O primeiro passo no ciclo de vida do arenavírus é a ligação de partículas virais às células hospedeiras. Relatamos um ensaio quantitativo baseado em (q)RT-PCR para detecção ultrassensível e quantificação de eventos de ligação ao arenavírus.
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Artigo de método
Ensaio altamente sensível para a medição do Anexo de células Arenavirus
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os arenavírus são uma família de vírus de RNA envelopados que causam doenças humanas graves. O primeiro passo no ciclo de vida do arenavírus é a fixação de partículas virais às células hospedeiras. Embora a ligação vírus-célula possa ser medida através do uso de vírions marcados com biotina, isótopos radioativos ou corantes fluorescentes, essas abordagens normalmente requerem altas multiplicidades de infecção (MOI) para permitir a detecção de vírus ligados. Descrevemos um ensaio quantitativo baseado em (q)RT-PCR que mede a ligação da cepa do vírus Junin Candid 1 por meio da quantificação do RNA genômico viral empacotado com vírion. Este ensaio tem várias vantagens, incluindo sua extrema sensibilidade e capacidade de medir a ligação em uma grande faixa dinâmica de MOIs sem a necessidade de purificar ou rotular vírus de entrada. É importante ressaltar que essa abordagem pode ser facilmente adaptada para uso com outros vírus por meio do uso de reagentes qRT-PCR específicos para vírus. Além disso, este ensaio pode ser modificado para permitir a medição da endocitose de partículas e o desrevestimento do genoma. Em conclusão, descrevemos um ensaio simples, mas robusto, para medição altamente sensível da ligação de células de arenavírus.
Introdução
Arenavírus são uma família de vírus com envelope, de ARN de cadeia simples que são mantidas essencialmente em roedores na natureza 1-3. Embora estes vírus tipicamente estabelecer uma infecção assintomática, persistente em reservatórios de roedores 1,2, que pode causar doença grave em humanos 3. Espécies patogênicas importantes incluem o vírus Novo Mundo Junin (JUNV) 4 e o vírus Old Lassa Mundial 5, que são os agentes etiológicos da febre hemorrágica argentina na América do Sul e da febre de Lassa na África, respectivamente. Vírus da coriomeningite linfocítica (LCMV), o vírus protótipo da família 6, tem....
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Protocolo
Nota: É crítico que o protocolo descrito ser realizada utilizando rigorosa técnica de pré-PCR (ver 28 para uma excelente visão geral sobre como configurar um laboratório de pré-PCR e como conduzir experimentos usando boa técnica de pré-PCR). É imperativo que todos os reagentes e equipamentos são livres de DNA amplificado contendo a sequência alvo qPCR e que os controles apropriados estão no local para detectar a contaminação. Uma visão geral do protocolo é demonstrado na Figura 1.
1. Prepare Mídia e células de sementes em placas de 48 poços
- Preparar 500 ml de completa de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) contendo sor....
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Resultados
Para demonstrar a sensibilidade e gama dinâmica do ensaio qPCR, quantidades conhecidas de um plasmídeo que codifica o gene NP de JUNV C # 1 (intervalo 5-5 x 10 7 cópias) foram submetidos a qPCR como descrito na Seção 4 do protocolo. O ensaio é sensível e pode detectar de forma fiável tão poucos como 5 cópias do ácido nucleico alvo (Figura 2). Além disso, a gama dinâmica do ensaio é grande e, como mostrado na Figura 2, pode cobrir, pelo menos, .......
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Discussão
O protocolo que descrevemos é simples e robusta desde que as seguintes considerações críticas são observadas. Em primeiro lugar, rigorosa técnica de pré-PCR deve ser empregado (ver 28 para uma excelente revisão). É imperativo que todos os reagentes e equipamentos são livres de DNA amplificado contendo a sequência alvo qPCR e que os controles apropriados estão no local para detectar a contaminação. Em segundo lugar, para a parte de fixação de células com vírus do protocolo, o vírus, células e meios de comunica.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Agradecemos Markus Thali, Nathan Roy, Christopher Ziegler, Emily Bruce, e Benjamim Rei para discussões úteis e os Institutos Nacionais de Saúde para apoio a estes estudos por meio de doações T32 AI055402 (JK), R21 AI088059 (JB), e P20RR021905 (JB) .
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| DMEM | Life Technologies | 11965-118 | |
| Penicilina-Estreptomicina | Life Technologies | 15140-163 | 100x |
| Solução Tampão HEPES | Life Technologies | 15630-130 | 100x |
| PBS pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | 1x |
| células Vero E6 Coleção | de Cultura American Type | CRL-1586 | |
| Kit mini Costar de 48 poços | Corning | 3548 | |
| RNeasy | Qiagen | 74106 | não misture buffers RLT ou RW1 com alvejante |
| QIAshredder homogeneizador | Qiagen | 79654 | |
| Taqman Universal PCR Master | Mix Life Technologies | 4326614 | |
| Multiscribe Transcriptase Reversa (50U/µ l) | Mistura | de 4311235 | |
| dNTP da Life Technologies (10 mM; 2,5 mM cada dNTP) | Life Technologies | N808-0260 | |
| GeneAmp 10X PCR Buffer II e solução de 25 mM MgCl2 | Life Technologies | N808-0010 | |
| Inibidor de RNase (5000U / 100 µ l) | Primer Life Technologies | N808-0119 | |
| RT 5'-AAGGGTTTAAAAAT GGTAGCAGAC-3' | Integrated DNA Technologies | 250 nmol DNA oligo | padrão dessalinização |
| Forward qPCR primer 5'-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3' | Life Technologies | 4304971 | de dessalinização padrão |
| 5'-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3' | Sonda | de dessalinização padrão | Life |
| 4304971 5'-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3' | |||
| Placa de reação óptica rápida de 96 poços purificada por HPLC da Life Technologies 4316033 (0,1 mL) | Life Technologies | 4346906 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Life Technologies | 4376598 | ou outro instrumento de qPCR |
Referências
- Childs, J. C., Peters, C. J. The Arenaviridae. Salvato, M. S. , Plenum Press. 331-373 (1993).
- Salazar-Bravo, J., Ruedas, L. A., Yates, T. L. Mammalian reservoirs of arenaviruses. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 262, 25-63 (2002).
- Buchmeier, M. J., de la Torre, J. C., Peters, C. J., et al. Ch. 50.
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Reimpressões e permissões
