Aqui descrevemos um procedimento que permite uma análise detalhada da ativação dependente de fosforilação do fator de transcrição IRF3. Isso é obtido por meio da combinação de um SDS-PAGE de alta resolução e um PAGE nativo acoplado a immunoblots usando vários anticorpos fosfoespecíficos.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Uma resolução alta Método de Monitoramento de Ativação fosforilação dependente de IRF3
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
O fator de transcrição IRF3 é crítico para a primeira linha de defesa contra patógenos, principalmente por meio da β de interferon e da expressão gênica antiviral. Uma análise detalhada da ativação do IRF3 é essencial para entender como os patógenos induzem ou evitam a resposta antiviral inata. Formas ativadas distintas de IRF3 podem ser distinguidas com base em sua fosforilação e status de monômero versus dímero. A discriminação in vivo entre as diferentes espécies ativadas de IRF3 pode ser alcançada através da separação das formas fosforiladas de IRF3 com base em suas mudanças de mobilidade em SDS-PAGE. Além disso, os níveis de monômero e dímero IRF3 podem ser monitorados usando eletroforese não desnaturante. Aqui, detalhamos um procedimento para alcançar a resolução mais alta para obter o máximo de informações sobre o status de ativação do IRF3. Isso é obtido por meio da combinação de um SDS-PAGE de alta resolução e um PAGE nativo acoplado a imunoblots usando vários anticorpos totais e fosfoespecíficos. Esta estratégia experimental constitui uma abordagem acessível e sensível para adquirir todas as informações necessárias para uma análise completa da ativação mediada por fosforilação de IRF3.
Introdução
O factor de transcrição ubíqua e constitutivamente expresso interferão (IFN) factor regulador 3 (IRF3) é crítica para a primeira linha de defesa contra agentes patogénicos, principalmente, através da indução de IFNp, mas também através da indução da quimioquina (CC motivo) ligando 5 (CCL5 ) e várias proteínas anti-virais, incluindo a proteína induzida por IFN com tetratricopeptide repete IFIT1 / 2/3 1-3. IRF3 activação tem sido relatada após infecção com numerosos vírus, ou a exposição ao ácido polyinosinic-polycytidylic (poli I: C) ou lipopolissacárido (LPS) 4. É importante ressaltar que os vírus mais estudados desenvolveram mecanismos pa....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
NOTA: O protocolo é descrito aqui, usando células A549 infectadas com o vírus Sendai (SeV). No entanto, o protocolo de SDS-PAGE e PAGE nativa também funciona com todos os tipos de células humanas e de murino testadas até agora, particularmente células mielóides estimuladas com vários estímulos de activação 9,15,19,24,25 IRF3.
1. A infecção de células A549
- Manter células A549 em cultura numa placa de 15 cm a 37 ° C / 5% de CO 2 em 20 ml F12K médio / Ham contendo 10% de soro inactivado por calor fetal bovino (HI-FBS) e 1% de L-glutamina (F12K completo / meio Ham).
NOTA: Todas as soluções utilizadas pa....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
A Figura 2 mostra uma imagem de imunotransferência típica de IRF3 detectada com anticorpos e anticorpos totais IRF3 IRF3 fosfoespec�ico contra-Ser396 e Ser398 após resolução de WCE por alta-resolução de SDS-PAGE. Em células não estimuladas A549, IRF3 é detectado como duas bandas a 50 e 53 kDa no SDS-PAGE correspondente à não-fosforilada (Forma I) e o hipofosforilado (Forma II) espécies de IRF3. A exposição de células A549 para SEV para 3 - 9 hr resultados em um desloca.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
O protocolo aqui descrito consiste de uma combinação de alta-resolução de SDS-PAGE e PAGE nativa-acoplado com a utilização de vários anticorpos fosfoespec�ico para distinguir o monomérica / dimérica e phosphoforms I-IV da IRF3. Detecção adequado dessas espécies IRF3 é essencial para caracterizar completamente a ativação IRF3 em um ambiente específico. Por exemplo, estimulação por LPS de macrófagos activados, conduz à formação de dimérico, Ser396 / 398 IRF3 fosforilado que exibe uma hipofosforilado (Forma II), mas não .......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Os autores agradecem aos membros anteriores e atuais do laboratório pelo desenvolvimento dos protocolos. O trabalho foi apoiado por financiamento dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR) [concessão # MOP-130527] e do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá [NSERC-355306-2012]. NG recebeu uma cadeira de pesquisa de nível II do Canadá. AR é bolsista do programa de treinamento da Rede de Pesquisa em Saúde Respiratória do Fonds de la recherche du Québec-Santé (FRQS).
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| F12/Ham | Life Technologies | 11765-054 | Quente em um 37 ° C antes de usar. |
| Soro bovino fetal | Life Technologies | 12483-020 | |
| L-glutamina | Life Technologies | 25030-081 | |
| D-PBS | Life Technologies | 14190-144 | Para cultura de células. |
| Tripsina / EDTA 0,25% | Life Technologies | 25200-072 | |
| Vírus Sendai Cantell Cepa | Charles River Laboratories | 600503 | |
| Hepes | Bioshop | HEP001 | |
| Cloreto de sódio (NaCl) | Bioshop | SOD001.5 | |
| EDTA | Bioshop | EDT001 | |
| Glicerol | Bioshop | GLY001.1 | Corte a extremidade da ponta e pipete lentamente, pois é muito grossa. |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I7771 | Marca registrada correspondente ao detergente Octylphenoxy poli(etilenooxi)etanol (Nonidet P-40) |
| Leupeptin | Bioshop | LEU001 | |
| Aprotinin | Bioshop | APR600.25 | |
| Fluoreto de sódio | Sigma-Aldrich | 201154 | |
| Ortovanadato de sódio | MP Biomedicals | 159664 | Ativação do ortovanadato de sódio 0,2 M : 1) Ajuste o pH para 10,0 usando 1 N NaOH ou 1 N HCl. O pH inicial da solução de ortotovanadato de sódio pode variar com muitos produtos químicos. 2) A solução é amarela em pH 10,0. 3) Ferva até ficar incolor. 4) Resfrie para RT. 5) Reajuste o pH para 10,0 e recoloque as etapas 3-4 até que a solução permaneça incolor e se estabilize em 10,0. Armazenar as alíquotas de ortovanadato de sódio activado a -20 °C. |
| sal dissódico de fosfato p-nitrofenil hexahidratado | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Beta-Glicerofosfato | Sigma-Aldrich | G6376 | |
| Reagente de Ensaio de Proteína Bio-Rad | Bio-Rad | 500-0006 | citotóxico |
| Acrilamida/Bis-Acrilamida (37.5 : 1) 40% | Bioshop | ACR005 | citotóxico |
| Tris-Base | Bioshop | DEO701 | |
| Ácido clorídrico (HCl) | LabChem | LC15320-4 | Trabalhe sob a coifa. Tóxico e irritante. |
| Dodecil sulfato de sódio (SDS) | Bioshop | SDS001.1 | irritante. |
| Persulfato de amônio | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Invitrogen | 15524-010 | Tóxico e irritante. |
| Azul de bromofenol | Fisher Scientific | B392-5 | |
| Beta-mercaptoetanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Trabalhe sob a coifa. Tóxico para o sistema nervoso, membranas mucosas. Pode ser tóxico para o trato respiratório superior, olhos, sistema nervoso central. |
| Glycine | Bioshop | GLN001.5 | |
| Desoxicolato de sódio | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Hidróxido de sódio (NaOH) | Bioshop | SHY700 | irritante. |
| Membrana de nitrocelulose (0,45 mm) | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Ácido acético glacial | Bioshop | ACE222.4 | Trabalhe sob a hotte. Tóxico, irritante e inflamável. |
| Ponceau vermelho | Sigma-Aldrich | P3504 | |
| Cloreto de potássio (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | Para PBS composição para immunoblot. |
| Na2HPO4 | Bioshop | SPD307.5 | Para composição de PBS para immunoblot. |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | Para PBS composição para immunoblot. |
| Albumina de soro bovino | Sigma-Aldrich | A7906 | Para composição de PBS-T-BSA para immunoblot. |
| Leite em pó desnatado | Cravo | ||
| Poli sorbato 20 (Tween) | MP Biomedicals | 103168 | Corte a extremidade da ponta e pipete lentamente, pois é muito grossa. |
| Anti-IRF-3-P-Ser386 | IBL-America | 18783 | Armazene aliquotado a -20 oC. Evite congelar/descongelar. |
| Anti-IRF-3-P-Ser396 | Home made19 | Store aliquotado a -80 oC. Evite congelar/descongelar. | |
| Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G) | Tecnologia de Sinalização Celular | 4947s | Armazenar a -20 oC. |
| Anti-IRF-3-P-Ser398 | Home made15 | Store aliquotado a -80 oC. Evite congelar/descongelar. | |
| Motivo Actif anti-IRF-3 de comprimento total | 39033 | Armazene aliquotado a -80 oC. Evite congelar/descongelar. | |
| Anti-IRF3-NES | IBL-America | 18781 | Loja aliquotada em -20 oC. |
| Reagente de Quimioluminescência Western Lightning Plus | Perkin-Elmer Life Sciences | NEL104001EA | |
| LAS4000mini aparelho de câmera CCD | GE healthcare | ||
| SDS-PAGE Padrões de Peso Molecular, Ampla Gama | Bio-Rad | 161-0317 | Loja aliquotada a -20 oC. |
Referências
- Juang, Y. T., et al. Primary activation of interferon A and interferon B gene transcription by interferon regulatory factory-3. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (17), 9837-9842 (1998).
- Lin, R., Hiscott, J.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
