O objetivo deste protocolo é para descrever um deficitária e ganhar-de método de função que é aplicável para identificar neogenin como um receptor específico de estágio que leva a trofectoderma e diferenciação massa celular interna de embriões de ratos pré-implantação.
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Artigo de método
Deficitária e Abordagem de ganho de função para Investigar celular precoce Destino Determinantes na pré-implantação embriões de camundongos
Neste artigo
Resumo
Resumo
As técnicas de silenciamento e superexpressão de genes são fundamentais para a identificação de genes envolvidos no desenvolvimento embrionário. A modificação direta do gene alvo em embriões pré-implantação fornece um meio de estudar os mecanismos subjacentes dos genes implicados, por exemplo, na diferenciação celular no trofectoderma (TE) e na massa celular interna (ICM). Aqui, descrevemos um protocolo que examina o papel da neogenina como um receptor autêntico para a determinação do destino celular inicial em embriões de camundongos pré-implantação. Primeiro, discutimos as manipulações experimentais que foram usadas para produzir ganho e perda da função da neogenina por microinjeção de cDNA e shRNA de neogenina; a eficácia dessa abordagem foi confirmada por uma forte correlação entre os níveis de expressão em pares da proteína fluorescente vermelha (RFP) ou da proteína fluorescente verde (GFP) e a quantificação imunocitoquímica da expressão de neogenina. Em segundo lugar, a superexpressão de neogenina em embriões de camundongos pré-implantação leva ao desenvolvimento normal do ICM, enquanto o knockdown da neogenina faz com que o ICM se desenvolva de forma anormal, o que implica que a neogenina pode ser um receptor que retransmite pistas extracelulares para conduzir os blastômeros ao destino celular inicial. Dado o sucesso deste protocolo detalhado na investigação da função de um novo receptor específico do estágio de desenvolvimento embrionário, propomos que ele tenha o potencial de auxiliar na exploração e identificação de outros genes específicos do estágio durante a embriogênese.
Introdução
Preimplantation o desenvolvimento embrionário pode ser dividido em várias fases distintas, a partir do estádio de uma célula para a mórula e blastocisto. Muito evidência sugere que a polaridade e indicadores de posicionamento desempenhar um papel na determinação do destino da célula precoce no trofectoderma (TE) e a massa celular interna (ICM). No entanto, a natureza dos sinais, como eles são transduzidas em sinais celulares, e os contextos fisiológicos em que tais sinais são capazes de iniciar a diferenciação linhagem de células não são conhecidos. Estas células diferenciadas, em seguida, submetidos a especialização, começando a assumir estruturas características e funções necessárias para a formação de embriões adequada e crescimento da placenta 1-3.
embriões pré-implantação são particularmente propício à manipulação por injecção directa de material genético modificados como siRNA ou de cDNA alvo e, portanto, pode ser utilizada para estudar moléculas alvo específicas. Há uma crescente compreensão de que genéticaA análise de embriões de vertebrados é fundamental para fazer avançar nossa compreensão do desenvolvimento embrionário 4. introdução exacta de um gene de tipo selvagem ou uma sua forma mutante em um embrião num contexto oportuna para realizar gain- ou perda de função do gene tem grandemente facilitado o estudo de genes regulados relativamente ao desenvolvimento. Deficitária e ganhar de função através de microinjecção de materiais genéticos em embriões não-mamíferos e mamíferos primeiros individuais é relativamente simples por causa de seu grande tamanho e grande receptividade 5. A microinjecção é tipicamente realizada usando vectores não virais. vantagem particular foi tomada em consideração a facilidade de utilização de vectores não virais mais de vetores virais e transgenes. A perda-rápido ou sistema de expressão de ganho de função em embriões de camundongos foi desenvolvida que nos permite dissecar e entender as funções dos genes na embriologia dos vertebrados 6,7.
marcação fluorescente de embriões facilitaria enormemente a seleção de microinjected ou geneticamente manipulado embriões e, ao mesmo tempo conceder um meio para quantificar indirectamente o nível de expressão de ADNc ou siRNA microinjectados com base na intensidade de fluorescência 8. Para realizar esta rotulagem, ADNc de proteína fluorescente, GFP ou RFP, são co-injectados quer como construções de fusão ou separadamente. A intensidade da fluorescência da GFP ou RFP revela a extensão de expressão de siRNA ou DNA estranho para assegurar que deficitária ou ganho-de-função tem sido realizado.
Aqui, apresentamos um protocolo de micromanipulação para a técnica função deficitária e ganho-de- que nos permitiu identificar neogenin como um receptor que transmite sinais extracelulares importantes na diferenciação celular no início de embriões de ratos pré-implantação.
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Protocolo
NOTA: Todos os procedimentos para a criação e dos cuidados dos animais foram realizados de acordo com os regulamentos IACUC da Universidade Sahmyook, Seul, Coreia do Sul.
1. A superovulação, Reprodução e isolamento Oviduto
- Manter consanguíneos C57BL / 6 com as seguintes condições: 22 ± 3 ° C, ~ 60% de humidade, 12 h ciclo de luz / escuro, e água e comida ad libitum.
- Induzir a superovulação de camundongos fêmeas de 3-5 semanas de idade, por uma injecção intraperitoneal de 5 IU égua prenhe gonadotrofina sérica (PMSG) em 0.1 ml / cabeça seguido de 48 horas mais tarde por uma injecção intraperitoneal de 5 UI gonadotrofina coriônica humana (hCG) em 0.1 ml /cabeça.
- Imediatamente após a injecção de hCG, companheiro fêmeas induzida por superovulação com machos sexualmente maduros da mesma estirpe, mantendo-os na mesma gaiola durante a noite.
- Na manhã seguinte, confirmar acasalamento bem-sucedido pela presença de um tampão de acoplamento ou rolhão vaginal sobre o aparelho genital feminino.
- Sacrificar ratos fêmea grávidapor CO 2 intoxicação seguido por deslocamento cervical 18-20 h após a injecção de hCG.
- Abrir a cavidade abdominal através do corte da pele e, em seguida, a camada peritoneal com uma tesoura fina.
- Pegar os cornos uterinos com uma pinça fina e puxe para fora do útero, oviduto, ovário e almofada de gordura suavemente da cavidade corporal.
- Corte a área entre o oviduto e do ovário com uma tesoura fina. Reposicionar a pinça e cortar o útero perto do oviduto, deixando, pelo menos, 1 cm da parte superior do útero em anexo.
- Transferir a ampola oviductal a um prato de 35 milímetros de Petri contendo meio de M16 à temperatura ambiente. Reúnem-se os ovidutos de vários murganhos no mesmo prato.
- Coloque os pratos sob um microscópio estereoscópico para a recuperação de embriões.
2. Recuperação e Cultura de 2-Pronuclear (2-PN) Embriões
- Corte a extremidade de um G agulha hipodérmica 30 ou 32, transformá-lo em uma ponta romba, e usá-lo como uma agulha de lavagem.
- Usaruma pinça fina para fazer deslizar a extremidade do oviduto para a agulha de descarga. Pressione suavemente a ponta da agulha de lavagem contra o fundo do prato para segurá-la no lugar. Lavar o oviduto com ~ 0,1 mL de meio M16 para libertar os embriões 2-Pn para uma placa de Petri.
- Recuperar os embriões 2-PN, juntamente com áreas massas cumulus do meio M16 corado sob o microscópio estereoscópico usando uma pipeta de vidro esterilizado e transferi-los para uma nova placa de Petri.
- Separar as células do cumulus dos embriões 2-Pn por digestão enzimática com 1,0 ml de 0,1-0,5% de hialuronidase em solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) a 37 ° C durante 5-10 min.
- Desnudar embriões pipetando suavemente com uma pipeta de vidro e remoção física das células do cumulus.
- Lavar embriões desnudadas três vezes com 30-50 mL de fresco salino tamponado com fosfato (PBS) por embrião.
- Incubar embriões em uma placa de Petri de plástico de 35 milímetros em meios M16 suplementado com 10 mg / ml de albumina de soro bovino (BSA, Fractião V) a 37 ° C em 5% de CO2 num incubador humidif içado até que a micro-injecção é feito, que é geralmente inferior a 4 horas mais tarde.
3. Embrião Transcrição Reversa (RT) e Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR)
- Recolher pelo menos 10 embriões de cada estágio até ao estádio de blastocisto e reuni-los em 4,0 mL de 5x transcriptase solução de pré-mistura reversa contendo a transcriptase inversa, um inibidor de RNase, iniciador oligo dT, 6mers aleatórios, mistura de dNTP, e o tampão de reacção numa tubo de PCR.
- Adicionar isento de ARNase H2O destilada até um volume total de 20 ul e sonicar os embriões reunidas durante 30 segundos a 200 W. Inicia-se a reacção de RT imediatamente a 42 ° C durante 1 h seguido de 5 minutos de incubação a 95 ° C.
- Para cada 5,0 ml de solução de ADNc gerado, realizar a amplificação de PCR normal com iniciadores para neogenin, Cdx2, Sox2, Tead4, Nanog, sequências iniciadoras OCT3 / 4, ou β-actina (dado na Tabela 1. PCR consiste em 40 ciclos de 15 seg de incubação a 95 ° C, 30 segundos à temperatura de emparelhamento (mostrada na Tabela 1), e 30 seg a 72 ° C.
- Os produtos de PCR separados por electroforese em gel de agarose a 2% e visualizar o gel com luz UV, após coloração com brometo de etídio.
- Normalizar a expressão do gene alvo contra os níveis de beta-actina.
4. Imunocitoqu�ica de Embriões
- Fix embriões de cada fase com paraformaldeído a 4% em PBS durante 30 min à temperatura ambiente seguido por uma breve lavagem 3 vezes com PBS contendo 0,01% de BSA.
- permeabilizar as membranas celulares por incubação de embriões de 10 em 1,0 ml de PBS contendo 0,1% de Tween 20 e 0,1% de Triton X-100 à temperatura ambiente durante 10 min.
- Para bloquear a ligação não específica incubar os embriões permeabilizadas em 1,0 ml de PBS suplementado com soro de cabra normal a 10% durante 30 min à temperatura ambiente.
- Incubar a embriões sagacidade bloqueadoh coelho anticorpos anti-neogenin em diluição 1: 100 em PBS contendo BSA a 0,1% durante a noite a 4 ° C.
- Depois de três lavagens de 30 s cada em gotas de PBS, incubar os embriões com qualquer Alexa IgG de cabra anti-coelho 488-conjugado ou de IgG de cabra anti-coelho de 568 conjugado com Alexa diluição de 1: 500 em solução de PBS / BSA a noite a 4 ° C .
- Para visualizar os filamentos de actina, incubar os embriões em 1 ug / ml em PBS faloidina durante 1 h à temperatura ambiente.
- Manchar os núcleos por adição de 5 ml de PBS contendo 1 ug / ml de DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindole, dicloridrato) durante 5 min à temperatura ambiente.
- Lavar embriões três vezes brevemente com PBS.
- Transferir os embriões para uma lâmina de vidro e cobri-los com uma gota de óleo mineral.
- Captar imagens de 1000X de ampliação com um microscópio confocal com uma excitação do comprimento de onda apropriado.
5. Preparação de neogenin-RFP e neogenin-siRNA GFP Plasmids
- Subclonar cDNA que codifica neogenin do mouse em uma proteína fluorescente vermelha (RFP) molecular contendo vector, resultando em neogenin-flag-RFP.
- Subclone pequeno ARN em gancho de segmentação neogenin para uma proteína fluorescente verde esmeralda (EmGFP) molecular contendo vector, resultando em pcDNA-EmGFP-miR-neogenin (mostrado na Figura 1).
- Amplificar tanto neogenin-flag-RFP e plasmídeos pcDNA-EmGFP-miR-neogenin e purificá-los com os métodos convencionais.
- Ajustar as concentrações finais de plasmídeos para ~ 1,0 ug / ml em tampão estéril de Tris-EDTA (TE).
6. A microinjecção de plasmídeos em 2-PN Embriões
- Lave as desnudas 2-PN embriões uma vez, brevemente, com a mídia M16 frescos.
- Centrifugar os embriões 2-Pn durante 10 min a 1000 x g numa centrífuga de bancada para permitir a observação dos pró-núcleos.
- Incubar os embriões em uma micro gota de 20-30 ul de meios de M16 por embrião sob óleo mineral a 37 ° C em 5% de CO 2 durante um additional 1-2 h.
- Fabricação pipetas de injeção e pipetas segurando puxando tubos capilares de borosilicato de vidro (OD = 1,2 mm; ID = 0,94 mm) com um extrator mecânico.
- Fabricar pipetas de injeção ter blunt dicas e aberturas polidas de
- Fabricar segurando pipetas de tal modo que eles têm pontas rombas e aberturas polida com um diâmetro interior de 20 um e um diâmetro externo de 100 um.
- pipetas de injecção de carga com uma quantidade suficiente (> 200 nl) de uma solução de plasmídeo em 1,0 ug / uL.
- Microinject ~ 10 ul de uma solução de plasmídeo para cada embrião 2-PN em um dos pró-núcleos utilizando um microinjector ligada a um micromanipulador motorizado; durante este processo, manter os embriões em posição através da aplicação de pressão negativa com uma pipeta de exploração.
- Após a microinjeção, lave os embriões de 2 PN 3 vezes com meios M16 fresco para lESS de 1 min de cada vez.
- Cultura de embriões 2-Pn em uma gota de meios frescos M16 em uma placa de cultura de plástico coberta por uma gota de óleo mineral para evitar a evaporação meios.
- Observe os embriões em intervalos de 24 horas, sob um contraste de interferência diferencial (DIC) microscópio invertido na ampliação de 200X.
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Resultados
Descobrimos que neogenin é transitoriamente expressa durante os primeiros estágios de desenvolvimento de embriões de ratos pré-implantação, aparecendo tão cedo quanto na fase 2-célula e duradoura até o início mórula mas tornar-se deficiente no final de mórula e estádios de blastocisto (Figura 2A). Além disso, a distribuição espacial da neogenin estava restrita principalmente para fora das células. Os resultados das análises de RT-PCR foram consistentes com a natureza tra...
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Discussão
No presente protocolo, demonstramos novos métodos de microinjecção de materiais genéticos, quer cDNA ou shRNA, para os embriões de ratos de 2 PN para explorar o papel da neogenin na diferenciação celular precoce durante a embriogênese mouse. A modificação genética de embriões pré-implantação é uma técnica poderosa para a descoberta de informações importantes sobre os mecanismos subjacentes moleculares para, por exemplo, a primeira determinação linhagem celular. A modificação genética é um dos métodos mais utilizados par...
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Divulgações
Os autores não têm interesses financeiros concorrentes para divulgar.
Agradecimentos
Os autores também gostaria de reconhecer o grupo do Dr. Xiong na Universidade de Ciências da Saúde da Geórgia para a fabricação e compartilhando as construções para neogenin vetores de cDNA e shRNA. Este estudo foi apoiado por bolsas do Programa Básico de pesquisa da ciência (2013R1A1A4A01012572) financiado pela Fundação coreana Investigação e por uma bolsa de investigação da Universidade Sahmyook.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| M16 médio, | Gibco BRL (Grand Island, NY) | M7292 LOTE# 11A832 | |
| Soro de cabra, | Dako (Glostrup, Dinamarca) | X0907 | |
| PMSG | Folligon, Intervet, Holanda | G4877-1000IU LOTE#SLBD0719V | |
| Óleo mineral | Sigma Aldrich | CG5-1VL LOTE# SLBC6783V | |
| gonadotrofina coriônica humana e gonadotrofina sérica de égua grávida | (Intervet, Holanda) | (invitrogen, 15596-026) | |
| SuperScript® III Transcriptase reversa | lifetechnologies | 18080-044 | |
| PCR pré-mistura | ( Bioneer, Daejon, Coréia do Sul) | GenDEPOT, A0224-050 | |
| Agarose (grau molecular) | BioRad | 161-3101 | |
| Solução de Paraformaldeído, 4% em PBS | Affymetrix EUA | 19943 | |
| anticorpo policlonal anti-neogenina de coelho | Santa Cruz Biotechnology, US | SC-15337 | |
| Alexa fluor 488 marcado anticorpo anti-coelho | Sondas Moleculares (Invitrogen, EUA) | A-11094 | |
| Alexa fluor 555 marcado anti-coelho | anticorpo Molecular Probes (Invitrogen, EUA) | A-21428 | |
| Alexa Fluor® 555 Phalloidin | Molecular Probes (Invitrogen, EUA) | A34055 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen, USA | D1306 | |
| Recombinante Humano RGM-C/Hemojuvelin | R&;D sistemas | 3720-RG | |
| todas as construções de plasmídeos | Prof. Wen Cheng Xiong na Universidade de Ciências da Saúde da Geórgia (Agusta, GA). | para os presentes estudos foram gentilmente cedidos por | |
| Neon® Sistema de Transfecção | lifetech | MPK10096 | |
| Microscrope Estéreo | Nikon | SMZ1000 | |
| Sistema de Micromainpulation com Nikon | Nikon | Narishige ONM-1 | |
| Micro Injetor | Nikon Narishige | GASTIGHT #1750 | |
| Suporte | Nikon Narishige | Narishige IM 16 | |
| Microfuge | Nikon Narishige | Moedor Narishige MF-900 | |
| Extrator Narishige | EG400 | ||
| Instrumnet company | P-97 | ||
| Incubadora CO2 | Thermo Scientific Forma | EW-39320-16 | |
| Veriti® 384-Well Thermal Cycler | Tecnologias de Vida | 4388444 |
Referências
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Reimpressões e permissões
