Aqui está um protocolo para cultivar células-tronco pluripotentes (PSC) e células-tronco neurais (NSC) em um sistema de cultura de células fechado que permite máxima esterilidade e reprodutibilidade, substituindo o tradicional gabinete de biossegurança e incubadora. Este equipamento atende às diretrizes de boas práticas clínicas de fabricação (cGMP) e boas práticas clínicas de laboratório (cGLP).
Artigo de método
Cultura pluripotentes humanas e células-tronco neurais em um sistema de cultura celular fechado de Pesquisa Básica e pré-clínica
Neste artigo
Resumo
Resumo
Este artigo descreve como usar um sistema de cultura de células fechadas fabricado sob medida e comercialmente disponível para pesquisa básica e pré-clínica. Gabinetes de biossegurança (BSCs) e incubadoras têm sido o padrão para cultura e expansão de linhagens celulares para pesquisa básica e pré-clínica. No entanto, como o foco de muitos laboratórios de células-tronco muda da pesquisa básica para a tradução clínica, são necessários requisitos adicionais do sistema de cultura celular. Todos os processos devem ser bem documentados e ter requisitos excepcionais de esterilidade e reprodutibilidade. Nas incubadoras tradicionais, as concentrações de gás e as temperaturas flutuam amplamente sempre que as células são removidas para alimentação, passagem ou outras manipulações. Tais interrupções contribuem para um ambiente que não é o padrão para as diretrizes cGMP e GLP. Essas interrupções devem ser minimizadas, especialmente quando as células são utilizadas para fins terapêuticos. A motivação para passar do BSC padrão e do sistema de incubadora para um sistema fechado é que essas interrupções podem ser insignificantes. Os sistemas fechados fornecem um espaço de trabalho para alimentar e manipular culturas de células e mantê-las em um ambiente controlado, onde a temperatura e as concentrações de gases são consistentes. Dessa forma, as células-tronco pluripotentes e multipotentes podem ser mantidas em ótima saúde desde o momento de sua derivação até seu eventual uso na terapia.
Introdução
As técnicas padrão de cultura de células-tronco sofrem de várias restrições ambientais que colocam tensões indevidas nas células e expõem as células a riscos inaceitáveis de contaminação. Entre os estresses que as células podem suportar sob condições padrão de cultura de células estão mudanças precipitadas nos níveis de dióxido de carbono e concentrações de oxigênio3,4. Isso ocorre quando as células são movidas da incubadora para o gabinete de biossegurança e/ou microscópio, o que pode não ser ideal para as células. Estudos anteriores confirmaram as vantagens da cultura de células-tronco pluripotentes e neurais em condições hipóxicas4,11 e, para obter melhores resultados, essas condições precisam ser contínuas. Além disso, os riscos de contaminação celular são maiores, pois o ambiente de laboratório e o pessoal colidem com as células em quase todas as etapas de sua cultura e manipulação. As salas limpas tradicionais compreendem um método eficaz para diminuir muito os riscos de contaminação, mas são caras, ocupam muito espaço e não abordam os estressores relacionados às concentrações de dióxido de carbono e oxigênio.
Uma instalação de produção de células que pode lidar com riscos de contaminação e concentrações de gases e que pode ser qualificada para atender aos critérios cGMP9 fornece células de alta qualidade para pesquisa científica básica, bem como aplicações clínicas1,6,7. Essa instalação de produção de células consiste, no mínimo, nos seguintes componentes: uma câmara de processo, que atua como um espaço de trabalho aquecido para a alimentação e manipulação de culturas de células; uma capela de fluxo laminar, para a esterilização inicial de reagentes, tubos e ferramentas; duas câmaras de câmara de ar de amortecimento entre o exaustor e a câmara de processo; duas incubadoras de cultura de células acessíveis a partir da câmara de processo; uma câmara de microscópio adjacente à câmara de processo; e, finalmente, software de computador para definir e monitorar as condições dentro desses módulos. Usando essa infraestrutura básica, uma ampla variedade de tarefas pode ser executada, como alimentação padrão e passagem de células-tronco pluripotentes e células-tronco neurais multipotentes, bem como métodos mais especializados, como reprogramação baseada em vírus Sendai, estudos de migração in vitro e diferenciação de células-tronco neurais para caracterização eletrofisiológica.
Protocolo
1. Configuração inicial
- Definir as concentrações de gases e temperatura
- Usando o software, clique na guia "Guest", localizado no canto superior esquerdo da interface gráfica. Entre para o sistema usando um nome de usuário e senha designado. Certifique-se de que cada usuário tem seu próprio nome de usuário e senha.
- Clique sobre um módulo para ajustar (Figura 1). Dentro da nova janela que exibe as configurações atuais, clique no valor de ponto existente O 2 set abaixo "ponto de Ajuste" e digite o nível de concentração de O2 necessária para este módulo. Entre 5% de O2 se células estaminais pluripotentes vai ser cultivada ou manipulado neste módulo, e 9% O 2 se células estaminais neurais vai ser cultivada ou manipulado. Clique na marca de seleção verde para confirmar o ponto de ajuste.
Nota: Dois módulos não são de gás ajustável: a capa laminar, e a câmara de microscópio. As concentrações de gases na câmara de fluxo laminar são whil atmosféricae aqueles na câmara de microscópio são mantidas por passivamente das concentrações dos gases na câmara de processo. - Repita este passo para CO 2. Insira um ponto de 5% de CO 2 set para todos os módulos, exceto para as câmaras de amortecimento, que só são ajustáveis para O 2.
- Monitorar as concentrações de gás atuais, que são rotulados como "valores de processo", para se certificar de que eles atinjam os novos pontos de ajuste.
- Ajuste os pontos de ajuste de gás de todos os módulos para os valores adequados. Combine as CO 2 e O 2 níveis de câmaras que serão expostos um ao outro. Por exemplo, ajustar a câmara de processo para 5% de O2 antes de abrir uma incubadora que cresce em células de 5% de O 2. Também ajustar para 5% de O2 qualquer câmara tampão que é usado para adicionar artigos para a câmara de processo durante este tempo.
- Ajustar a temperatura da câmara de processo a 37 ° C, usando a mesma tela para ajustamentos a gás. Além disso, definir o processo de câmara de fLoor temperatura para 37 ° C.
- Clique nas margens do módulo de incubação debaixo de cada incubadora. Ajustar a temperatura dos bancos para 37 ° C.
- Operação de tampão Chambers
- Reúna todos os suprimentos necessários para a tarefa dada (alimentação, separação, coloração, etc.) no início para evitar um atraso no fluxo de trabalho. Liberalmente pulverizar todos os materiais com etanol a 70% e deixar secar na capa laminar. Não pulverizar frascos ou placas de células - limpe-as delicadamente com uma esponja gaze estéril saturado com 70% de etanol.
- Certifique-se de ambas as portas exteriores e interiores da câmara de buffer são bem fechada. Em seguida, abra a porta do lado de fora, e colocar os itens dentro.
- Feche a porta exterior. Dentro do software, selecione o módulo de buffer, e clique na guia fator de diluição. Digite 1 na caixa de fator de log. Clique em Iniciar.
Nota: A "factor de diluição" é definido como significando que a atmosfera do módulo de bufferser evacuado e substituído com um tempo de gás limpo, filtrado HEPA. - Uma vez que a interface gráfica parou de piscar "factor de diluição", abrir a porta interna da câmara tampão e trazer os materiais no interior da câmara de processo.
Atenção: Não permita que as portas internas e externas para nunca ser abertos ao mesmo tempo e não abrir a porta interna se a câmara de buffer não foi submetido a um fator de diluição. - A fim de remover artigos da câmara de processo, por um lado assegurar que a câmara tampão foi submetido a um factor de diluição. Em seguida, abra a porta interna, coloque os itens a serem removidos para dentro e feche a porta interna. Em seguida, abra a porta externa e remover os itens.
Nota: um factor de diluição não necessita de ser executado antes de abrir a porta exterior.
2. Introdução e alimentação Células
- Setup incubadora
- Colocar 3 caixas de Petri na panela de água na base de cada incubadora. Preencher esses pratos com sterile água. Não encha diretamente a panela de água. Manter o nível de água nestes pratos, como eles são críticos para manter o ponto de ajuste de humidade relativa (RH) nas incubadoras.
- Dentro da interface gráfica, clique na incubadora. Clique sobre o valor existente para umidade relativa (UR), sob ponto de ajuste e entrar 85%. Clique na marca de seleção verde para aceitar este valor.
- Preparação da instalação de produção de célula de células
- Se ainda não tiver feito isso, ajustar as câmaras de buffer, a câmara de processo, e uma incubadora para os pontos de ajuste de gás necessários para o tipo de célula que está sendo introduzido.
- Limpar a superfície da câmara de processo com uma gaze estéril e um desinfectante não inflamável. Não utilizar qualquer desinfectante à base de ácido peracético, como num sistema fechado, o forte, vapores remanescentes são tóxicos para células de mamíferos. Em vez disso, usar produtos à base de cloreto de benzalcónio.
- Continuar a desinfecção. Limpe as luvas e superfícies que são commoomente tocou, como maçanetas. Utilizar o desinfectante completamente, mas fracamente, como o excesso de líquido na câmara de processo vai contribuir para a humidade, condensação e possível o crescimento microbiano.
- Limpar a superfície da câmara de fluxo laminar e o tampão câmara com 70% de etanol, e deixá-la secar. Colocar o balão ou placa de células (no nosso caso, PSCs ou NCCC) na capa, e brevemente limpe a sua superfície exterior com uma esponja gaze estéril saturado com etanol.
- Coloque o frasco ou placa na câmara de buffer, e executar um factor de diluição (passo 1.2.3).
- Após a conclusão do factor de diluição, se mover imediatamente o frasco ou placa para a incubadora apropriado. Como as incubadoras são na parte de trás da câmara de processamento, uma prateleira puxar para fora na câmara de processo para a colocação da pilha. Evitar a abertura das portas da incubadora desnecessariamente ou por longos períodos de tempo, como o ar da câmara de processo é muito seco comparada com a das incubadoras, e irá resultar numa significativaperda de umidade na incubadora.
- Alimentando Cell Cultures
- Reunir os componentes do meio, pipetas serológicos, uma pipeta eletrônico, gaze e desinfetante. Também reunir um contentor de resíduos para o meio de cultura de células gasto, mas não preenchê-lo com água sanitária. Traga os materiais na câmara de processo através de uma câmara de amortecimento conforme descrito na Seção 1.2. Preparar o meio de cultura de células na câmara de processo, tal como anteriormente descrito 9,10 (ver também o Quadro Materiais)
- Providenciar materiais, de tal modo a permitir que um espaço de trabalho óptima. Evite colocar itens não utilizados no centro da câmara de processo.
- Permitir a médio e equilibrar com os CO 2 e O 2 níveis atuais dentro do sistema, deixando o recipiente media ligeiramente destapado. Alguns fabricantes de médio PSC indicar não aquecer media a 37 ºC; Se este for o caso, utilizar uma câmara de tampão para equilibrar o meio. Permitir que o medio a equilibrar durante 20 min.
- Remover o meio dos poços usando uma pipeta de estereologia apropriado e um pipetador electrónico. Para PSCs, remova todos, mas uma pequena quantidade restante do meio de idade, o suficiente para evitar a dessecação durante o processo de alimentação. Para NSC, remover metade do meio velho. Pipet os resíduos no recipiente de resíduos.
- Coloque a pipeta usada para trás em sua embalagem original e movê-lo para o lado da câmara de processo, ou em uma câmara tampão designado para a remoção de resíduos. Com uma pipeta estéril sorológica fresco, adicionar meio fresco para a célula placas de cultura e colocar as placas de volta para sua incubadora designada.
- No final da alimentação, spray gaze com desinfectante e limpar o chão e puxadores das portas da câmara de processo completamente. Se houver várias linhas celulares sendo cultivadas no sistema, em esterilizar a alimentação entre cada linha de células. Isto ajuda a minimizar o risco de contaminação cruzada.
- Após a conclusão, remover os resíduosou outros itens desnecessários através de uma das câmaras de tampão.
3. Culturas divisão de células
- Enzimática Passaging de unidades ou NSCs
- Reúna todos os itens necessários para passaging. Isto inclui meios de comunicação, enzima ou tampão de dissociação de células não enzimática (o último é para NSC apenas), DPBS, as placas ou frascos, da matriz extracelular (ECM), tubos cónicos, e pipetas serológicas. Trazê-los para o sistema usando uma câmara de buffer.
- Revestir placas frescas ou frascos com ECM, como anteriormente descrito 9,10. Alguns ECMs -tais como os derivados de linhas celulares de rato sarcoma - só são líquidos entre 4 e 15 ° C, então use um bloco de gelo ou gel bolsa de gelo esterilizado para manter o frio ECM, enquanto trabalhava na câmara de processo aquecido.
- Pipeta fora do meio gasto a partir da cultura e descartá-la no recipiente de resíduos.
- Enxágüe bem ou frasco de superfície usando 1 ml de DPBS / bem e dispor do DPBS.
- Adicione 1 - 2ml de enzima aquecido a cada poço. Somente culturas muito densas requerem 2 ml.
- mover imediatamente a placa de cultura ou o frasco para a câmara de microscópio, e observar a cultura com cuidado. Atenção aos sinais de células individuais começam a afrouxar fora do prato. Não espere até que as células flutuar em suspensão antes de prosseguir para a próxima etapa.
- As células voltem à câmara de processo principal. Usando uma pipeta de 5 ml serológico, adicionar 4 ml de DPBS para cada 1 ml de enzima, e então vigorosamente pipetar para cima e para baixo para desalojar as células da superfície do poço. Se passaging várias cavidades dentro de uma placa multiwall, adicione os DPBS a cada poço antes de desalojar as células dos poços individuais.
- Transferir a enzima e suspensão de células de PBS para um tubo cónico de tamanho adequado.
- Se uma centrifugadora não está disponível na instalação de produção de células, bem selar o tubo cónica, colocá-la numa câmara de amortecimento e selar a porta fechada.
- Remover o tubo cónico a partir do buffer câmara do lado do escoamento laminar e girar as células a 100 xg durante 5 min à TA.
- Pulverizar o tubo cónico com 70% de etanol, e trazê-lo para a câmara de processo utilizando uma câmara de amortecimento e o factor de diluição.
- Pipetar fora o sobrenadante e ressuspender as células em 2 ml de meio de PSC ou NSC. Se passaging PSCs, certifique-se de incluir inibidor ROCHA no meio a uma concentração de 10 mM, como descrito anteriormente 9,10.
- Contar as células utilizando um hemocitómetro, e determinar o número de poços necessários ou placas. PSCs em placas a 5 x 04-1 outubro 5 x 10 células / cm2. Dividir as NSC a uma proporção de 1: 2.
Nota: NSC muitas vezes moita e resistir a contagem precisa em um hemocitômetro. - Se for necessária a criopreservação das células, seguir o protocolo apropriado 9,10, mas assegurar que todos os artigos e meios de congelação são preparadas com antecedência e colocado no interior da câmara de processo. DMSO é muito tóxico para as células a 376; C, por isso o trabalho muito rapidamente. Mantenha o recipiente de congelamento encamisado-isopropanol à temperatura ambiente na capela de fluxo laminar. Uma vez que os frascos de criopreservação está cheia e selada, remover imediatamente os frascos provenientes da câmara de processo, passando-os através de uma câmara de amortecimento.
- Passaging manual de unidades
- Confirmar que a cultura tem de ser passadas, como anteriormente descrito 8. Se assim for, para preparar as placas frescas ou frascos revestidos com matriz extracelular. Em seguida, mudar o meio completamente.
- Limpe a câmara de microscópio com gaze estéril umedecido com uma quantidade sparing desinfectante não inflamável - muito vai resultar em excesso de nebulização na câmara. Apenas limpar as luvas, área útil, e palco. Traga vários 200 ul ou 1.000 ul pontas de pipeta embalados individualmente dentro da câmara.
- Traga a placa de unidades para a câmara de microscópio, retire a tampa e coloque-o de bruços no chão limpo de fresco. Deixando a tampa se expõe a dir inferiorrectamente às correntes de ar, e à contaminação potencial.
- Desembalar um ponta de pipeta, e utilizando o microscópio para visualizar a cultura, escolher distante colónias que têm boa morfologia utilizando a ponta da pipeta.
Nota: A ponta da pipeta podem ser ligados a uma pipeta de se o utilizador individual encontra presente mais confortável. - Substituir a tampa da placa, e mover a placa de volta para a câmara de processo.
- Pipet o excesso de ECM da nova placa, e transferir a mídia a partir da placa velha (contendo as peças de colónias em suspensão) para a nova placa. Se a placa antiga ainda contém colônias que não estão prontos para serem colhidos, alimentá-lo bem.
4. Técnicas de Cultura Specialized
- Sendai Transdução de fibroblastos em PSCs
- Dentro da unidade de produção de células, expandir os fibroblastos da pele humana tipo 1 em meios de fibroblastos contendo DMEM / F12, FBS a 10%, e 20 ng / mL de FGF2, em 5% de O 2. Use 6 poços dishe culturas revestidos com gelatina a 0,1%.
- Preparar as células a serem transduzidas, dissociando-os com 1 ml de tripsina a 0,25% por poço. Inativar a tripsina com meio 1 ml de fibroblastos. Centrifugação a 200 xg, voltar a suspender as células em 1 ml de meio de fibroblastos, e contá-los usando um hemocitômetro.
- Ressuspender 2,0 x 10 5 células em meio de fibroblastos 2 ml, e adicionar a suspensão de células para um poço de uma placa de 6 poços revestida com gelatina (2,1 x 10 4 células / cm2). Coloque as células de volta na incubadora.
- Permitir que 24 horas para as células para anexar ao fundo da placa.
- Coloque forma de fibroblastos fresco no interior da câmara de processamento (1 ml de meio por poço de células a serem transduzidas), e permitir que se equilibre para os gases.
- Esterilizar em bloco frio pré-arrefecido com 70% de etanol e colocá-lo em uma câmara de buffer. Use um bloco de gelo gel com buracos cortados nela se um bloco frio comercial não está disponível.
Nota: Existem 3-4 separada Sendaivírus (dependendo da versão do kit de transdução), que devem ser descongelados rapidamente, mas mantida no bloco de frio, uma vez descongelado. - Mergulhe a metade inferior dos tubos de 37 ° C banho de água por 15 segundos (não submergir os tubos), em seguida, limpar imediatamente os exteriores de tubo com 70% de etanol. Colocar os tubos no bloco frio esterilizado na câmara tampão e executar um factor de diluição.
- Trabalhando de forma rápida, adicionar o volume necessário de cada vírus Sendai reprogramação para o meio equilibrado 2. Este volume é determinada por três variáveis - o número de células, o título de cada um dos vírus, e a multiplicidade desejada de infecção para cada vírus. Consulte o manual do kit para MOI recomendado. A fórmula é:
[(Número de células a ser transfectada) (multiplicidade de infecção) (1000)] / (título viral) = necessário ul de vírus - Retirar o sobrenadante do poço (s) de células a ser reprogramado. Para cada cavidade, adicionar 1 ml da mediUM contendo os vírus. Agite levemente a placa, tomando cuidado para não derramar meios de comunicação, e colocar a placa de volta ao O 2 incubadora de 5%.
- Após 2 horas agite levemente a placa novamente e repita novamente depois de mais 2 horas.
- Após 24 h (dia 1 pós-transdução), alimentar o bem com 1 ml de meio para mastócitos pluripotentes. Repetir no dia 2, mas não remover o meio a partir do poço.
- Nos dias 3 e 4, mudar metade do meio.
- No dia 5 e para além, alterar a forma inteira.
- Quando colônias aparecer, manchar a cultura utilizando anticorpos estéreis para confirmar que as colônias são realmente pluripotentes, como descrito anteriormente 2. Tal como acontece com as células de alimentação, assegurar que os meios de comunicação PSC contendo os anticorpos foi equilibrada para os gases na instalação de produção de células.
Nota: Em uma reprogramação, colónias IPSC devem estar presentes cerca de duas semanas após a transdução de um. - Quando as colônias têm crescido grandeo suficiente, use o microscópio para marcar e passagem mecanicamente-los para uma placa revestida de ECM, conforme descrito no ponto 3.2.
- Expandir as colónias de forma manual ou enzimaticamente, tal como anteriormente descrito 9,10.
5. Limpeza após uso diário
- Coloque todos os resíduos, incluindo o frasco de resíduos líquidos, em uma câmara tampão estéril. Limpe a superfície da câmara de processamento e todas as áreas que tenham entrado em contato por fontes com gaze estéril e desinfetante não-inflamável.
- Remova todos os resíduos sólidos da câmara tampão e descartar no recipiente adequado de lixo.
- Descarte os resíduos líquidos em um recipiente adequado de lixo, ou simplesmente misturar com água sanitária e despeje no ralo. Limpe o recipiente de resíduos com sabão e uma escova. Esteriliza-se o recipiente com 70% de etanol e movê-lo de volta para a câmara de processamento através de uma câmara de amortecimento.
Nota: Não é recomendado o uso de água sanitária emo recipiente de resíduos enquanto ele estiver dentro do sistema, como as emanações de branqueamento pode recircular e prejudicar as culturas de células. - Para considerações de higiene, limpe a superfície de plástico frente da câmara de processamento do sistema, com 70% de etanol. Isso ajuda a limpar óleos suor e pele da testa do usuário.
- Se a condensação se acumulou no interior da câmara de processo, execute um factor de diluição para limpar a condensação. Permitir que pelo menos 1 hora para este para ser concluído.
6. Tarefas não-rotina diária
- Recarregar pratos de água nas incubadoras de cultura de células com água destilada estéril, conforme necessário. Cubra fora os pratos, pelo menos uma vez por semana. No entanto, a taxa de evaporação vai oscilar em função de quantas vezes as portas da incubadora são abertos, o volume de líquido em culturas, e as configurações de incubadoras.
- Uma vez por mês, recalibrar as definições de O 2 e CO 2 em todas as câmaras. Isto requer a utilização de SPAN (calibração) de gás, que contAINS concentrações conhecidas níveis de O 2 e CO 2 como um padrão de referência. Certifique-se de que não há fornecimento de gás SPAN adequada antes de iniciar a calibração. O sistema utiliza sensores de gases específicos, localizados em cada módulo, para detectar concentrações de gases; Assim, a utilização de gases de calibração de alta qualidade garante que os sensores de forma fiável se obter as concentrações de gás precisos.
- Substituir as luvas na câmara de processamento e a câmara de microscópio sobre uma base regular. Substitua as luvas a cada 2 meses, independentemente de quantas vezes o sistema é utilizado. Antes da instalação, esterilizar as novas luvas com desinfetante. Executar um factor de diluição na câmara de processo após as luvas foram substituídos.
Nota: Quando se estendia ao longo dos punhos do sistema, luvas de borracha nitrílica têm uma tendência a desenvolver buracos em áreas expostas ao estresse físico e calor. Isso é normal e desgaste inevitável eo rasgo. - Alterar os filtros de seringa em todas as câmaras a cada 6 meses.
- Substituir ou lavar tele pré-filtro na câmara de fluxo laminar, assim que começa a aparecer sujo.
- Referem-se a documentos do fabricante regularmente para obter informações sobre a substituição das peças principais.
7. Lavagem do Sistema
- No caso de um evento importante contaminação que afecte a maioria das culturas de células, mover quaisquer culturas de células sobreviventes para fora do sistema, ou (se possível) em uma incubadora afectada.
- Desligue o controle de gás para todas as câmaras com exclusão da incubadoras não afetados.
- Remover o painel frontal flexível do aparelho, e remover as prateleiras de aço inoxidável a partir do incubador de cultura de célula afectada. Também retire a panela de água.
- Autoclave as prateleiras incubadora e pan água, e colocá-los de volta para a incubadora. Limpar as superfícies interiores da incubadora com 70% de etanol. Permitir que o etanol se evaporar, e fechar a porta da incubadora.
- Limpar as superfícies da câmara e processo de microscópio com 70% de Ethanol. Substituir o painel frontal do aparelho.
- Limpar as superfícies interiores do aparelho, incluindo o da incubadora afectado, com desinfectante não inflamável. Deixe a porta do aberta incubadora afetado e executar um factor de diluição na câmara de processo. Certifique-se as portas da câmara de microscópio também estão abertos.
- Para a limpeza de rotina das incubadoras de cultura de células, garantir que a incubadora e câmara de processo são as mesmas configurações atmosféricas. Abra a porta da incubadora, e colocar todos os pratos de cultura de células sobre a superfície da câmara de processo.
- Limpe as prateleiras incubadora e superfícies interiores com desinfectante não-inflamável. Permitir que o desinfectante para evaporar, e mover as culturas de células de volta para a incubadora. Trabalhar tão rapidamente quanto possível para evitar a dessecação das culturas de células.
Resultados
Este manuscrito descreve com algum detalhe uma instalação de produção de células, e os aspectos únicos da cultura de células dentro de um sistema fechado. A maior parte das instalações de produção de células compreende um aparelho de cultura celular feito por encomenda, fechado, que tem uma pegada pequena e pode ser facilmente instalado dentro de um 6 x 7,5 m 2 quarto (Figura 2). Em nenhum momento são as células dentro do aparelho exposto ao pessoal de laboratório ou ambiente. O aparelho é constituído por vários módulos: uma câmara de processo, uma câmara de fluxo laminar, 2 câmaras de tamponamento Airlock entre o capuz e a câmara de processo, duas incubadoras de cultura de células, e um microscópio de câmara adjacente à câmara de processo (Figura 3). O sistema é controlado por software que permite variáveis ambientais a serem controladas e monitoradas (Figura 1). O computador que executa o software está em uma fonte de alimentação ininterrupta. Os gases são alimentados em the sistema por um conjunto de colectores de oxigénio, azoto e dióxido de carbono (Figura 4). Gases para o dispositivo são fornecidos por sistemas múltiplos que têm dois conjuntos de tanques cada - um conjunto ativo e um conjunto de reserva. Quando o conjunto ativo é desenhada para baixo, o colector muda automaticamente para os tanques de substituição ordem reserva constituídos e de pessoal. O poder está em um sistema gerador de backup.
Pluripotentes e células estaminais neurais podem ser cultivadas em condições de hipóxia nesta instalação utilizando protocolos previamente desenvolvidos 9, com as complicações adicionais inerentes ao equipamento novo. As células estaminais pluripotentes podem ser derivados utilizando vírus Sendai, utilizando anticorpos específicos de pluripotência para identificar colónias totalmente transfectadas, as quais são então isoladas e expandidas. (Figura 5A e B), A partir destes iPSCs, células estaminais neuronais e neurónios podem ser derivados usando SMAD inibição dupla, e o seu fenótipo verificado USI Os anticorpos específicos para NSC ng (Figura 5C e D).
Figura 1. Interface Gráfica para o Mecanismo de célula de produção. (A) A representação gráfica do CPF é a tela padrão e combina o desenho CAD mostrado na Figura 3. Um clique do mouse sobre o buffer Módulo 1 (2F na Figura 1) abre seu ecrã de controlo (B), onde os valores de o 2 são definidas para coincidir com a câmara de processamento (3 na Figura 3). Da mesma forma, clicando sobre o Processo da Câmara ou Incubadora 1 traz suas respectivas telas de controle (C e D, respectivamente), onde os valores podem ser alterados ou monitorados, conforme apropriado. rget = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. O dispositivo de célula de produção. (A) O sistema como visto de uma vista frontal direita. Observe as conexões de alimentação e de gás no tecto e o carro com os acessórios de microscópio e computador para a direita. (B) A câmara de fluxo laminar com as portas de acesso aos módulos de tampão visto no lado direito. (C) A câmara de processo com as incubadoras duas portas (preto) visto na parte traseira. (D) Uma vista através do lado direito do sistema que mostra o microscópio e monitor com as portas para as câmaras de amortecimento visto à distância. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Um desenho de CAD do mecanismo de célula de produção. Todos os artigos que entram no dispositivo são primeiramente limpo com álcool e seco ao ar na câmara de fluxo laminar (1). Os artigos são, em seguida, transferida para o ambiente apropriado no módulo de tampão dianteira (2F) antes de serem passados para o módulo de UCPC, ou processo de câmara (3). As células são cultivadas nas duas incubadoras (4, 5). Coloração de células vivas, colônia colheita, a avaliação da morfologia celular geral e análise de migração ocorre no módulo UPC, ou Microscópio Câmara (6). Finalmente, resíduos sai do sistema através do módulo tampão traseiro (2R). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. < / P>
Figura 4. Fontes de Gases e poder. (A) O colector de CO 2 é uma configuração de 4 x 4, uma vez que fornece todos os incubadoras de laboratório. (B) O colector de O 2 é uma configuração única e suprimentos a instalação de produção de células de 2 x 2. Azoto para o sistema é gerado num vaporizador (C, apenas o sinal de saída abaixo) ligado a um colector de azoto líquido (à direita) que também enche automaticamente cryofreezers (inferior esquerdo). O colector é uma configuração 2 x 2 sendo fornecida por dois pares de tanques de 160 L de azoto líquido. CO 2, O 2, N 2 e são fornecidos através do teto shutoffs (D). câmara de vácuo é também fornecida neste local. Visto apenas atrás das shutoffs gás de alimentação são um par de cabos de energia que fornecem energia ao sistema.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig4large.jpg" target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. As células pluripotentes estaminais derivadas em hipóxia com o vírus Sendai. (A) SC187-SF4-2I0-E3 iPSCs iPSCs (nomenclatura encontrados em Stover et al. 9), contraste de fase 10x. (B) SC88.1-UH1-2I0 iPSCs live-coradas com Tra-1-60 AF-594-rotulados, diluição 1: 100 na mídia. Todos os iPSCs foram transduzidas na instalação de produção de células em 5% de O 2 com o vírus de Sendai. (C) O contraste de fase de NSC-SC68.1 UH0-2I0-M0S13-N2G6 iPSC-derivados, crescido em 5% de O 2 em lâminas de câmara. As células foram então fixadas em paraformaldeído a 4% e coradas com o anticorpo primário anti-nestina humana, e o anticorpo secundário Alex-488. Todas as barras de escala são a 1001;. M Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussão
As células cultivadas dentro das CPF não vejo mudanças nas concentrações de oxigênio ou dióxido de carbono que se deslocam de incubadora para o processamento de câmara para microscópio de câmara e volta. É crítico que as condições em cada uma das câmaras são combinadas para a incubadora particular em que as células são mantidas antes que as células são removidas da incubadora. A atmosfera dentro do aparelho é continuamente HEPA-filtrado e é personalizável no que diz respeito às concentrações de oxigênio e dióxido de carbono. As células podem ser cultivadas em concentrações normais para unidades ou NSC, 5% e 9%, respectivamente; ou concentrações alternativos podem ser escolhidos para diferentes tipos de células ou para experiências específicas. Assim, o aparelho é fornecido com fontes de oxigénio constante de grau médico, dióxido de carbono e azoto (Figura 4). Todos os três destes gases são fornecidos por sistemas de colector de gás específico do que assegurar o abastecimento constante. O aparelho é também fornecido com uma mistura de gás de calibração consiste em10% (± 0,01%) de dióxido de carbono em oxigénio. Os sistemas de manifold estão alojados fora da unidade de produção de células e os gases são canalizados para a instalação através do teto. O gás de calibração está alojado no interior da instalação. O aparelho é fornecido adicionalmente com aspirador de casa, também através do teto. Usando um sistema de monitoramento eletrônico e sem fio unidades envio, as pressões de todos os colectores de saída são constantemente monitorados. No caso em que qualquer pressão cai fora do intervalo, os operadores das instalações de produção de células são automaticamente telefonou e notificada de tal forma que medidas apropriadas possam ser tomadas.
Os requisitos de energia do aparelho são atendidas por seis dedicados 120 V circuitos que descem do teto e ligados a geradores de back-up do hospital para garantir um fornecimento constante. O funcionamento do aparelho é controlado via software em um computador baseado em PC alimentado através de uma fonte de alimentação ininterrupta. Estes arranjos de poder e de computadorassegurar que o sistema funciona continuamente, mesmo em caso de falha do sistema do poder público. O software que controla o aparelho tem uma interface gráfica amigável (Figura 1) que permite o controlo das concentrações de oxigênio e dióxido de carbono, bem como pressões de temperatura, umidade, e de câmara. Os valores de todos estes parâmetros são registadas continuamente para fornecer um registro de execução de todos os parâmetros do aparelho. Este dados são copiados para um servidor remoto a cada noite para proteger a sua integridade. O computador eo software pode ser acessado remotamente por usuários administrativos para avaliar e / ou alterar qualquer parâmetro. Além disso, o computador eo software pode ser acessado remotamente, permitindo avaliação interativa de parâmetros de aparelhos e solução de problemas com os usuários locais. Uma unidade de envio de alarme adicional é ligado ao aparelho de tal modo que os operadores das instalações de produção de células são notificados de qualquer condição fora-de-gama do aparelho. O acesso remoto capabilities permitir o login e avaliação das especificidades da condição fora-de-gama.
O aparelho é concebido como um sistema modular tanto em uma macro e micro um sentido. módulos de cultura de células individuais, tais como incubadoras e câmaras de processamento, podem ser personalizadas no que diz respeito às suas dimensões e os requisitos, bem como na sua disposição com respeito um ao outro. Além disso, a maior parte das funções de controlo dos módulos individuais são eles próprios modular de tal modo que os controladores de gás atmosféricos, por exemplo, pode ser facilmente substituído sem perturbação significativa para o sistema.
câmaras de processamento especializado, tal como um para visualização microscópica e manipulação de culturas de células, podem ser facilmente adaptado ao sistema. Ambos de contraste de fase e microscópio de fluorescência estão dentro do sistema (Figura 6), de modo que as células podem ser coradas vivo, e as colónias podem ser dissecados nas mesmas condições atmosféricas dentro como tele incubadoras. Encaminhamento de cabos por meio de ilhós seladas nas paredes laterais da câmara de processamento permite que o equipamento, tal como fontes de alimentação e computadores para ser mantido no exterior do aparelho, geralmente sobre um carrinho (Figura 6).
As câmaras de processamento na unidade de produção de células têm um padrão de fluxo de ar diferente do BSC convencionais. Em BSCs convencionais, o fluxo de ar flui para baixo a partir de um orifício de evacuação central e se divide em duas correntes separadas, que são então levados até por duas aberturas de entrada diferentes na parte da frente e para trás do piso do armário. Em contraste, a PCF tem uma única abertura na parte da frente do tecto. O ar flui para baixo e em direcção à parte de trás da câmara, onde é, em seguida, conduzido para cima, para uma entrada de ventilação. Embora o CPF é inerentemente muito limpos, este padrão de fluxo de ar única significa que os técnicos têm de ajustar ligeiramente a sua técnica para reduzir o risco de contaminação. Tal como acontece com um BSC convencional, um trabalhador s laboratórioevitar hould colocando suas mãos a montante de placas de cultura de células abertas e garrafas de mídia. No entanto, o sentido a montante é que tenha sido modificado no CPF
O laboratório instalação de produção de células em si é bastante padrão e vem equipado com um C congelador -20 °, a -80 ° C freezer, a 4 ° C geladeira, uma centrífuga, e um banho de água. O laboratório também tem uma pia com pedais para operação conveniente mãos livres. Para que este laboratório para se tornar uma unidade de produção de células clínica funcional, no entanto, devem ainda ser feitas várias modificações adicionais. Em primeiro lugar, o aparelho em si tem de ser actualizado para ter a capacidade de monitorar compostos voláteis orgânicos, partículas, e das concentrações de dióxido de cloro que é utilizado para descontaminação. Em segundo lugar, uma câmara de processamento que contém uma máquina de FACS podem ser alojados e ligado ao resto do aparelho através de um módulo de memória intermédia. Isto irá permitir a separação de células e purificação de trpopulações de células ansplantable nas condições ambientais adequadas. Por fim, todo o aparelho deve ser instalado dentro de uma parede macia sala limpa. Isso fornece uma International Organization for Standardization (ISO) Classe 8 ambiente para o aparelho 5.
A alta esterilidade e natureza controlado por computador do CPF faz com que seja um sistema ideal para aplicações futuras com a terapia à base de células e os processos de fabrico boas. O risco de contaminação é bastante atenuados, mas o mais importante, as condições de expansão celular são registados automaticamente e arquivados pelo sistema de computador. Desvios em concentrações de gases, temperatura, umidade e todos os eventos de acesso ao sistema são rigorosamente documentadas. Isso pode ajudar muito na investigação de problemas de qualidade do produto. No entanto, ainda há limitações. O uso de qualquer e todos os reagentes e materiais (por exemplo, componentes de mídia, pipetas, placas) deve ser documentada separadamente. Adicionaritionally, há uma infinidade de problemas potenciais (incluindo muitas formas de erro humano) que podem surgir que são completamente alheios às variáveis documentados pelo sistema de monitoramento do CPF. Assim, a necessidade de pessoal altamente treinado e documentação manual detalhado de tarefas permanece no lugar.
Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer a equipe Biospherix por sua ajuda em aprender a usar o sistema de cultura celular Xvivo fechado, especialmente Matt Freeman; o pessoal do Miles & Kelley Construction Company, Inc. para o seu trabalho na criação da infra-estrutura laboratorial, especialmente Russ Hughes; o pessoal do Hospital Infantil de departamento de Orange County de Instalações e Serviços de Suporte para o seu trabalho na coordenação da remodelação de laboratório, especialmente Adam Lukhard e Devin Hugie; o pessoal do Hospital Infantil de departamento de Orange County de Sistemas de Informação pela sua ajuda na criação da infra-estrutura de gerenciamento de dados e acesso remoto, especialmente Viet Tran; Hospital Infantil de Orange County Equipe de Gestão Executiva por seu apoio de longa data do projeto, especialmente Dr. Maria Minon e Brent Dethlefs. Este trabalho foi financiado pelo Hospital Infantil de Orange County e do California Institute for Regenerative Medicine através TR3-05476 subvenção para PHS. Todos os autores contribuíram igualmente para este trabalho.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| Xvivo System | Biospherix | feito sob medida | |
| Xvivo Software | Biospherix | versão i.o.2.1.2.1 | |
| O2 Manifold | Amico P-M2H-C3-S-U-OXY | ||
| CO2 | Manifold Amico | M2H-C3-D-U-CO2 | |
| N2 Western | Innovator | CTM75-7-2-2-BM | |
| Microscópio com câmera DP21 e fluorescência | Olympus Corporation | CKX41 | |
| Nome< | strong>Empresa | Número do Catálogo | Comentários |
| Reagentes | |||
| DMEM/F12 Suplemento | da Life Technologies | 10565-018 | |
| Life Technologies | A100006-01 | ||
| Accutase | Millipore | SCR005 | |
| Fator de Crescimento de Fibroblastos Hyclone 9236 | |||
| R& D Systems | AFL233 | ||
| Protide | de dimetilsulfóxido | PP1130 | |
| Hank's baseado em dissociação celular Buffer | Life Technologies | 13150-016 | |
| 2-Mercaptoetanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Fator de crescimento epidérmico | R & D Systems | AFL236 | |
| Oct-3/4 Anticorpo | Millipore | AB3209 | |
| TRA-1-60 Anticorpo | Millipore | MAB4260 | |
| SSEA4 Anticorpo | Millipore | MAB4304 | |
| BIT-9500 Suplemento de soro | Stemcell Technologies | 9500 | |
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Consumable Supplies | |||
| 2 ml Pipeta serológica | VWR | 89130-894 | |
| 5 ml Pipeta serológica | Olympus Plastics | 12-102 | |
| 10 ml Pipeta serológica | Olympus Plastics | 12-104 | |
| Pipeta sorológica de 25 ml | Olympus Plastics | 12-106 | |
| Pipeta sorológica de 50 ml | Olympus Plastics | 12-107 | |
| Placa de 6 poços | Corning | 353046 | |
| Placa de 12 poços | Corning | 353043 | |
| T25 frasco | TPP | 90026 | |
| T-75 TPP | 90076 | ||
| 20 µ l pontas de pipeta | Eppendorf | 22491130 | |
| 200 µ l ponteiras de pipeta | Eppendorf | 22491148 | |
| 1.000 ponteiras de pipeta | Eppendorf | 22491156 | |
| Cryovials | Thermo Scientific | 5000.102 | |
| 70% etanol | BDH | BDH1164-4LP | |
| Sanimaster 4 | Ecolab | 65332960 | |
| Bleach | Clorox | A714239 |
Referências
- Brick, D. J., et al. The Autism Spectrum Disorders Stem Cell Resource at Children's Hospital of Orange County: Implications for Disease Modeling and Drug Discovery. Stem Cells Transl.Med. 3 (11), 1275-1286 (2014).
- Nethercott, H. E., Brick, D. J., Schwartz, P. H. Derivation of induced pluripotent stem cells by lentiviral transduction. Methods Mol.Biol. 767, 67-85 (2011).
- Pistollato, F., et al. Hypoxia and HIF1alpha repress the differentiative effects of BMPs in high-grade glioma. Stem Cells. 27 (1), 7-17 (2009).
- Pistollato, F., Chen, H. L., Schwartz, P. H., Basso, G., Panchision, D. M. Oxygen tension controls the expansion of human CNS precursors and the generation of astrocytes and oligodendrocytes. Mol.Cell Neurosci. 35, 424-435 (2007).
- Raval, J. S., Koch, E., Donnenberg, A. D. Real-time monitoring of non-viable airborne particles correlates with airborne colonies and represents an acceptable surrogate for daily assessment of cell-processing cleanroom performance. Cytotherapy. 14 (9), 1144-1150 (2012).
- Schwartz, P. H. The potential of stem cell therapies for neurological diseases. Expert.Rev.Neurother. 6, 153-161 (2006).
- Schwartz, P. H., Brick, D. J. Stem cell therapies for the lysosomal storage diseases - the quintessential neurodegenerative diseases. Curr.Stem Cell Res.Ther. 3 (2), 88-98 (2008).
- Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. Traditional human embryonic stem cell culture. Methods Mol.Biol. 767, 107-123 (2011).
- Stover, A. E., et al. Process-based expansion and neural differentiation of human pluripotent stem cells for transplantation and disease modeling. J Neurosci.Res. 91 (10), 1247-1262 (2013).
- Stover, A. E., Schwartz, P. H. Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging. Methods Mol.Biol. 767, 137-146 (2011).
- Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 5 (3), 237-241 (2009).
Reimpressões e permissões
