Aqui nós apresentamos um romance Ca 2+ -Imaging abordagem usando um repórter bioluminescente. Esta abordagem utiliza um GFP-aequorina constructo fundido que se liga a Ca 2+ e emite luz, eliminando a necessidade de excitação da luz. Significativamente este método permite imagem longa e contínua, o acesso a estruturas cerebrais profundas e alta resolução temporal.
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Artigo de método
In Vivo funcional do cérebro Imagiologia Abordagem Baseada em cálcio Bioluminescent Indicador GFP-aequorina
Neste artigo
Resumo
Resumo
Funcional em imagiologia in vivo tornou-se uma abordagem poderosa para o estudo da fisiologia e função de células e estruturas de interesse cerebrais. Recentemente, um novo método de Ca 2+ -Imaging utilizando o repórter GFP-aequorina bioluminescente (GA) foi desenvolvido. Esta nova técnica baseia-se na fusão dos genes GFP e aequorina, produzindo uma molécula capaz de ligação de cálcio e - com a adição de celenterazina seu cofactor - emissor de luz brilhante que pode ser monitorizado através de um colector de fotões. As linhas transgénicas que transportam o gene de GFP-aequorina foram gerados para ambos os ratos e de Drosophila. Em Drosophila, o gene GFP-aequorina foi colocado sob o controlo do sistema de expressão binário de GAL4 / UAS permite a expressão específica e de imagem no interior do cérebro. Este método tem sido mostrado subsequentemente que ser capaz de detectar tanto para dentro de Ca2 + e Ca 2+ -transients -released interiores de lojas. Mais importante que permite uma maior duração em gravação contínua, imagens em maiores profundidades no interior do cérebro, e gravar em altas resoluções temporais (até 8,3 ms). Aqui nós apresentamos o método básico para usar a imagem de bioluminescência para registrar e analisar Ca 2+ -Atividade dentro dos corpos de cogumelo, uma estrutura central para o aprendizado e memória no cérebro da mosca.
Introdução
A padronização e função de atividade dentro do cérebro e suas estruturas discretas fundamentais são há muito tempo uma área de intenso estudo no campo da neurociência. Talvez algumas das primeiras abordagens de sucesso utilizadas para resolver este problema foram mensuração fisiológica direta da mudança na atividade elétrica - métodos no entanto alternativas que permitem imagens ao vivo de alterações nas concentrações de tensão, de pH ou de cálcio (como proxy para a atividade) trouxe recursos adicionais para o estudo da actividade neuronal 1. Técnicas de imagem transportar uma grande variedade de vantagens, tais como a redução da capacidade de invasão e a ....
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Protocolo
1. Preparação de Amostras
- Preparação das soluções e configurar
- Manter todas as linhas de Drosophila melanogaster a 24 ° C em meio padrão comida. Traseira e mantê-los em baixa densidade no frasco para gerar tamanho padronizado e peso de moscas.
- Adicionar 10 fêmeas virgens com 10 homens em um frasco, deixá-los acasalar e transferi-los a cada 2 dias para um novo frasco. Em seguida, 10 dias mais tarde, quando as moscas começar a EFeche, colher as moscas a cada dia. Mantenha um registro preciso da idade das moscas e mantê-los em boas condições.
- No dia 3, separar os machos das fêmeas e manter as moscas fêmeas 20 por frasco. G....
- Manter todas as linhas de Drosophila melanogaster a 24 ° C em meio padrão comida. Traseira e mantê-los em baixa densidade no frasco para gerar tamanho padronizado e peso de moscas.
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Resultados
A fusão de GFP a aequorina permite visualizar a região de interesse antes da imagem de bioluminescência através da excitação de GFP em modo fluorescente no microscópio (Figura 3A, 4A, 6A, 6E). Uma das maneiras mais simples para estimular os corpos de cogumelo é através da activação dos receptores nicotínicos de acetilcolina ionotrópicos. Embora a acetilcolina é o ligando endógeno deste receptor, descobrimos que a nicotina produz respostas mais reprodutíveis nos corpos de cogumelo. Isto é em parte porque.......
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Discussão
A abordagem de GFP-aequorina à base bioluminescente recentemente desenvolvido aqui apresentada permite a gravação funcional in vivo de Ca 2+ -Atividade em diferentes neurónios, assim como, se desejado, em outro tipo de células, tais como células estreladas rim como relatado em Cabrero et ai. de 2013 5.
Modificações, resolução de problemas, componentes adicionais e etapas críticas
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Estamos em dívida com E. Karplus, da Sciences Wares, EUA, por sua preciosa e útil ajuda e conselhos. Agradecemos a E. Carbognin, A. Avet-Rochex, M. Murmu, P. Pavot, D. Minocci, G. Vinatier e J. Stinnakre por sua contribuição para o desenvolvimento e aprimoramento desta técnica. Agradecemos também a B. Pfeiffer e G. Rubin, Janelia Farm, H.H.M.I., Ashburn, EUA, pela linha pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP. Este trabalho foi apoiado pela Chateaubriand Fellowship, Embaixada da França, Washington, EUA para A. Lark, pela National Science Foundation (IOS 1352882) para T. Kitamoto e pelos ANRs franceses (ANR-05-NEUR-009 Drosaequorin, 2005, e FlyBrainImaging, 2011), o Conseil Régi....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| CaCl2 | Merck | 1023911000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| KCl | prolabo | 26 764.298 | normapur |
| MgCl2 | prolabo | 25 108.295 | normapur |
| sacarose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Nicotina | Sigma-Aldrich | N3876 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | Adenosina 5′-trifosfato sal dissódico hidrato |
| benzil-coelenterazina | Prolume, nanolight | Cat #301 Coelenterazina h | http://www.prolume.com/ |
| cola dental | 3M ESPE™ | 46954 | Protemp IV |
| 3M ESPE™ | 36958 | Express 2 Fita rápida de corpo regular | |
| 3M Scotch | 122s | 3M Scotch Magic Tape | |
| pontas de pipeta | Corning Incorporated | 4868 | 100-1,000 µ l Ponta de Pipeta Univesal |
| câmara e suporte (palco) | |||
| de incubação | |||
| fórceps feita à mão (No. 5) | Ferramentas de Ciência Fina | 11252-00 | Fórceps Micro-dissecante fórceps |
| curvados | Sigma-Aldrich | F4142 | Pinça Micro-dissecante |
| aplicador de cola | Feito à mão | ||
| faca | Fine Science Tools | 10316-14 | 5 mm Profundidade 15° facada |
| câmera EM-CCD | Andor | DU-897E-CS0-#BV | iXon (resfriado a -80 ° C) |
| Microscópio | Nikon | Eclipse-E800 | |
| lente objetiva de imersão | Nikon | 20X Fluor .5w | |
| microscópio de dissecção com fluorescência | Leica MZ Fl III | escopo de dissecção leica e lâmpada fluorescente | |
| caixa escura apertada | Science Wares | Custom built by Science Wares | |
| bomba peristáltica | Tubulação Gilson | Minipuls 2 | |
| Fisher Scientific | depende da espessura | Tygon R3603, sistema de perfusão St-Gobain | |
| Warner | 64-0135 ( VC-66CS) | Sistema de controle de válvula de perfusão, completo, com válvulas de aperto, | |
| reguladores de perfusão | Leventon | 201108 | Dosi-flow 3 |
| explorador de medição e automação | Ciências Wares & Software N | /A | http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| imager de fótons | Artigos científicos e Software National Instruments | N/A | http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| visualizador de fótons | Ciência Mercadorias & National Instuments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| Excel | Microsoft | N/A | software https://www.microsoft.com |
| virtual dub | acesso aberto | Software N/A | http://virtualdub.sourceforge.net/ |
| UAS-GA2 | Martin et al., 2007, Ref. 1 | N/A | Sem ações {atualmente} disponíveis publicamente |
| pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP | B. Pfeiffer, Janelia Farms, Ashburn EUA. | (ESTOQUE #1117340) | pfeifferb@janelia.hhmi.org |
| P2X2 | Lima e Misenboeck, Ref. 11 | N/A | Sem ações {atualmente} disponíveis publicamente |
| OK107 | Centro de estoque de Bloomington | 854 | http://flystocks.bio.indiana.edu/ |
Referências
- Martin, J. -R. In vivo brain imaging: fluorescence or bioluminescence, which to choose. J Neurogenet. 22 (3), 285-307 (2008).
- Shimomura, O., Johnson, F. H. Peroxidized coelenterazine, the active group in the photoprotein aequorin. Proc Natl Acad Sci....
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Reimpressões e permissões
