar, colocar as amostras através de um filtro de células antes de classificar para minimizar entupimentos.
    5. Pipet 200 células ul por tubo FACS e protegê-los da luz.
    6. Adicionar a concentração desejada do composto (por exemplo,, Ácidos biliares, ligandos de FXR sintéticos, inibidores do transportador). Vórtice. Incubar durante 20-30 minutos à temperatura ambiente, com agitação (no escuro).
    7. Enquanto isso, inicie os FACS (os lasers precisam de tempo para se aquecer).
    8. Definir a citometria de fluxo para os parâmetros de propagação da experiência (ver Figura 3):
      1. Carregar em torno de 100.000-200.000 NucleoBAS ou CytoBAS células transfectadas para determinar as portas.
      2. Primeiro ajustar as tensões FSC e SSC para traçar as células no centro da trama.
      3. Usando o laser violeta, ajustar o cerúleo (450/40 nm) valor de tensão e citrino (525/20 nm) tensão e garantir que todos os NucleoBAS ou CytoBAS células positivas são plotados no gráfico de dispersão.
      4. Defina as portas corretas (Portão P1 até Portão P4), consulte a Figura 4.
        1. Use porta P1 para excluir as células mortas, geralmente apresentados no canto inferior esquerdo, seleccionando a população principal no meio do CCD-A / FSC-A trama.
        2. Use porta em P2o FSC-H / FSC-A janela para remover dupletos de análise. Células individuais são apresentadas em uma linha diagonal mais do que doublets.
        3. Portão P3 no citrino (525/20 nm) / cerúleo (450/40 nm) janela pode ser usado para selecionar para NucleoBAS / CytoBAS células positivas, por gating citrino e de células de alta cerúleo, uma população exibido na diagonal no canto superior direito o enredo.
        4. Desenhe portão P4 no canto superior esquerdo da população, o mais próximo possível e certifique-se que não mais de 5% das células são abrangidas por esta porta.
      5. Coloque algumas células não transfectadas (sem expressão de CytoBAS ou NucleoBAS) para determinar auto-fluorescência. A população não transfectadas não pode ser localizado na porta P3. Ajuste porta P3 quando necessário excluir as células auto-fluorescente.
    9. Agitar as amostras antes da colocação dos tubos no FACS. Para cada amostra, medir pelo menos 10.000 células no portão P3.
      Nota: A Janela Hierarquia População dá o número de eventosque está sendo exibido para cada portão e% do portão principal. No portão 4, o% dos pais afirma células com um aumento / rácio cerúleo citrino como uma porcentagem de todas as NucleoBAS células positivas.

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Resultados

O sensor de FRET-BAS apresentada baseia-se no domínio de FXR (LBD-FXR) de ligação ao ligando ligado a dois fluoróforos de citrino e cerúleas) e um motivo LXXLL. Este sensor permite investigações de transporte de ácido biliar em células com elevada resolução espacial e temporal (Figura 1 A) vivas. Mutações em celeste e citrino foram aplicados para promover a formação do complexo intramolecular (Figura 1 <...

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Discussão

Aqui é apresentado um protocolo detalhado para a utilização de um sensor de ácido biliar romance geneticamente codificado capaz de controlar a dinâmica espaço-temporais de transporte de ácido biliar em células vivas. Este biossensor consiste em proteínas fluorescentes cerúleas e citrino que são fundidos para FXR-LBD, formando deste modo um sensor de ácido biliar à base de FRET (BAS).

O Sensor Ácido Bile é relativamente simples e conveniente em uso quando se tem experiência básica com cultura...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por bolsas iniciais do ERC (ERC-2011-StG 280255 e ERC-2013-StG 337479) e pela Organização Holandesa para Pesquisa e Desenvolvimento em Saúde (Vidi 91713319).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
CytoBAS Addgene62860
NucleoBAS Addgene62861
Meio de Eagles modificado de Dulbecco (DMEM)LonzaBE12-614FGlicose alta sem L-glutamina
Penicilina-Estreptomicina (caneta/estreptococo)Lonza17-602E
L-glutamina (200mM)Soro Fetal Bovino Lonza17-605E
(FBS)Invitrogen102-70
Tripsina-EDTA (10x)BalãoCC-5012
T-25VWR international392-0253
Balão de cultura de células T-175VWR international392-0238revestida com laminina
VWR international734-0229Placa de 10 cm revestida com poli-L-lisina e laminina
VWR international392-0243Revestida com laminina
Dietilaminoetil (DEAE) - DextranSigma-AldrichD9885
Polietilenimina (PEI) Brunschwig23966-2
G418 (geneticina) 50 mg/mlInvitrogen10131-027
Higromicina B, 50 mg/mlInvitrogen10687-010
Cilindro de clonagem (6 x 8 mm)Bellco2090-00608
L-15 Leibovitz meio de culturaInvitrogen21083-027Sem vermelho de
fenol Tubo de fundo redondo de poliestireno (5 ml) Tubo FacsFalcon BD352008Sem tampa, não estéril
Falcon 2.063 tubos (5 ml)Falcon BD352063Tampa de pressão, estéril
Nunc Lab-Tek 8 poços de vidroThermo scientific155409Estéril
Filtrado por carvão FBSLife technologies12676011
GW4064Sigma-AldrichG5172
TCDCASigma-AldrichT6260
CDCASigma-AldrichC9377
Outros produtos químicosSigma-Aldrichn.v.t.
de cultura de células Lonza revestido com laminina Placa de 6 poços

Referências

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