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Artigo de método

A estimulação de corrente contínua e Multi-eletrodo de gravação matriz de perda de consciência em Ratos Cérebro Slice Preparação

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DOI:

10.3791/53709

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7 de junho de 2016

 ,  ,  , 
1Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, 2Department of Anesthesiology, University of Alabama at Birmingham

Neste artigo

Resumo

Estudos mostraram que a estimulação transcraniana catódica por corrente contínua pode produzir efeitos supressivos em convulsões resistentes a medicamentos. Neste estudo, foi desenvolvido um arranjo experimental in vitro no qual a estimulação por corrente contínua e o registro de multieletrodos da atividade semelhante a convulsões foram avaliados na preparação de fatias de cérebro de camundongos. Os parâmetros de estimulação por corrente contínua foram avaliados.

Resumo

Catódica transcraniana estimulação de corrente contínua (ETCC) induz efeitos supressores sobre as apreensões resistentes aos medicamentos. Para executar ações efetivas, os parâmetros de estimulação (por exemplo, orientação, força de campo, e duração de estimulação) precisam ser examinadas em preparações fatia ratos cerebrais. Testes e providenciar a orientação do eléctrodo em relação à posição da fatia de cérebro ratinhos são viáveis. O presente método preserva a via thalamocingulate para avaliar o efeito de DCS sobre as actividades do tipo convulsivas córtex cingulado anterior. Os resultados das gravações de matriz multicanal indicou que catódica DCS diminuiu significativamente a amplitude das respostas evocadas por estimulação e a duração de 4-aminopiridina e perda de consciência induzida por bicuculina. Este estudo também descobriu que as aplicações DCS catódica em 15 min causou depressão a longo prazo na via thalamocingulate. O presente estudo investiga os efeitos da DCS em thalamocingulate plasticidade sináptica e atividades agudas apreensão-like. O processo actual pode testar os parâmetros de estimulação óptima incluindo a orientação, intensidade de campo, e a duração de uma estimulação in vitro no modelo de ratinho. Além disso, o método pode avaliar os efeitos da DCS sobre as atividades do tipo convulsivas corticais em ambos os níveis celulares e de rede.

Introdução

A epilepsia é um distúrbio neurológico comum. Trinta por cento dos pacientes com epilepsia sofrem de convulsões resistentes a medicamentos1. A estimulação transcraniana por corrente contínua (ETCC) fornece uma abordagem não invasiva para controlar ou alterar as atividades da rede em grandes áreas do cérebro, como convulsões. Estudos clínicos mostraram que a ETCC trata efetivamente as convulsões intratáveis2 e pode produzir efeitos supressivos de curto e longo prazo nas convulsões3-5. No entanto, o mecanismo terapêutico das ações da ETCC ainda não está claro. O modelo de fatia cerebral apresentado é um método in vitro para investigar como o mecanismo terapêutico das ações da ETCC altera os sintomas de atividades cerebrais semelhantes a convulsões. Assim, para alcançar seus efeitos ideais, parâmetros específicos de estimulação, incluindo orientação, intensidade de campo e duração da estimulação, precisam ser testados em um modelo experimental. Estudos anteriores mostraram que a orientação do campo elétrico é importante para a obtenção de efeitos terapêuticos6. Assim, testar e organizar a orientação dos eletrodos em relação à posição da fatia de cérebro testada é viável.

A epilepsia do lobo frontal e as convulsões do córtex cingulado anterior (ACC) são frequentemente resistentes a medicamentos7,8. Alguns estudos relataram a aplicação da ETCC no córtex cingulado9-11. A ETCC demonstrou afetar a vigilância, a tomada de decisão e a emoção por meio da alteração das atividades do ACC, e pode modular a excitabilidade neuronal e a atividade convulsiva nessa região do cérebro12. Portanto, os efeitos supressores da ETCC nas convulsões do ACC podem ser úteis para o tratamento clínico e a avaliação de tratamentos alternativos.

O presente protocolo descreve a preparação de um eletrodo na câmara de registro para DCS de uma fatia de cérebro e seu efeito no registro da atividade semelhante a uma convulsão com um arranjo de multieletrodos (MEA).

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Protocolo

Procedimentos que envolvem indivíduos animais foram aprovados pelo Cuidado Institucional Animal e Comité de Utilização, Academia Sinica, Taipei, Taiwan.

1. Preparar Solução Experimental e Equipamentos para multieletrodo gravação matriz

  1. Prepare artificial fluido cerebrospinal (aCSF; NaCI 124 mM, KCl 4,4 mM, 1 mM de NaH 2 PO 3, MgSO 2 mM de 4, 2 mM de CaCl2, mM de NaHCO 25, 3, e 10 mM de glucose, borbulhado com 95% de O 2 e 5% de CO 2).
  2. Usar dois tipos de sondas MEA: 6 x 10 planar MEA e 8 x 8 MEA. O ex capas de sonda da região que compreende o córtex, corpo estriado, e tálamo. A última sonda abrange apenas a região cortical.
  3. Usar um amplificador de 60 canais com um filtro passa-faixa situada entre 0,1 Hz e 3 kHz a 1.200 amplificação. Aquisição de dados em uma taxa de amostragem de 10 kHz.
  4. Coloque dois fios de prata AgCl-revestidos no interior da câmara de MEA para DCS. Use o AgClfios de prata -Revestido para produzir campos elétricos que são gerados por um estimulador isolado.
  5. Coloque um eletrodo de tungstênio (diâmetro, 127 mm, comprimento, 7,62 cm; 8 ° AC ponta cônica, resistência, 5 mohms) para a estimulação do tálamo, e colocar o eletrodo de referência na câmara de MEA. Entregar correntes do eléctrodo de tungsténio usando um estimulador isolado que é controlado por um gerador de impulsos.

2. Cérebro Slice Preparação

  1. Utilizar ratos machos C57BL / 6J, 4-8 semanas de idade. Casa os animais em uma sala com ar condicionado (21-23 ° C, 50% de umidade; 12 horas de luz / 12 h / ciclo escuro, luzes acesas às 08:00) com livre acesso a comida e água.
  2. Tomar uma aliquota de 250 ml da aCSF que foi preparado no passo 1.1, e coloque-o num copo que contém gelo. Ao mesmo tempo, o fornecimento de gás contínua, que é composto por 95% de O2 e 5% de CO 2.
  3. Cirurgia
    1. Anestesiar os animais com 4% de isoflurano em um copoBox para cerca de 3 min. Uma vez que o animal atinge uma profundidade cirúrgico de anestesia (indicado pela falta de uma resposta a pitada tep), coloque-o em uma bandeja rasa que é preenchido com gelo picado e remover a cabeça com uma tesoura.
    2. Expor o crânio, e retire o músculo remanescente. Em seguida, utilizando fórceps, descascar a superfície dorsal do crânio a partir do cérebro. Aparar os lados do crânio utilizando fórceps. Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos com uma solução de etanol a 75%.
    3. Com uma espátula, cortar os bulbos olfativos e ligações nervosas ao longo da superfície ventral do cérebro, e remover o cérebro. Após a decapitação, o cérebro rapidamente transferir para um recipiente cheio com aCSF oxigenado gelado.
  4. Preparação da Medial Tálamo (MT) -ACC Cérebro Slice
    Nota: Prepare fatias que contêm o caminho do MT para ACC 13.
    1. Mão-cortar o bloco cérebro com dois cortes sagital 2,0 mm lateral à linha mediana em cada hemisfériopara exibir a anatomia subcortical. Em seguida, faça dois cortes em ângulo. Adicione o primeiro corte transversal paralelo ao tracto fibra visível no corpo estriado.
    2. Adicione o segundo corte transversal a partir da ligação entre o cerebelo e córtex visual para o ponto médio entre a comissura anterior e trato óptico que são ventral e paralela à via thalamocingulate.
    3. Fixe o bloco cérebro para uma placa angular (~ 120 °) com adesivo de cianoacrilato, e fazer um corte um pouco acima do ponto de viragem da via. Desdobrar a placa, alise-o e cole-o palco das câmaras de um vibratome.
    4. Faça fatias de cérebro tálamo-ACC medial (500 mm de espessura) e, em seguida, mergulhe-os em gelada oxigenados fatias aCSF.Transfer para a câmara de gravação, e mantenha a 32 ° C sob perfusão contínua (12 ml / min) com aCSF oxigenado para 1 h.

3. Preparação de Perfusão Câmara para multieletrodo gravação matriz

  1. Preparaçãode Perfusão Câmara
    1. Coloque uma sonda MEA em um sistema multi-canal e usar dois tubos de polietileno separados para conectar a sonda a uma bomba peristáltica. Utilizar um tubo para guiar o aCSF para a câmara de MEA e o outro tubo para guiar o aCSF para fora da câmara. Finalmente, continuamente perfundir a preparação com água morna (29-30 ° C) aCSF oxigenado (8 mL / min).
  2. Transferir fatia do cérebro para MEA. Mantenha pressionada a fatia do cérebro sobre o MEA com um cotonete molhado. mover cuidadosamente a fatia do cérebro para garantir a ACC é orientada acima dos eletrodos.
  3. Use kits de âncora fatia e mantêm-downs para pressionar a fatia do cérebro. Esta etapa garante uma boa conexão elétrica entre a fatia e eletrodos.

4. Geração de campos elétricos pela DCS

Nota: A definição da orientação do campo eléctrico baseou-se na direcção do eixo axodendritic no ACC. As orientações de dendríticos e Soma compartimentos foramconfirmada usando Golgi coloração 12.

  1. Coloque a AgCl (definida como o ânodo) proximal ao ACC, e colocar o outro eléctrodo (definidos como o cátodo) distai em relação à ACC. Grave a intensidade do campo que é gerada pelas duas orientações de campo (paralelas e perpendiculares às fibras axodendritic ACC) de MEA, e entregar as correntes dos campos eléctricos, utilizando um estimulador.
  2. Fixar a distância dos eléctrodos de AgCl (cerca de 1,5-2 cm), e ajustar a intensidade de corrente do estimulador para fazer o DCS entre 0,5 e 2 mA.

5. induzidas eletricamente respostas corticais Synaptic

Nota: induzir respostas sinápticas no ACC por estimulação eléctrica no MT, em que um gerador de estímulo eléctrico programável produz impulsos de corrente bifásica rectangulares.

  1. Repita Seção 3 acima.
  2. Coloque um eletrodo de tungstênio no MT, e entregar pulsos do estimulador à Thalregião Amic das fatias através de eléctrodos de tungsténio bipolares.
  3. Use várias intensidades de corrente para determinar o limiar que provoca uma resposta ACC. Aqui, utilizar uma intensidade de ± 150 mA e a duração de 200 ms, o que induziu uma resposta máxima de 80% na maioria dos ACC em fatias.
  4. Mova o eletrodo de tungstênio ao longo da via thalamocingulate (de MT para corpo caloso) na fatia MT-ACC para obter os perfis de resposta ideais.
  5. Faça 10-20 varreduras de respostas ACC, e usar o software para automaticamente a média de todos os ACC evocado por estimulação MT. O resultado iss as respostas sinápticas em ACC induzidas a partir de estimulação MT pela MT-ACC via.

6. perda de consciência induzida eletricamente

Nota: perda de consciência foi induzida pela aplicação de 4-aminopiridina (4-AP; 250 uM) e bicuculina (5 uM). estudos de controle de tempo anteriores mostraram que as respostas máximas e estáveis ​​apareceu2-3 horas após a aplicação do fármaco 14.

  1. Repita Seção 5 acima.
  2. Adicionar drogas para a solução de perfusão. Use 4-AP (250 uM) e bicuculina (5 uM). Misturar as drogas uniformemente, e continuar a perfusão de 2-3 horas.
  3. Para facilitar a perda de consciência, a manutenção da bomba de perfusão a uma taxa relativamente rápida de perfusão (8 ml / min), que também pode ajudar a prevenir a acumulação de um gradiente de pH.
  4. Coloque um eletrodo de tungstênio no MT, e entregar a estimulação elétrica (150 mA, 200 ms de duração) para obter perfis de resposta ACC.
  5. Faça 10-20 varreduras e calcular a média das respostas.
  6. Substitua a solução de perfusão com aCSF fresca para lavar as drogas. Repita o passo 6.5.

7. Teste de Efeito da DCS em respostas corticais evocados

  1. Repita as secções 3 e 4. Certifique-se que os campos eléctricos uniformes são geradas pela passagem de correntes entre dois fios de prata AgCl revestidas paralelas que são colocados dentro do Mcâmara de EA. Se não houver problemas, a DCS fica entre 0,5 e 2 mA.
  2. Desligue o DCS, e colocar um eletrodo de tungstênio para estimular o tálamo (± 150 mA, 200 ms de duração). Para obter respostas sinápticas máximas na ACC, fazer 10-20 varreduras e calcular a média das respostas.
  3. Simultaneamente ligar o DCS (2 mV / mm força DCS) e estimulação do tálamo (350 mA, 200 ms de duração). Avaliar as alterações da amplitude da resposta evocada ACC-estimulação talâmica durante DCS.
  4. Desligue o DCS, e adicionar 4-AP (250 uM) e bicuculina (5 uM) para a solução de perfusão. Então espere 2-3 hr. Quando as drogas afetam a fatia do cérebro, a fatia produz respostas apreensão corticais.
  5. Faça 10-20 varreduras de respostas ACC, em seguida, medir a amplitude e duração das respostas apreensão corticais evocados elétricos.
  6. Após o passo 7.5, ligue simultaneamente no DCS (2 mV / mm DCS força) e estimulação do tálamo (150 mA, 200 duratiem ms). Avaliar as alterações na amplitude e duração das respostas apreensão corticais evocados durante a aplicação DCS.
  7. Substitua a solução de perfusão com aCSF fresca para lavar as drogas, e repita os passos 7.2 e 7.3.
  8. Recolher todos os dados de gravação, e agrupar os dados em diferentes condições experimentais. Avaliar a amplitude e a duração das respostas convulsivos corticais sob diferentes condições experimentais.

Análise 8. Dados

  1. Use software (por exemplo, software cremalheira MC) para calcular a média automaticamente as respostas gravadas, e exportar os dados brutos para uma planilha. Analisar a amplitude e a duração dos dados em bruto e gerar dados de cor.
  2. Para detectar eventos apreensão oscilatórios, usar o software para medir o valor da linha de base e desvios padrão (SD). Set 3 SD do nível de ruído como o limiar. Amplitudes dos picos durante um evento de oscilação que ultrapassam esse limite são automaticamente detectarEd.
  3. Realizar a análise estatística utilizando teste t de Student.
  4. Medições Express e one-way análise de variância (ANOVA) resulta no texto como média ± SE, com n indicando o número de fatias estudou 12.

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Resultados

Preparação do Setup Thalamocingulate Fatia e MEA Sistema de Gravação

A fatia MT-ACC de ratinhos é uma preparação fatia especial que permite a exploração das propriedades electrofisiológicas da via thalamocingulate. A Figura 1A mostra a maneira na qual a fatia MT-ACC foi preparado. O cérebro de rato foi rapidamente removido e mantido em aCSF oxigenado fresco (Figura 1A, a, b). Para revelar a an...

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Discussão

No presente estudo, foram testados os efeitos da duração e orientação da DCS na perda de consciência ACC. Para obter dados estáveis ​​em fatias de cérebro de rato, como para manter a integridade da via-MT ACC e para evitar danos que é fundamental, em especial os passos no qual dois cortes angulares ventral e dorsal de um corte do córtex são feitas. Além disso, o tempo necessário para preparar a fatia de cérebro também pode afectar a actividade da fatia do cérebro, o que deve ser o menor tempo possível, para manter o cér...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses conflitantes.

Agradecimentos

Agradecemos o apoio técnico do Núcleo de Eletrofisiologia de Circuitos Neurais da Academia Sinica. Este trabalho foi apoiado pelo Conselho Nacional de Ciência (102-2320-B-001-026-MY3 e 100-2311-B-001-003-MY3) e pelo Programa de Neurociência da Academia Sinica.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Anestésico:
IsofluranoHalocarbon Products Corporation NDC 12164-002-254%
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
aCSF (total:1 L):
D(+)-GlicoseMERCK1.08337.100010 mM
Hidrogenocarbonato de sódioMERCK1.06329.050025 mM
Cloreto de sódioMERCK1.06404.1000124 mM
(+) -L-ascorbato, > = 98%SIGMAA4034-100G0.15 g / 2 c.c
Sulfato de magnésio, anidro, ReagentPlusSIGMAM7506-500G2 mM
Cloreto de cálcio di-hidratadoMERCK1.02382.10002 mM
Di-hidrogenofosfato de sódio monohidratadoMERCK1.06346.10001 mM
Cloreto de potássiomaio & Baker LTD Dagenham InglaterraMS 76164.4 mM
NomeEmpresaNúmero de Catálogo<strong>Comentários
Drogas:
(+)-BicucullineTOCRIS01305 µ M em aCSF
4-AminopiridinaTOCRIS0940250 µ M em aCSF
NomeEmpresaNúmero de CatálogoComentários
Preparação da fatia do cérebro:
VibratomeVibratomeSeries 1000Bloco cortando em 500 µ m fatias grossas
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Sistema MEA:
Sondas de matriz multieletrodo (MEA): 6 x 10 sistemas multicanal MEA planares60MEA500/30iR-Ti-pr MEAS 6x10diâmetro do eletrodo, 30 µ m; espaçamento entre eletrodos, 500 e micro; m; impedância, 50 kΩ a 200 Hz
Sondas de matriz de múltiplos eletrodos (MEA): 8 x 8 MEA Eletrodo piramidal Ayanda Biosystems60MEA200/10iR-Ti-pr MEAS 8x8diâmetro, 40 µ m; altura da ponta, 50 µ m; espaçamento entre eletrodos, 200 e micro; m; impedância, 1.000 kΩ a 200 Hz
Um amplificador de 60 canais foi usado com um filtro passa-banda ajustado entre 0,1 Hz e 3 KHz a 1.200X de amplificação SistemasMulticanalMEA-1060-BC
MC Software Rack a uma taxa de amostragem de 10 KHzMulticanalpara coleta de dados e controle de gravações
de um gerador de pulsosSistemas MulticanalSTG 1002
kits de ancoragem de fatia e hold-downsWarner InstrumentsSHD-26H/10; WI64-0250
Bomba peristáltica-minipuls3GilsomTaxa deperfusão MINIPULS3: 8 ml/min
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Sistema de estimulação:
Estimulador isoladoSistemas A-MModelo 2100intensidade de ± 350 μ A , duração de 200 μ sec
Eletrodo de tungstênioAM Systems575300colocado no tálamo
; Software de Sistemas

Referências

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