Artigo de método
Os astrócitos são um dos principais intervenientes mais importantes no sistema nervoso central (SNC). Aqui, nós estamos relatando um método prático de protocolo de cultura de astrócitos do hipocampo sexuado, a fim de estudar os mecanismos subjacentes a função de astrócitos em filhotes recém-nascidos do sexo masculino e feminino após isquemia in-vitro.
Astrogliosis seguinte hipóxia / isquemia (HI) lesão cerebral -relacionados desempenha um papel no aumento da morbidade e mortalidade em recém-nascidos. Estudos clínicos recentes indicam que a gravidade da lesão cerebral parece ser dependente do sexo, e que os machos recém-nascidos são mais susceptíveis aos efeitos de lesões cerebrais relacionadas-HI, resultando nos resultados neurológicos mais graves, em comparação com mulheres com lesões cerebrais comparáveis. O desenvolvimento de métodos confiáveis para isolar e manter populações altamente enriquecido de astrócitos do hipocampo sexuado é essencial para compreender a base celular das diferenças sexuais nas consequências patológicas de HI neonatal. Neste estudo, descrevemos um método para a criação de culturas de astrócitos do sexo específicos do hipocampo que são submetidos a um modelo de isquemia in vitro, a privação de oxigénio-glicose, seguida por reoxigenação. astrogliosis reactiva subsequente foi examinado por immunostaiNing para a proteína glial fibrilar ácida (GFAP) e a S100B. Este método fornece uma ferramenta útil para estudar o papel do sexo masculino e astrócitos do hipocampo do sexo feminino seguinte HI neonatal, separadamente.
Os astrócitos são um dos principais intervenientes mais importantes no sistema nervoso central (SNC). Crescente corpo de evidências indica que os papéis de astrócitos são mais do que apoio neuronal. Na verdade, o papel dos astrócitos em condições fisiológicas pode ser muito complexo, tais como guiar a migração de axónios em desenvolvimento 1, regulando SNC fluxo de sangue 2, a manutenção da homeostase do sináptica fluido intersticial 3 pH, e participam na barreira hemato-encefálica 4 e 5 da transmissão sináptica. Em condições patológicas, astrócitos responder a uma lesão com um processo chamado astrogl....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
NOTA: Este estudo foi realizado de acordo com a recomendação do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do Instituto Nacional de Saúde. O protocolo animal foi aprovado pela Universidade de Wisconsin-Madison, Institutional Animal Care e do Comitê Use. Protocolo de Cultura Astrocyte primário que é apresentado aqui é adotada a partir dos protocolos apresentados por Zhang Y 19 et al. E Cengiz P 20 et al., Com algumas modificações.
1. hipocampo Dissecção e Cultura Astrocyte
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Compreender os papéis de funções de astrócitos sexado em condições fisiológicas ou fisiopatológicas foram imensamente elucidada por cultura destas células sob condições in vitro. O aspecto importante da cultura realizando sexuado é para determinar o sexo do filhote de rato antes da sua utilização. Determinou-se o sexo do ratinho geneticamente por PCR e por avaliação visual (Figura 2) 16. A metodologia de determinação do sexo usando PCR foi aprovado co.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Para estudar as diferenças entre os sexos nas propriedades e função de astrócitos em condições fisiológicas e patológicas, preparação de astrócitos primários sexado em cultura celular é uma ferramenta importante para utilizar. No presente estudo relatamos um altamente eficiente e um método reprodutível à cultura uma população homogénea altamente enriquecido de astrócitos do hipocampo sexado de recém-nascidos (P0-P2) C57BL / 6 (tipo selvagem) ou K19F (GFAP null) filhotes de rato in vitro. Estabelecer esta metodo.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Nenhum dos autores têm interesses concorrentes ou conflitantes.
Programa de Prêmio de Ciências Clínicas e Translacionais do NCATS UL1 TR0000427 e KL2 TR000428 (Cengiz P), UL1TR000427 para o UW ICTR do NIH / NCATS e fundos do Waisman Center (Cengiz P), K08 NS088563-01A1 do NINDS (Cengiz P) e NIH P30 HD03352 (Waisman Center), NIH / NINDS 1K08NS078113 (Ferrazzano P). Gostaríamos de agradecer a Albee Messing, PhD, por nos fornecer os camundongos nocaute GFAP.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Meio de cultura de astrócitos | |||
| DMEM, célula de alta glicose | 10-013-CV | ||
| Concentração | Gibco | 26050-070 | 10% |
| Penicilina-Estreptomicina | Cellgro | 30-002-CI | Concentração Final: 1% |
| de Cloridrato de L-Leucina Éster | Metílico Aldrich | L1002-25G | Concentração Final: 5 mM |
| Solução para digestão de tecidos cerebrais | |||
| HBSS | Life Technologies | 14170-088 | |
| Tripsina | cellgro | 25-050-CI | Concentração Final: 0,25% |
| Outro | |||
| 70% (vol/vol) etanol | Roth | 9065.2 | |
| Poli-D-Lisina (PDL) 12 mm lamínulas redondas | Corning | 354087 | |
| Water | Sigma | W3500 | Grau de cultura de células |
| PBS | cellgro | 21-040-CV | Grau de cultura de células |
| 0,05% Tripsina-EDTA | Life Technologies | 25300-062 | |
| 70 μ m Filtro de células estéreis | Fisher scientific | 22363548 | |
| placa de Petri de 3,5 cm | BD Falcon | 353001 | |
| 15 mL Tubo Falcon | BD Falcon | 352096 | |
| 50 mL Tubo Falcon | Falcon | 352070 | |
| Fórceps, fino; | Dumont | 2-1032; 2-1033 | # 3c; # 5 |
| Fórceps, ponta plana | KLS Martin | 12-120-11 | |
| Tesoura cirúrgica de 13 cm | Aesculap | BC-140-R | |
| Nikon | A1RSi | ||
| Centrífuga | Eppendorf | 5805000.017 | 5804R |
| Agitador Orbital | Thermo Scientific | SHKE 4450-1CE | MaxQ 4450 |
| Anti-IBA1 | Wako | 019-19741 | Coelho monoclonal |
| Anti-MAP2 | Sigma | M2320 | Camundongo monoclonal |
| Anti-HIF1alfa | abcam | ab179483 | Coelho monoclonal |
| Anti-S100B | Sigma | HPA015768 | Coelho policlonal |
| Anti-GFAP (coquetel) | Biolegend | 837602 | |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit (Coelho IgG) | Vector Labs | PK-6101 | Contém 4 Reagentes |
| Cabra Anti Coelho Alexa-Fluor 488 | Invitrogen | A11070 | |
| Cabra Anti Mouse Alexa-Fluor 568 | Invitrogen | A11004 |
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE
Solicitar permissão