Um sistema de injeção de pressão para a investigação da neurofarmacologia de Processamento de Informação em Despertai Behaving Macaque Cortex

Resumo

Aqui, mostramos a injeção de pressão de substâncias neurofarmacológicas durante a gravação de uma única célula em um macaco acordado e comportado. Este procedimento permite a manipulação farmacológica nas proximidades diretas de um local de registro cortical.

Resumo

A modulação de cima para baixo do processamento de informações corticais feed-forward é funcionalmente importante para muitos processos cognitivos, incluindo a modulação do processamento de informações sensoriais pela atenção. No entanto, pouco se sabe sobre quais sistemas de neurotransmissores estão envolvidos em tais modulações. Uma maneira prática de abordar essa questão é combinar o registro de célula única com a manipulação neurofarmacológica local e temporária em um modelo animal adequado. Aqui demonstramos uma técnica que combina registros agudos de célula única com a injeção de agentes neurofarmacológicos nas proximidades diretas do eletrodo de registro. O vídeo mostra a preparação do sistema de injeção/gravação de pressão, incluindo a preparação da substância a ser injetada. Mostramos um macaco rhesus realizando uma tarefa de atenção visual e o procedimento de gravação de unidade única com manipulações farmacológicas em bloco.

Introdução

Nas áreas corticais e subcorticais, a atividade neuronal é afetada por vários neuromoduladores, por exemplo, acetilcolina¹. Esses efeitos modulatórios nas respostas neuronais foram relatados em estudos in vitro ², bem como em registros eletrofisiológicos de animais anestesiados³ e manipulações farmacológicas sistêmicas em humanos⁴. No entanto, o papel exato de diferentes neuromoduladores e o envolvimento de vários subtipos de receptores são amplamente desconhecidos. Para medir os efeitos de neuromoduladores específicos na atividade de neurônios individuais, é desejável induzir uma mudança temporária do neuromodulador o mais próximo possível do eletrodo de registro. Além disso, é importante que essas manipulações sejam feitas em animais acordados, pois as funções cognitivas só estão presentes na ausência de anestesia. Além disso, a anestesia interage com os sistemas colinérgico e GABAérgico^5,6 e pode levar a alterações na atividade neural³.

Nas últimas décadas, dois métodos principais de administração local de medicamentos foram desenvolvidos e refinados: iontoforese e injeção de pressão. Em ambos os métodos, os medicamentos são administrados por meio de micropipetas feitas de vidro ou aço. Com a iontoforese, uma corrente elétrica regula a liberação da droga⁷. Além disso, há uma contribuição significativa da eletro-osmose para a quantidade total de moléculas ejetadas⁸, correlacionando com o diâmetro da ponta⁹ da micropipeta e com a concentração⁸ da substância utilizada. A iontoforese é uma ferramenta poderosa para manipular com rapidez e precisão pequenos volumes de tecido nervoso. Para injeções iontoforéticas, geralmente são usadas micropipetas de vários cilindros¹⁰, com uma atuando como dispositivo de registro enquanto as outras posições servem como pipetas de entrega. Uma limitação desse método é que apenas moléculas carregadas podem ser usadas, limitando severamente a seleção de medicamentos.

A injeção de pressão usa compressão de ar ou pressão mecânica para ejetar uma substância de uma micropipeta. Usando este método, qualquer substância solúvel, carregada ou não, pode ser usada, incluindo moléculas grandes. O método de injeção de pressão foi descrito pela primeira vez por Reyniers em 1933 e refinado na década de 1950 (ver Lalley¹¹ para uma revisão). Na década de 1980, o método foi refinado para permitir a entrega de quantidades na faixa de nanolitros (principalmente lidocaína¹²) para uma área cerebral definida¹³, ao mesmo tempo em que realizava o registro de uma única célula. O volume ejetado foi geralmente monitorado observando-se o movimento de um marcador, como o menisco na parte superior da pipeta¹³. A injeção de pressão foi utilizada pela primeira vez na década de 1990 em animais acordados, tanto^{extracelular14} quanto intracelular15,16. Com base na experiência cumulativa adquirida nesses estudos, agora é possível registrar de forma confiável diferentes estruturas cerebrais em combinação com a manipulação farmacológica (ver¹⁷ para uma comparação de sistemas de injeção de pressão recentes).

Uma questão em aberto duradoura para ambos os métodos de administração de medicamentos é a dificuldade em determinar o volume preciso injetado. Este é um desafio ainda maior para experimentos com macacos rhesus acordados e comportados, onde o animal realiza a tarefa experimental em uma sala separada. Isso pode ser aliviado pelo uso de um sistema controlado por software, em vez de depender de um marcador visual para monitorar continuamente uma injeção.

O sistema descrito aqui é uma extensão de um sistema de registro eletrofisiológico bem estabelecido (Mini Matrix System) e combina uma pipeta de injeção com vários eletrodos de registro orientados em paralelo a distâncias definidas em um arranjo personalizável. A manipulação farmacológica do tecido próximo ao eletrodo de registro é possível usando apenas uma pequena quantidade de substância, garantindo uma recuperação rápida e permitindo múltiplos blocos de injeção e controle/recuperação dentro da janela de tempo limitada oferecida pela tarefa comportamental do animal.

Protocolo

cuidados com os animais e todos os procedimentos experimentais foram conduzidos de acordo com cuidados com os animais leis alemãs do BCE e aprovados pelo governo distrital de Braunschweig, Lower Saxony, Alemanha.

Nota: Como a experiência é realizada in vivo, é crucial para manter os mais elevados padrões de higiene possíveis. Sempre que possível, trabalhar em condições estéreis.

1. Preparar o sistema de injeção / Gravação

1. Esteriliza-se o tubo que liga a micropipeta com a seringa. Use o menor comprimento do tubo possível no set-up experimental entre a bomba de injeção e sistema de gravação eletrofisiológico.
2. Limpar os tubos de guia do sistema de gravação usando fios de limpeza. Mergulhá-los em óleo de silicone estéril e alimentá-los através dos tubos de guia individuais várias vezes.
3. Inserir a micropipeta de vidro de quartzo em um tubo de guia do sistema de gravação. Veja a Figura 1A.
4. Depois de corrigir a micropipeta emo sistema de gravação, conecte o tubo estéril para o pino de metal da micropipeta. Cuidar; embora a micropipeta é fixo no sistema, ele pode facilmente quebrar quando colocar o tubo. Use duas pinças estéreis para aplicar pressão igual no pino e tubo.
5. Use cola super líquidos para selar a junção entre o tubo e micropipeta. Espere pelo menos 3 horas para a cola para endurecer antes de encher o micropipeta com líquido.
6. Inserir microeléctrodos (por exemplo, vidro de quartzo isolados de tungsténio platina) nas outras posições do sistema de gravação, antes ou após a inserção micropipeta.

2. Preparação da Substância

1. Esterilizar tubos de 1,5 ml de microcentrífuga para posterior armazenamento de soluções de injecção utilizando uma autoclave ou outro procedimento fiável.
2. Pesa-se o cloridrato de escopolamina substância correspondente para preparar 5 ml de uma solução 0,1 molar. Dissolve-se em solução salina estéril (NaCl a 0,9%).
3. Sob condições de estéril ind exaustor de fumos, filtrar a solução através de um filtro de seringa com suficientemente grande diâmetro de poro, por exemplo, de 0,2 um.
4. Sob o exaustor de fumos, alíquota da solução em quantidades suficientes para uma única experiência, por exemplo, por escopolamina, 500 ul em tubo de microcentrifugação esterilizado de 1,5 mL. Use tubos escuros para proteger a substância da luz; alternativamente, enrole tubos em papel de alumínio. Para escopolamina, armazenar a solução durante até 14 dias a 4 ° C.

3. Preparação diário do sistema de injecção / Gravação

Nota: Quando montado no sistema de gravação, os eléctrodos e micropipeta são armazenados em uma solução de enzima (Tergazyme, solução a 1% com água desionizada) entre as gravações. Os seguintes passos devem ser realizados antes de cada gravação.

1. Recolher um tubo de a substância a ser injectada. Permitir que ele para chegar a RT se refrigerado.
2. Retirar o sistema de injecção / gravação a partir da solução de enzima e enxaguar eléctrodose micropipeta com água desionizada para limpar completamente da solução de enzima.
3. Remova a tampa frontal do sistema de registo, a fim de verificar visualmente a vedação entre micropipeta e tubo.
4. Aplicar o óleo de silicone estéril para a abertura do tubo guia (ver Figura 1A) e pontas dos eléctrodos e micropipeta, a fim de lubrificar o sistema para um movimento suave.
5. Confira dicas de eléctrodos e micropipeta usando um microscópio para garantir que eles estão intactos. Alinhar os eléctrodos e a micropipeta sob o microscópio de modo que elas se estendem para fora dos tubos de guia com o mesmo comprimento. Levá-los para os tubos de guia, parando assim que eles não são mais visíveis. Isto é definido como a posição zero do eletrodo. Definir a profundidade dos eletrodos e micropipeta a 0 no software.
6. Encher uma seringa estéril, com solução salina estéril e inserir a agulha no interior do tubo, tendo o cuidado de não perfurar a parede do tubo. Conduzir a micropipeta para fora do tubo guia para visucontrole al do fluxo de substâncias.
7. Lave, pelo menos, 2 ml de solução salina estéril através do tubo da micropipeta e para assegurar que não permanece ar na seringa ou no tubo. Não aplicar demasiada pressão ao êmbolo da seringa. Assegurar a junção entre o tubo e é selado micropipeta. Se a fuga é visível, re-cola a junção (veja o passo 1.5) e adiar a gravação.
8. Encha uma nova seringa estéril, com a solução a ser injectada e trocá-lo com o tambor da seringa salina, isto é, manter a agulha da seringa cheia com solução salina no tubo. Certifique-se de que nenhum ar é transferido para o sistema. Este é melhor conseguido através do enchimento do centro da agulha com solução salina após a remoção do tambor cheio de solução salina.
9. Lavar o sistema com 250 ul da solução a ser injectada, a fim de remover completamente a solução salina do tubo.
10. Utilizando o software de controlo do motor, retrair e eléctrodos de micropipeta no guidetubesto uma profundidade de pelo menos -500 uM.
11. Baixa o anel de tubo de guia (Figura 1A) para a parte inferior dos tubos de guia para manter a sua posição relativa fixa.
12. Limpe a base do sistema com etanol, em especial quando se vai tocar câmara de gravação do macaco.
13. Feche o sistema de gravação, substituindo a tampa frontal e apertar os parafusos.

4. Validação do Sistema de Injeção

Nota: Embora a empresa calibra o sistema, é recomendado para validar os volumes ejectadas com os materiais utilizados no conjunto experimental (tubos, seringas, etc.).

1. Prepara-se o sistema tal como descrito na etapa 3, mantendo-se os eléctrodos e micropipeta estendidos para fora dos tubos de guia. Uma profundidade de pelo menos 7.000 uM é recomendado para evitar a perda de volume de medição devido a aderência ao longo da superfície exterior da micropipeta e eléctrodos.
2. Colocar o sistema de gravação na posição em que vai ser utilizado no durante a experiência e colocar o Syringe na bomba de microinjecção. Fixar a seringa no local usando a faixa de borracha e aderência ajustável (ver Figura 1A). Deslize a parte móvel da bomba até que ela esteja firmemente no lugar por trás do êmbolo da seringa.
3. Usando a unidade de motor controlado por software, ejectar um volume suficientemente grande para ser medido com precisão, por exemplo., 1000 NL. É preferível utilizar um único passo para ejectar o volume total a fim de evitar efeitos de acção capilar ao longo da superfície da micropipeta. Velocidades muito baixas (1 nl / s) também pode conduzir a este efeito durante o processo de validação.
4. Recolhe-se o volume total, em um recipiente colocado sob a micropipeta, ou recolha cuidadosamente gota a ejectado directamente a partir da ponta da micropipeta. Estimar o volume ejetado usando uma pipeta ou por pesagem, com uma balança de precisão.
5. Repita o procedimento várias vezes para confirmar as medições.

5. Recordings aguda

1. Definir a posição xydo sistema de gravação. Isto define o ponto no qual os tubos de guia atingir a dura-máter no interior da câmara de gravação cronicamente implantado. Certifique-se os tubos de guia estão retraídos completamente (tubo guia posição z 0).
2. Traga o sistema de gravação para a posição e coloque a seringa na bomba de microinjecção. Fixar a seringa no local usando a faixa de borracha e aderência ajustável (ver Figura 1A). Deslize a parte móvel da bomba até que ela esteja firmemente no lugar por trás do êmbolo da seringa. Se uma gota de substância é visível na ponta dos tubos de guia, remova-o cuidadosamente com um cotonete estéril.
3. Prepare o animal para a gravação de acordo com o procedimento do laboratório (ver ^18, por exemplo, orientações).
4. De forma segura montar o sistema de gravação na câmara de gravação do macaco.
5. Lentamente, abaixe manualmente os tubos de guia para a câmara de gravação até que a dura é atingido, em seguida, conduzir os eletrodos utilizando o co motorasoftware ntrol.
6. Como não é possível medir a impedância da micropipeta, primeiro carro com eletrodos e verificar suas impedâncias regularmente em diferentes profundidades. Após uma penetração da dura-máter é realizada com sucesso, sem danificar os eletrodos, o avanço da micropipeta.
7. Conduzir os eléctrodos e a micropipeta com a profundidade eléctrodo alvo em que a área do cérebro de interesse deverá ser encontrado. Lentamente avanço do eléctrodo até que esteja perto o suficiente para registar a actividade de uma única unidade, tal como evidenciado por uma boa razão sinal-para-ruído no sinal gravado. Importante, posicionar o eléctrodo de registo e a micropipeta com a mesma profundidade para assegurar a distância mínima entre o eléctrodo e micropipeta.
   1. Se possível, mantenha os eletrodos e micropipeta a essa profundidade para toda a gravação. No entanto, se a única maneira de manter uma qualidade de sinal da célula registada é mover os eléctrodos, em seguida, conduzir os eléctrodos e a micropipetasimultaneamente para manter a distância entre eles.

6. atenção espacial Task

1. Numa série de ensaios, apresentam dois padrões de pontos que se deslocam sobre a tela, uma posicionada no interior do campo receptivo do neurónio gravado e o outro lado de fora da mesma, em conjunto com um ponto de fixação apresentado centralmente que o animal tem que foveate ao longo de cada ensaio ^{19, 20.}
   Nota: O macaco é treinado para responder a uma mudança de direcção no padrão de pontos com pistas (o evento de destino), ignorando qualquer mudança de direcção do outro padrão de pontos, e é recompensado com uma gota de líquido para cada conclusão bem sucedida de um processo ^{19, 20.} Como uma condição de controlo sensorial, o macaco tem que se apresentar uma mudança de luminância do ponto de fixação, ignorando ambos os padrões de pontos em movimento (ver Figura 2 para uma descrição mais detalhada da tarefa).

7. manipulação farmacológica durante a gravação

Nota: Enquanto o macaco está realizando a tarefa, injetar a substância de um modo em blocos. Três blocos consecutivos são definidos: controlo, que actua como uma linha de base; injecção, durante o qual a substância é ejectado; e a recuperação, durante os quais as células alvo por injecção o retorno à linha de base.

1. Durante um bloco de injecção, injectar uma quantidade predefinida de substância, a intervalos regulares, por exemplo., 2 nl a cada minuto a uma taxa de 2 nl / s. Para este exemplo, usar cloridrato de escopolamina. O processo de injeção é controlado através de software que fornece várias opções. Por exemplo, usar a função etapa para definir o volume de injecção, e pressione o botão de injecção cada minuto de acordo com o relógio do software de gravação.
   Nota: A duração exacta do bloco de injecção é experimentar substância e dependente, por exemplo, para uso escopolamina 2 injecções de nl a cada minuto durante 10 min (20 nl no total).. É preferível não fazer avançar os eletrodos e duri micropipetang do bloco de injeção.
2. Registar o tempo e o ensaio durante o qual a substância é injectada, a profundidade dos eléctrodos e micropipeta, bem como a quantidade de substância ejectado.
3. Siga o bloco de injecção com um bloco de recuperação, em que nenhuma substância é injetada. A duração do bloco de recuperação é substância específica e precisa ser definido no pré-testes. Monitorizar e manter a qualidade de gravação das unidades individuais seleccionados até ao fim do bloco de recuperação.
4. Repita os três blocos por tanto tempo quanto a qualidade de gravação e motivação do macaco permitir.

8. Procedimentos Pós Gravação

1. Após a gravação de dados, retraia eletrodos e micropipeta para os tubos de guia e, em seguida, retirar manualmente os tubos de guia. Retirar o sistema de gravação a partir da câmara de gravação do macaco. Libertar a seringa da bomba de injecção e transferir o sistema para a área de preparação para a limpeza.
2. Lidar com o animal(incluindo a limpeza da câmara de gravação ¹⁸⁾ de acordo com os procedimentos padrão do laboratório e retorná-lo para a instalação de alojamento.
3. Lavar o exterior dos tubos de guia com peróxido de hidrogénio (3%) e depois com água desionizada. eléctrodos de accionamento e micropipeta fora dos tubos de guia, lavar com água oxigenada e água, em seguida deionizada.
4. Trocar o cilindro da seringa com um tambor de uma seringa cheia com solução salina estéril, mantendo a agulha no tubo. Lavar o tubo e a micropipeta com 1-2 ml de solução salina. Após a lavagem, retire o cano e preenchê-lo com o ar. Insira novamente o tambor para dentro da agulha e secar o tubo e a micropipeta a partir do interior, pressionando suavemente ar através.
5. Armazenar os tubos de guia, os eléctrodos alongados e micropipeta imersos na solução de enzima a fim de evitar secagem, bem como para assegurar que a repartição de material orgânico.

Resultados

A Figura 2 representa a tarefa espacial atenção o macaco realizada enquanto o processo de injecção foi realizada. O macaco foi treinado para atender tanto o estímulo localizado dentro do campo receptivo do neurônio gravado (assistir-in), o estímulo localizado fora do campo receptivo (assistir-out) ou no ponto de fixação (assistir-fix). Estas condições permitem uma comparação da actividade neuronal em diferentes estados de atenção.

A Figura 3 mostra um histograma tempo peri-estímulo de um neurónio amostra em uma experiência usando a escopolamina, um antagonista colinérgico muscarínico. A trama mostra a supressão da resposta durante a injeção de escopolamina versus sem injeção, quando um padrão movendo-se em direção preferencial da célula é apresentado dentro de campo receptivo do neurônio e é atendido pelo animal. Os primeiros dois picos representam o neurónio9; s resposta à dentro e deslocamento da sugestão espacial, que aparece dentro de seu campo receptivo. Isto é seguido pela resposta ao padrão de movimento que aparece na tela de 500 ms após o início cue. O cinza área sombreada representa o período de análise utilizado para calcular a taxa média de queima para cada julgamento. A área verde destaca a influência supressiva da injeção de escopolamina na taxa de disparo da célula. A região verde escuro mostra a supressão dentro do período de análise.

A Figura 4A mostra o efeito da escopolamina sobre a taxa de disparo do neurónio média da amostra em cada uma das três condições de atenção. taxa do neurónio de disparo para as duas condições atenção espacial (atenção, dentro ou fora do campo receptivo do neurónio de gravação), bem como para a condição sensorial (atenção no ponto de fixação) caiu logo após a primeira injecção do bloco de injecção (sombreado cinzento estamosa) e o bloco durante a recuperação aumentada, após um atraso ao mesmo nível que antes da injecção.

A Figura 4B mostra um controlo de gravação a partir de um segundo neurónio amostra em que soro fisiológico (0,9% NaCl) foi injectada, utilizando o mesmo protocolo como para a injecção de escopolamina. Durante a injecção de bloquear não foi observada nenhuma alteração na taxa de disparo do neurónio de comparação com o bloco de controlo.

Figura 1. Set-up usado para manipulação farmacológica durante a gravação. (A) mostra a bomba de microinjecção e o sistema de gravação eletrofisiológico equipado com eletrodos e micropipeta. A diferença guidetube, em que o óleo de silicone é inserida para lubrificar os eléctrodos e micropipeta, é mostrada ampliada. (B) Exibe um exemplo micropipeta (acima)e eléctrodo de registo (abaixo). Para comparação do tamanho, um centavo de euro (diâmetro: 16 mm). É colocado debaixo Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Projeto de tarefas para guiar a atenção espacial. Monkeys foram treinados para detectar uma mudança da direcção de movimento no padrão de pontos cued. A sugestão foi seja colocado dentro do campo receptivo do neurónio (assistir-in), como mostrado na figura, ou fora dela (assistir-out). Como controle sensorial, o macaco foi treinado para detectar uma mudança de luminância do ponto de fixação (assistir-fix). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3. Influência da escopolamina antagonista na taxa de disparo. O histograma tempo peri-estímulo para um neurônio amostra é mostrado para o attend-in condição (atenção dentro do campo receptivo do neurônio gravado) durante o bloco de injecção e durante o bloco de controle. O eixo dos x representa o tempo em milissegundos após o início do taco e o eixo y mostra a taxa de disparo em espigas / seg. A área cinzenta representa o período de análise (300-800 ms após o início do estímulo) usado para calcular a taxa de disparo média-julgamento. A área sombreada verde mostra a supressão na taxa de disparo nas duas condições. A cor verde escuro realça a supressão dentro do período de análise. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4. Efeito da escopolamina e solução salina na taxa de disparo. Injecção de escopolamina (A) antagonista. A taxa de disparo média-ensaio da célula de amostra a partir da Figura 3 ao longo da experiência é mostrado para o estímulo preferida para todas as três condições de atenção. O eixo x representa a hora de início de teste em minutos e o eixo dos Y mostra a taxa de disparo da unidade de espigas por segundo. símbolos ( assistir-in, assistir-fix, assistir-out) representam taxa de disparo do neurônio dentro do período de análise em cada prova realizada com sucesso, e as linhas horizontais (linha sólida: assistir-in, linha pontilhada: assistir-fix, linha tracejada: assistir-out) mostram taxa média de disparo para o três bl experimental diferenteocks (controle, injeção, de recuperação). A cinza área sombreada mostra o bloco de injecção, começando com a primeira injecção e que termina 1 min após a última injecção. Durante a injecção bloco 2 nL de 0,1 molar escopolamina foram injectados cada minuto com uma velocidade de injecção de 2 nl / s. (B) injeção de solução salina. A taxa de disparo de uma célula de amostra ao longo da experiência de controlo é mostrado para o estímulo preferida para todas as três condições de atenção. Cinza área sombreada visualiza o bloco de injeção de solução salina. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Aqui temos ilustrado em detalhes como realizar injeções fiáveis ​​e precisos e gravações de uma única célula de alta qualidade com um sistema de injeção de pressão "off-the-shelf". Embora este método de administração de fármaco tenha sido previamente usado em comportando macacos (revisto em ^17), o sistema aqui apresentado tem vantagens, analisados ​​a seguir.

Como ilustrado na Figura 4A, o sistema aqui descrito pode fornecer uma medição única estável de actividade neuronal com e sem injecções farmacológicos na vizinhança directa do local da gravação. Como mostrado na Figura 4B, a injecção de uma substância de controlo, soro fisiológico, não conduzir a uma mudança na taxa de disparo. Este controlo demonstra que o próprio processo de injecção não tem nenhuma influência mensurável sobre as propriedades de disparo dos neurónios gravados.

A configuração espacial do neurónio, eléctrodo de registo, e micropipeta é de fundamental importância nestas experiências. Embora uma medida precisa de suas posições relativas no tecido durante a gravação não for possível, pode-se considerar e controle para possíveis fontes de variação. Em primeiro lugar, durante a injecção do volume existe um risco de que o neurónio de interesse pode ser deslocada para fora do eléctrodo de registo, que afectam a estabilidade de sinais gravados. Por essa razão, é prudente para comparar a taxa de disparo antes e depois do bloco de injecção para verificar a estabilidade de sinal. Em segundo lugar, a configuração do tubo de guia do sistema de registo define a distância entre os eléctrodos e micropipeta (por exemplo., 305 uM no sistema de três-canal concêntrico utilizado nesta experiência). À medida que o sistema proporciona um controlo preciso para a posição de profundidade de eléctrodos e micropipeta no tecido, a distância entre eles pode ser minimizado através da calibração cuidadosamente profundidade relativa antes de gravar (passo 3.5), e mantendo-os a uma profundidade comum durante gravações.

ent "> limitações potenciais
Além de in-house de controle de qualidade pelo fabricante, o sistema precisa ser validado em condições de laboratório, como diferentes marcas de tubos, seringas etc. pode ser usado e pode levar a diferenças nos volumes ejetados. Embora o sistema possa ser utilizada para injectar volumes muito pequenos como na experiência mostrada aqui, estes são a seguir o volume mínimo que pode ser validado devido aos limites de medição práticos num ambiente normal de laboratório. No entanto, os volumes de injecção de maior dimensão pode ser usada para inferir a relação entre o volume definido pelo software e o volume ejectado pelo hardware. Se são utilizados tubos transparentes, um controlo visual adicional do processo de injecção é possível através da medição do deslocamento de um marcador visual.

Inserindo a micropipeta para o sistema é mais exigente do que a inserção do eléctrodo, como o diâmetro da micropipeta é ligeiramente maior e o material é mais frágil. Além,juntar o tubo para o pino da micropipeta é um desafio uma vez que implica um elevado risco de quebrar a parte superior da micropipeta. No entanto, o tempo de vida de uma micropipeta carregado com êxito é de vários meses, mesmo com o uso diário.

Na prática, significa que ainda não encontrou um bloqueio no sistema de injecção durante a limpeza pós-gravação do sistema. No entanto, nenhuma verificação de "on-line" é possível, e há um risco de que um bloqueio físico (tal como o tecido na ponta da micropipeta) pode evitar a injecção de substâncias. Portanto, pode ser aconselhável para analisar os dados de forma conservadora, como incluindo apenas as células em uma análise mais aprofundada que apresentam alterações significativas em disparar as taxas entre controle e injeção de blocos do experimento.

Apesar de seu pequeno diâmetro, microeletrodos e pipetas irá deslocar o tecido cerebral e pode causar algum dano tecidual local. Isto pode ser minimizado por posicionamento manualmente a ponta do thtubos e guia logo acima da dura-máter. Os eletrodos em seguida, penetrar na dura-máter e sua intactness é inferida medindo suas impedâncias online. Em seguida, a micropipeta é inserido. Ao usar esta abordagem, a remoção regular do tecido da dura-máter acima é recomendada para reduzir ainda mais o risco de eléctrodo ou pipeta ruptura.

Comparação dos métodos alternativos
O sistema utilizado aqui mostra vantagens claras em comparação com outros sistemas de injeção de pressão. Uma grande vantagem é o diâmetro da micropipeta (aproximadamente 100 uM), que é metade do tamanho de outras sondas disponíveis ¹⁷ e, portanto, minimiza os danos de tecido neural. Em contraste com modelos anteriores, o atual sistema emprega espacialmente separados eletrodo de registro e micropipeta. Embora outros sistemas fornecem uma distância menor entre o eletrodo e pipeta, o sistema descrito aqui permite mudanças de profundidade independentes de eletrodos e pipeta, portanto, permitting distâncias relativas variável dentro de uma sessão de gravação. Mais importante, nenhum compromisso quanto à qualidade de gravação tem de ser feita, como o sistema de injecção é uma extensão de um dispositivo de gravação estabelecida. Embora apenas uma micropipeta e, portanto, uma substância é utilizada neste protocolo, é possível injetar várias substâncias no prazo de um procedimento experimental. Para alcançar este objectivo, vários micropipetas pode ser enfiado para dentro de tubos de guia separados e ligados a seringas montados em bombas de injecção individuais. Finalmente, o sistema de controlo é fácil, uma vez que apenas um programa de computador é necessária para fazer avançar os eléctrodos e micropipeta, e para executar a injecção de pressão durante a experiência.

Comparando injecção pressão para iontoforese, há vantagens e desvantagens relativas. Por exemplo, a injecção de pressão requer um maior volume a ser introduzidas no tecido do que a iontoforese, aumentando assim o risco de deslocamento neuronal. O proto atualcol usado volumes na faixa NL, e raramente experimentaram mudanças perceptíveis na qualidade do sinal de uma célula gravado. O sistema também permite que um maior volume a ser injectado, a qual é potencialmente útil para manipulações comportamentais mas poderia ter impacto estabilidade de gravação neuronal. A clara vantagem de injeção de pressão sobre iontoforese é a maior variedade de substâncias utilizáveis ​​como não há exigência de utilização de substâncias carregadas. No entanto, os valores de pH devem ser verificados e comparados entre substâncias experimentais e de controle (por exemplo., Solução salina).

A pergunta pode surgir por que usar o método de longa data de injeção de pressão em vez de técnicas mais recentes, como optogenética para manipular a atividade neural. Embora bem estabelecido em roedores, Optogenetics ainda não está estabelecida de forma fiável em macacos rhesus. Em particular, ele ainda não permite a manipulação local de células selectivos para um tipo de neurotransmissor particular. A mais longo prazo, vemosgrande potencial para a combinação das vantagens de manipulações farmacológicas com as vantagens de manipulações optogentic na elucidação da base neural das funções cognitivas.

Aqui mostramos como injecção de pressão pode ser usada para manipular farmacologicamente uma área restrita localmente no cérebro de acordado, comportando-se macacos rhesus. Esperamos que este método inspira outros cientistas para investigar as contribuições neuromoduladores para a dinâmica da atividade neuronal.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
(-)-Cloridrato de escopolamina	Sigma-Aldrich	55-16-3	Mr 339,81 g/mol
NaCl 0,9%	B. Braun Melsungen AG	3079870	5ml
Terg-a-zyme	Sigma-Aldrich	Z273287	enzima determinante
Peróxido de hidrogênio	Roth		Usado em solução a 3% com água deionizada
Etanol	Chemie-Vertieb Hannover	104642	70%
Água
Injekt 40 Duo	B. Braun Melsungen AG	9166432V	Seringa e agulha
Tubos de microcentrífuga Eppendorf Safe-Lock, âmbar	Eppendorf	0030 120.191	1,5ml
Micropipeta Quarzglass	Eletrodo de gravação Thomas Recording
		Eletrodo de	fibra de quartzo/platina-tungstênio; valor de impedância 1-2 MΩ   e 0,3-0,5 M & Omega;
PharmedBPT-Schlauch	Saint-Gobain Performance Plastics	3702003	Tamanho: 0,25 x 2,05 mm (Lda: 0,9 mm)
Loctite 401	Henkel	233641	Supercola
Óleo de silicone	Thomas Recording	M-1000
Minisart RC15	Sartorius	17761----------R	Filtro de seringa
Sistema de microinjeção multicanal	Thomas Recording		manipulador de microeletrodo multicanal " Sistema Eckhorn" equipado com microeletrodos e micropipetas e uma bomba de microinjeção multicanal de precisão
personalizado		da McLab	para controlar a apresentação de estímulos

deionizadaSoftware de laboratório interno