Artigo de método

As diferenças sexuais no mouse do hipocampo astrócitos após

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DOI:

10.3791/53695

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25 de outubro de 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Waisman Center, University of Wisconsin, 2Department of Neurological Surgery, University of Wisconsin, 3Department of Pediatrics, University of Wisconsin

Neste artigo

Resumo

Os astrócitos são um dos principais intervenientes mais importantes no sistema nervoso central (SNC). Aqui, nós estamos relatando um método prático de protocolo de cultura de astrócitos do hipocampo sexuado, a fim de estudar os mecanismos subjacentes a função de astrócitos em filhotes recém-nascidos do sexo masculino e feminino após isquemia in-vitro.

Resumo

Astrogliosis seguinte hipóxia / isquemia (HI) lesão cerebral -relacionados desempenha um papel no aumento da morbidade e mortalidade em recém-nascidos. Estudos clínicos recentes indicam que a gravidade da lesão cerebral parece ser dependente do sexo, e que os machos recém-nascidos são mais susceptíveis aos efeitos de lesões cerebrais relacionadas-HI, resultando nos resultados neurológicos mais graves, em comparação com mulheres com lesões cerebrais comparáveis. O desenvolvimento de métodos confiáveis ​​para isolar e manter populações altamente enriquecido de astrócitos do hipocampo sexuado é essencial para compreender a base celular das diferenças sexuais nas consequências patológicas de HI neonatal. Neste estudo, descrevemos um método para a criação de culturas de astrócitos do sexo específicos do hipocampo que são submetidos a um modelo de isquemia in vitro, a privação de oxigénio-glicose, seguida por reoxigenação. astrogliosis reactiva subsequente foi examinado por immunostaiNing para a proteína glial fibrilar ácida (GFAP) e a S100B. Este método fornece uma ferramenta útil para estudar o papel do sexo masculino e astrócitos do hipocampo do sexo feminino seguinte HI neonatal, separadamente.

Introdução

Os astrócitos são um dos principais intervenientes mais importantes no sistema nervoso central (SNC). Crescente corpo de evidências indica que os papéis de astrócitos são mais do que apoio neuronal. Na verdade, o papel dos astrócitos em condições fisiológicas pode ser muito complexo, tais como guiar a migração de axónios em desenvolvimento 1, regulando SNC fluxo de sangue 2, a manutenção da homeostase do sináptica fluido intersticial 3 pH, e participam na barreira hemato-encefálica 4 e 5 da transmissão sináptica. Em condições patológicas, astrócitos responder a uma lesão com um processo chamado astrogliose reactivo em que a morfologia, número, localização, topografia (em relação à distância do insulto) e a função dos astrocitos podem mudar de uma forma heterogénea 6,7. Astrogliosis visto seguinte encefalopatia hipóxico-isquémica neonatal talvez contribuindo para a morbidade e mortalidade de recém-nascidos 8.

estudos clínicos e experimentais recentes indicam que a gravidade da lesão cerebral parece ser dependente do sexo e que os machos recém-nascidos são mais susceptíveis aos efeitos de hipoxia / isquemia (HI) lesão cerebral -relacionados, resultando nos resultados neurológicos mais graves, em comparação com mulheres com lesões cerebrais comparáveis 9-11. Embora a localização da lesão depende da idade gestacional e a duração e a gravidade da lesão, hipocampo é uma das regiões mais vulgarmente efectuada no SNC após HI neonatal prazo, e aumentou astrogliose hipocampo foi confirmada por super-regulação de a proteína glial fibrilar ácida (GFAP) 3 d após a HI neonatal 7,10,12,13. Diferenças sexuais em função de astrócitos foram mostrados em ambos os recém-nascidos e roedores adultos após isquemia cerebral 14,15. Além disso, a susceptibilidade de astrócitos do sexo masculino de isquemia in vitro foi demonstrado por um aumento da CELl morte em comparação com astrócitos corticais do sexo feminino na cultura 16.

Diferenças sexuais começar no útero e continuam até a morte 17. Durante a última década, a importância de incluir os sexos em condições experimentais em cultura celular e in vivo estudos têm sido a ênfase do Instituto de Medicina e NIH para buscar conhecimentos fundamentais nas diferenças de sexo visto em condições fisiológicas e patológicas 17,18 . Desenvolvimento de métodos confiáveis ​​para isolar e manter populações de astrócitos do hipocampo sexuado é essencial para compreender a base celular das diferenças sexuais nas consequências patológicas de HI neonatal. O presente estudo foi desenhado para proporcionar as técnicas para preparar culturas de astrócitos do hipocampo específicas do sexo enriquecidos de ratos recém-nascidos, a fim de avaliar os papéis de astrócitos GFAP-imunoreativos seguintes Oxygen / Glucose Privação (OGD) e reoxigenação (Reox), induzindoHl em meio de cultura de células. Esta técnica pode ser usado para testar qualquer hipótese referente a astrócitos do hipocampo em machos e fêmeas neonatais sob condições de normóxia e isquémicas.

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Protocolo

NOTA: Este estudo foi realizado de acordo com a recomendação do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do Instituto Nacional de Saúde. O protocolo animal foi aprovado pela Universidade de Wisconsin-Madison, Institutional Animal Care e do Comitê Use. Protocolo de Cultura Astrocyte primário que é apresentado aqui é adotada a partir dos protocolos apresentados por Zhang Y 19 et al. E Cengiz P 20 et al., Com algumas modificações.

1. hipocampo Dissecção e Cultura Astrocyte

  1. Prepare todos os reagentes e materiais necessários, incluindo tesouras cirúrgicas, fórceps finos lisos, uma pinça ponta plana, toalhas de papel, saco de lixo, 70% de etanol e 2 pratos de dissecação (3,5 cm de diâmetro) no gelo cheias de 2 Solução Salina Equilibrada de mL Hank (HBSS) cada . Certifique-se do equipamento cirúrgico são estéreis (autoclave) antes do procedimento e utilizar todos os outros materiais (Astrocyte chapeamento meio: soro DMEM + 5% + cavalo1% de penicilina-estreptomicina, soro de cavalo, de HBSS, 0,25% de tripsina, lamelas de vidro, placas de Petri, 15/50 mL tubos, frascos T25, etc.) como pré-esterilizado.
  2. Pressione cuidadosamente e pulverizar a cabeça e pescoço do cachorro rato com 70% de etanol e decapitar usando uma tesoura esterilizada afiadas [Figura 1 (1)].
  3. Realizar uma incisão mediana de posterior para anterior crânio com uma tesoura pequena ao longo do couro cabeludo para expor o cérebro [Figura 1 (2-3)].
  4. Cortar o crânio com cuidado desde o pescoço até o nariz com uma tesoura pequena. Em seguida, corte crânio anterior para os bulbos olfatórios e inferior ao cerebelo para desconectar o crânio da base do crânio.
  5. Fazer uma pequena incisão na base do crânio e cortar ao longo da linha média. Use uma pinça de ponta chata estéreis para descascar o crânio. Remover o tronco cerebral com a ajuda de uma pinça curvos. Remover o cérebro do crânio e colocar para o primeiro prato de dissecação [Figura 1 (4-9)] 21.
  6. Usando uma pinça curva, virar o cérebro de modo que a superfície ventral do cérebro é voltado para cima e, em seguida, separar os dois hemisférios com uma lâmina cirúrgica estéril afiada [Figura 1 (10,11)]
  7. Retire os hemisférios cerebrais e remova cuidadosamente o tecido mesencéfalo e tálamo abaulamento com um estéreis pinças curvas planas para revelar o hipocampo, uma estrutura pequena, cavalo marinho em forma no lobo temporal medial [Figura 1 (12-14)].
  8. Remova ambos os lóbulos do hipocampo [Figura 1 (15,16)] e dissecar cuidadosamente as meninges de lobos puxando com a pinça fina. Este passo evita a contaminação da cultura final do astrócito por células meníngeas e fibroblastos.
  9. Transferir os lóbulos do hipocampo preparados para o segundo prato cheio com HBSS e devolvê-lo em gelo [Figura 1 (17,18)]. Piscina ambos hipocampo lóbulos de um único rato (P0 - P2) para preparação de hipopótamoculturas Campal astrócitos. Isto dá a densidade apropriada dos astrócitos. Picar lobos do hipocampo, utilizando uma lâmina cirúrgica estéril afiada (aproximadamente 4 vezes).
  10. Aspirar HBSS de prato usando uma ponta estéril ligada a uma pipeta de 1 mL e adicionar 3 ml de 0,25% de tripsina, misturar e transferir para um tubo cónico de 15 ml estéril e a incubação do tecido a 37 ° C durante 20 min com agitação suave.
  11. tubo de centrifugação a 300 xg durante 5 min. Aspirar o sobrenadante cuidadosamente, utilizando uma pipeta de vidro estéril ligada a uma linha de vácuo. Adicionar 10 ml de astrócitos chapeamento médio e triturado (20 - 30 vezes) usando um fogo polido pipeta de vidro até pedaços de tecido homogeneizar.
  12. tubo de centrifugação a 300 xg durante 5 min. Aspirar o sobrenadante e adicionar 2 mL de meio de astrócitos chapeamento pré-aquecido fresco. Passar as células através de um filtro de malha de 70 um (filtro de células) para um novo tubo cónico de 50 mL.
  13. suspensão de células em placa inteira num frasco de cultura T25 estéril poli-D-lisina / laminina, contendo 3 mL revestido demeios de astrócitos plaqueamento, depois incubar o balão a 37 ° C numa incubadora de CO2 a 5%.
  14. Toda Aspirar mídia na dia- i n-vitro (DIV) 1, DIV 3 e DIV 7, e substituir com 2 mL de meio de astrócitos chapeamento frescos. Observe a progressão e confluência astrocitária sob microscópio de luz cada vez que ao substituir a mídia astrócitos chapeamento.
    NOTA: A DIV 1, todos os astrócitos viáveis ​​são ligadas à superfície do frasco de cultura e as células mortas ou a morrer que incluem neurónios estão a flutuar no sobrenadante. No DIV 3, as células ligadas começar a dividir para formar a camada de células de astrócitos. Na ausência de condições favoráveis, a cultura é quase desprovida de qualquer crescimento neuronal. No DIV 7, astrócitos camada é de cerca de 80 - 90% confluentes e alguns microglia, bem como células precursoras de oligodendrócitos estão presentes no topo da camada de astrócitos.
  15. Aspirar o meio chapeamento do frasco, adicionar 2 mL de meio de astrócitos chapeamento pré-aquecido fresco, lavar and remover novamente no DIV 11, quando os astrócitos são confluentes e pronto para a sub cultura.
  16. Adicionar 2 mL de tripsina a 0,25%, rode suavemente o frasco algumas vezes e aspirado de tripsina usando uma pipeta de vidro esterilizado.
  17. Adicionar 2 mL de tripsina a 0,25% e deixar que o balão se sentar na capa de cultura de tecidos para 4-5 min a RT.
  18. Remover a tripsina e manter o balão a 37 ° C numa incubadora de CO2 a 5% durante 10 min. Adicionar 5 mL pré-aquecido astrócitos chapeamento médio e retirar a camada de astrócitos tocando o frasco contra a palma da sua mão (3 - 4 vezes) seguido por trituração suave para conseguir separação completa e recolher os astrócitos em um tubo cônico de 15 mL.
  19. tubo de centrifugação a 300 xg durante 5 min, aspirar o sobrenadante e adicionar 1 mL de meio fresco astrócitos chapeamento.
  20. Adicionam-se 10 uL da suspensão de células para um hemocitómetro e contar as células na grande superfície reticulada central (1 mm2), utilizando um microscópio de contraste de fase invertida (objectiva 10X). Multiply por 10 4 para estimar o número de células por mL. Um balão T25 produzirá ~ 1 x 10 6 células totais dissociado. Semente ~ 1 x 10 5 células em 2 ml de astrócitos do plaqueamento em meio de um diâmetro de Poli-D-Lisina lamela de vidro pré-revestidas com 12 mm de o poço de uma placa de cultura de 24 poços.
  21. Incubar a 37 ° C numa incubadora de CO2 a 5%. Execute OGD / Reox na DIV 12-14 (seção 2).
  22. Tratar as culturas de astrócitos na DIV 3 com cloridrato de 5 mM L-leucina éster metílico (LME) até DIV 11 se culturas de hipocampo desprovidas de microglia são desejados. Após LME incubação, as culturas sujeitas a agitação (300 rpm durante 1 h) para remover contaminantes microglia.
    NOTA: LME é um agente citotóxico da microglia que tem sido amplamente utilizado como um método para eliminar a proliferação microglia 22.

2. OGD / Reox Tratamento

  1. media aspirado de lamela contendo cultura de astrócitos aderente (DIV 12-14) e lavar 3 vezespor rotação suave a 24 poços de cultura prato que prende a lamela algumas vezes com 1 mL de solução isotónica OGD (pH 7,4) contendo (em mM): 0 de glucose, 21 de NaHCO3, 120 NaCl, 5.36 KCl, 0,33 Na 2 HPO 4, 0,44 KH 2 PO 4, 1,27 de CaCl2, e 0,81 MgSO 4.
  2. Adicionar 0,2 mL de solução a OGD bem para cobrir a lamela e incubar durante 2 h numa incubadora hipóxico contendo 94% de N 2, 1% de O2, e 5% de CO 2. Misturar suavemente com um agitador orbital (50 rpm) durante os primeiros 30 minutos de hipoxia para facilitar o intercâmbio de gás.
  3. Incubar as células de controlo normóxicas durante 2 h em 5% de CO 2 e o ar atmosférico em um tampão idêntica à solução OGD, excepto a adição de 5,5 mM de glucose.
  4. Para Reox, aspirado solução OGD e adicionar 2 mL de astrócitos chapeamento médio. Incubar em 5% de CO 2 e o ar atmosférico, a 37 ° C durante 5 h.

3. imunocitoquímica Coloração

  1. Aspirar o meio de cultura usando uma pipeta de vidro estéril ligada a uma linha de vácuo e rapidamente enxaguar lamela uma vez por adição de 1 mL de 0,1 M de Tris salino tamponado (TBS) (NaCl 154 mM, 16 mM, de Trizma base, Tris-HCl a 84, pH 7,4) para o poço. Aspirar e juntar 2 ml de paraformaldeído a 4% (PFA) em 1x tampão fosfato salino (PBS). Incubar durante 15 minutos à TA.
  2. Aspirar e adicionar 1 mL de 0,1 M TBS, em seguida, coloque em um agitador de balanço por 2 min. Repita 3 vezes. Adicionar 1 ml de solução (soro de cabra a 10%, 10 mg / mL de BSA, 0,025% de Triton X-100 a 0,1 M em TBS) de bloqueio e incubar durante 30 min a 37 ° C num agitador de balanço.
  3. Aspirar solução de bloqueio e adicionar anticorpo-GFAP monoclonal anti-primário do rato (0,2 mL de uma diluição de 1: 500 em solução de bloqueio) e soro policlonal de coelho anti-S100B (1: 500) ou anticorpo policlonal de coelho anti-HIF1α (1: 200) durante 60 min a 37 ° C num agitador de balanço.
  4. Alternativamente, alguns astrócitos são incubadas com anticorpo policlonal de coelho anti-IBA1 (1: 200) e seg ratooclonal anti-MAP2 para acessar a pureza da cultura.
  5. Aspirar anticorpo primário e enxaguar lamela pela adição de 1 mL de 0,1 M TBS e colocação num agitador de balanço por 2 min e depois aspirar. Repita duas vezes.
  6. Adicionar 0,2 ml de uma diluição 1: 200 dos anticorpos anti-coelho conjugados 568-488-conjugados e anti-ratinho de cabra secundário em solução de bloqueio durante 60 minutos a 37 ° C num agitador de balanço.
  7. Aspirar anticorpo secundário e enxaguar lamela pela adição de 1 mL de 0,1 M TBS e coloque num agitador de balanço por 2 min e depois aspirar. Repita duas vezes.
  8. Remover lamela de bem e seco, colocando em um slide posicionado sobre uma lâmina de cabelo. Mount lamela em um novo slide, invertendo em uma única gota de Vectashield hardset meio de montagem com DAPI (1,5 ng / mL).
  9. lamelas de imagem em um microscópio confocal usando 20X objetivo óleo seco ou 60X. Aquisição de imagens (512 x 512) para DAPI (405 nm ex / 450 nm em) e fluorocromo 488 etiquetado anticorpo GFAP (488 nm ex / 515 nmem). Manter parâmetros de aquisição constantes dentro do 20X e 60X grupos.

4. A determinação do sexo Usando PCR

  1. Calor pup dedo do pé ou dedo para recortes de 95 ° C durante 45 min em NaOH 50 mM e neutraliza-se com igual volume de Tris 1 M, pH 6,8.
  2. Adicionar 1 mL da solução de ADN extraído a 19 uL da mistura seguinte: 5 pmol de iniciadores para os genes Myog e Sry, 1x tampão de reacção, 0,2 mM de cada desoxinucleótido e 8 U de Taq polimerase.
  3. Use sequências de primers; Sry 5'TCATGAGACTGCCAACCACAG3 ', 5'CATGACCACCACCACCACCAA3' e Myog 5'TTACGTCCATCGTGGACAGC3 ', 5'TGGGCTGGGTGTTAGTCTTA3' 23.
  4. Executar o seguinte protocolo de PCR: 95 ° C durante 3 min, depois 30 ciclos de desnaturação a 95 ° C durante 15 s, emparelhamento a 58 ° C durante 15 s, e alongamento a 72 ° C durante 1 min. Seguindo esta 30 ciclos, a reacção termina com um final de 72 ° C alongamento durante 1 min.
  5. PC separadoProdutos R electroforeticamente num gel de brometo de etidio contendo 2% de agarose e visualização sob luz UV. (Figura 2A). CUIDADO! O brometo de etídio é um potencial cancerígeno e deve ser manuseado com cuidado e descartados de forma apropriada de acordo com os regulamentos da instituição.

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Resultados

Compreender os papéis de funções de astrócitos sexado em condições fisiológicas ou fisiopatológicas foram imensamente elucidada por cultura destas células sob condições in vitro. O aspecto importante da cultura realizando sexuado é para determinar o sexo do filhote de rato antes da sua utilização. Determinou-se o sexo do ratinho geneticamente por PCR e por avaliação visual (Figura 2) 16. A metodologia de determinação do sexo usando PCR foi aprovado co...

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Discussão

Para estudar as diferenças entre os sexos nas propriedades e função de astrócitos em condições fisiológicas e patológicas, preparação de astrócitos primários sexado em cultura celular é uma ferramenta importante para utilizar. No presente estudo relatamos um altamente eficiente e um método reprodutível à cultura uma população homogénea altamente enriquecido de astrócitos do hipocampo sexado de recém-nascidos (P0-P2) C57BL / 6 (tipo selvagem) ou K19F (GFAP null) filhotes de rato in vitro. Estabelecer esta metodo...

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Divulgações

Nenhum dos autores têm interesses concorrentes ou conflitantes.

Agradecimentos

Programa de Prêmio de Ciências Clínicas e Translacionais do NCATS UL1 TR0000427 e KL2 TR000428 (Cengiz P), UL1TR000427 para o UW ICTR do NIH / NCATS e fundos do Waisman Center (Cengiz P), K08 NS088563-01A1 do NINDS (Cengiz P) e NIH P30 HD03352 (Waisman Center), NIH / NINDS 1K08NS078113 (Ferrazzano P). Gostaríamos de agradecer a Albee Messing, PhD, por nos fornecer os camundongos nocaute GFAP.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Meio de cultura de astrócitos
DMEM, célula de alta glicose10-013-CV
ConcentraçãoGibco26050-07010%
Penicilina-EstreptomicinaCellgro 30-002-CIConcentração Final: 1%
de Cloridrato de L-Leucina ÉsterMetílico AldrichL1002-25GConcentração Final: 5 mM
Solução para digestão de tecidos cerebrais
HBSSLife Technologies14170-088
Tripsinacellgro25-050-CIConcentração Final: 0,25%
Outro
70% (vol/vol) etanolRoth9065.2
Poli-D-Lisina (PDL) 12 mm lamínulas redondas Corning354087
WaterSigmaW3500Grau de cultura de células
PBScellgro21-040-CVGrau de cultura de células
0,05% Tripsina-EDTA Life Technologies25300-062
70 μ m Filtro de células estéreis Fisher scientific22363548
placa de Petri de 3,5 cmBD Falcon353001
15 mL Tubo FalconBD Falcon352096
50 mL Tubo FalconFalcon352070
Fórceps, fino;Dumont2-1032; 2-1033# 3c; # 5
Fórceps, ponta planaKLS Martin12-120-11
Tesoura cirúrgica de 13 cmAesculapBC-140-R
NikonA1RSi 
CentrífugaEppendorf5805000.0175804R
Agitador OrbitalThermo ScientificSHKE 4450-1CEMaxQ 4450 
Anti-IBA1Wako019-19741Coelho monoclonal
Anti-MAP2SigmaM2320Camundongo monoclonal
Anti-HIF1alfaabcamab179483Coelho monoclonal
Anti-S100BSigmaHPA015768Coelho policlonal
Anti-GFAP (coquetel)Biolegend837602
VECTASTAIN Elite ABC Kit (Coelho IgG)Vector LabsPK-6101Contém 4 Reagentes 
Cabra Anti Coelho Alexa-Fluor 488InvitrogenA11070
Cabra Anti Mouse Alexa-Fluor 568InvitrogenA11004
Final : BD Microscópio Confocal

Referências

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