A Quantitative Glycomics e Proteomics Combinada estratégia de purificação

Resumo

Um protocolo de alto rendimento foi desenvolvido para purificação combinada de proteômica e glicômica e quantificação de LC-MS/MS no plasma. A análise de desamidação de motivos de glicosilação ligados a N foi específica para locais desglicosilados. A quantificação precisa de N-glicanos foi alcançada acoplando a separação de N-glicanos auxiliada por filtro à normalização da individualidade ao marcar com a estratégia de marcadores de hidrazida de glicano.

Resumo

Há um desejo crescente nas ciências biológicas e clínicas de integrar e correlacionar várias classes de biomoléculas para desvendar a biologia, definir caminhos, melhorar o tratamento, entender doenças e ajudar na descoberta de biomarcadores. A glicosilação ligada a N é uma das modificações pós-traducionais mais importantes e robustas em proteínas e regula funções celulares críticas, como sinalização, adesão e função enzimática. As técnicas analíticas para purificar e analisar N-glicanos permaneceram relativamente estáticas na última década. Embora precisos e eficazes, eles geralmente exigem conhecimentos e recursos significativos. Embora alguns esquemas de purificação de alto rendimento tenham sido desenvolvidos, eles ainda não encontraram ampla adoção e muitas vezes dependem do enriquecimento de glicopeptídeos. Um método promissor, desenvolvido por Thomas-Oates et al., separação de N-glicanos auxiliada por filtro (FANGS), foi demonstrado qualitativamente em tecidos. Aqui, adaptamos o FANGS ao plasma e o acoplamos à normalização da individualidade ao marcar com a estratégia de marcadores de hidrazida de glicano, a fim de obter quantificação relativa precisa por cromatografia líquida, espectrometria de massa e ionização por eletrospray aprimorada. Além disso, projetamos uma nova funcionalidade para o protocolo, obtendo tandem, proteômica shotgun e análise do local de glicosilação no plasma de galinha. Mostramos que os N-glicanos purificados em filtro e derivatizados por marcadores hidrofóbicos de hidrazida foram comparáveis em termos de abundância e classe aos da extração em fase sólida (SPE); este último é considerado um padrão-ouro na área. É importante ressaltar que a variabilidade nos dois protocolos não foi estatisticamente diferente. Os dados proteômicos coletados de acordo com os dados glicômicos tinham a mesma profundidade em comparação com um resumo padrão de tripsina. A desamidação do peptídeo é minimizada no protocolo, limitando a desamidação inespecífica detectada nos motivos de glicosilação. Isso permitiu a análise direta do local de glicosilação, embora o protocolo também possa acomodar a marcação do local ^{de 18}O. No geral, demonstramos um novo protocolo baseado em filtro imparcial e de alto rendimento em linha para análise quantitativa de glicômica e proteômica.

Introdução

No campo de proteómica, a preparação da amostra do filtro auxiliado (FASP) tem sido amplamente adoptada para a sua capacidade de minimizar a quantidade de material de partida, diminuir a amostra de preparação de artefactos, e maximizar a taxa de transferência de amostra ^1. No entanto, um tal processo tem ainda a surgir e ganhar espaço para o campo de glycomics. Desenvolvimento de high-throughput, os fluxos de trabalho quantitativos são necessários por causa do papel integrante da glicosilação em defesa biológica e sua modulação por câncer ou doenças ^2,3. Nos mamíferos, N-glicanos são constituídos por unidades de repetição de sacarídeos (hexoses (HEX), hexosaminas (HexNAc), ácidos siálicos (NeuAc), e fucoses (Fuc)), que decoram uma estrutura de núcleo (Hex ₃ HexNAc ₂₎ ⁴ ligado covalentemente para asparagina. Embora o glycospace é consideravelmente grande quando isómeros são contados (> 10 ^12), ela é muito pequena numa base composição e pesos moleculares variam tipicamente de 1,000-8,000 Da ^{5 <}/ Sup>. A homogeneidade de composição da classe e suas propriedades hidrofílicas de glicanos representam desafios únicos para purificação, separação e espectrometria de massa (MS) fluxos de trabalho ^6.

Tradicionalmente, os N-glicanos são digeridos a partir de proteínas ou péptidos por p�tido N -glycosidase F (PNGase F) e, em seguida, enriquecido por cromatografia por afinidade de lectina ^7, capturado por esferas de hidrazida ^8, ou purificados por meio de extracção em fase sólida (SPE) ^9,10. Enquanto estes métodos são altamente eficazes, eles introduzem passos extra para dessalinização e limitar o número de amostras simultaneamente processados. Durante a última década, têm sido propostos uma série de plataformas de alto rendimento para glycomics. Kim et ai. Publicado um método semi-automatizado usando, uma placa de SPE de 96 poços operado a vácuo ^11. Alternativamente, um método de afinidade-filtro (N -glyco-FASP) foi desenvolvido pelo grupo de Mann, que exigiu a derivação inicial do filtro com uma composição de lectinas ^12. Por último, o grupo Thomas-Oates proposto um método semi-quantitativo, o filtro de separação Aided N-glicano (PRESAS), o qual explorado o tamanho de composição estreita do glycospace ^13. Baseando-se no peso molecular filtros de corte, pequenos contaminantes foram primeiro lavadas para o lixo e, em seguida N-glicanos foram digeridos e fluido. proteínas desglicosiladas permanecem no filtro no presente protocolo, e pode ser submetido a FASP em-linha.

A identificação e quantificação dos glicanos por ionização por electrospray (ESI) MS requer separações off-line para resolução (parcial) de isómeros e derivatização para a detecção de espécies de baixo abundantes. Rotulagem na individualidade quando normalizar com a estratégia de glicano etiquetas hidrazida confere compatibilidade com cromatografia líquida de fase reversa (RPLC) ^14,15. O 4-fenetil-benzo-hidrazida (P2PGN) tag hidrofóbico medeia a hidrofilicidade dos glicanos, ENHancing ionização por, em média, quatro vezes ^16. Embora outras técnicas, tais como a permetilação ¹⁷ ou químicos de marcação reactivo a amina ^18, oferecem vantagens semelhantes, na reacção hidrazida, glicanos são feitos reagir 1: 1 estequiometricamente em condições fáceis. A quantificação relativa ser efectuada por análise conjunto de amostras derivados com nativa (NAT) ou ¹³ C ₆ etiquetas estável isótopos (SIL).

O método a seguir evolui FANGS para aplicações de plasma e casais se para a tag hidrofóbico P2GPN para a quantificação relativa preciso. Além disso, ele foi projetado para executar proteômica shot-gun, profiling desamidação e glycomics quantitativos em uma única alíquota de amostra, sem comprometer a integridade das análises.

Protocolo

1. A proteína e glicoproteína Desnaturação e Alquilação

1. Para preparações convencionais de carga, com 2,5 ul de uma solução 0,1 ug / uL de glicoproteína (por exemplo ARNase fetuína ou B) para um de 30 kDa ou 10 peso molecular de corte do filtro kDa (MW).
   1. Para amostras de plasma biológicos, verifique a concentração de proteína através de um ensaio ^{de 20} (BCA) proteína ácida padrão Bradford ¹⁹ ou bicincon�ico. Dilui-se o plasma, se necessário, com bicarbonato de amónio 100 mM (NH ₄ HCO ₃₎ em _H2O (Digest Tampão PNGase) a um pH de 7 ~ para conter entre 10-100 mg de proteína total / ml. Carregar 2,5 ul de plasma (25-250 ug de proteína) para um filtro.
      Nota: Este protocolo foi testado apenas no plasma a partir de amostras de sangue recolhidas na presença de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA).
2. Adicionar 2 mL de uma solução de ditiotreitol (DTT) para cada amostra no filtro.
3. Dilui-se a amostra com 200 ul de tampão de digestão com PNGase.
4. Tapar o tubo de amostra e filtro levemente vórtice, tomando cuidado para não perturbar o filtro a partir do seu assento. Incubar a amostra a 56 ° C durante 30 min para desnaturar as proteínas e glicoproteínas.
5. Para alquilar as amostras, adicionar 50 ul de 1 M iodoacetamida, para se obter uma concentração final de ~ 200 mM e incuba-se a 37 ° C durante 60 min.
   NOTA: Se a análise proteômica não é desejada, o passo 1.5 pode ser ignorada.
6. Concentra-se a glicoproteína desnaturado para o filtro de amostras por centrifugação a 14000 xg durante 40 min. Descarte fluir.

2. N -linked Glicano Digestão Enzimática

1. Lava-se a amostra com 100 ul de tampão de digestão com PNGase. Concentra-se a glicoproteína no filtro a 14000 xg durante 20 min e descartar fluir.
   1. Repetir o passo de lavagem e concentrado duas vezes, para um total de três vezes, obtendo-se um concentrado no volume morto filtro (~ 5 mL). descartar tudofluir através.
   2. frasco de recolha de descarte vez lavagens estão completos. Colete todos os eluentes futuros e lavagens em um novo frasco de coleta.
      NOTA: PNGase digerir tampão ¹⁸ em H ₂ O pode ser utilizado durante o passo de digestão com PNGase F para a marcação isotópica estável de locais de asparagina glicosilado, que se tornam quimicamente desamidada.
2. Adicionar 2 mL de glicerol livre de PNGase F (75,000 x unidades / ml), para realizar uma filtragem após transferência para um frasco de recolha de fresco. Adicionar 98 ul de tampão de digestão com PNGase, trazendo para o volume total de 100 ul, e gentilmente pipeta cima e para baixo sobre o filtro para misturar. Enzimaticamente digerir os glicanos nas condições em etapas 2.2.1, 2.2.2, 2.2.3 OR.
   NOTA: Três métodos para a desglicosilação de proteínas pode ser usado. Para a análise exclusiva glycomics (não há proteómica), o tempo de incubação no passo 2.2.1 é recomendada. Para glycomics e proteómica investigação, os passos 2.2.2 e 2.2.3 irá produzir peptídeos de alta qualidade com o mínimo não-spdesamidação ecific.
   1. Glycomics-somente protocolo de digestão (18 horas): Incubar as amostras a 37 ° C durante 18 horas para clivar enzimaticamente todos os N-glicanos.
   2. Espiga no protocolo de digestão (SPI): Incubar as amostras a 50 ° C durante 2 h. Trabalhando rapidamente, retire amostras e pico em um 2 ul adicional de livre de glicerol PNGase F (75.000 x unidades / ml). Levemente vortex as amostras para 1-2 segundos para misturar. Incubar as amostras a 50 ° C durante mais 2 horas.
   3. protocolo de microondas digestão (MD): Colocar as amostras em um rack de tubo de microcentrífuga flutuante. amostras flutuar no de 1 L copo cheio com 1 L de água desionizada (Dl). Colocar a proveta no centro de um forno de micro-ondas (950 W) com uma placa rotativa. Micro-ondas a 60% de potência (570 W) durante 5 min. Para esfriar, retire amostras e mantenha a temperatura ambiente durante 2 min. Então microondas por 5 minutos adicionais à potência de 60%.
      NOTA: As configurações de potência de microondas terá de ser ajustada com base na potência máxima de microondas.potência média deve ser mantida constante entre os modelos.

3. A eluição de N-glicanos

1. Eluir glicanos centrifugando a amostra a 14.000 xg durante 20 min a 20 ° C.
2. Adicionar 100 ul de tampão de digestão com PNGase para o filtro e centrifugar a 14000 xg durante 20 min a 20 ° C. Recolha de lavagem contendo qualquer restantes N -ligada glicanos, no mesmo frasco coleção, como o eluente. Repita duas vezes. Retire o filtro e coloque em novo frasco de coleta.
3. Incubar as amostras de glicano no -80 ° C congelador até congelado (30-60 min). A seco de conclusão, à temperatura ambiente, em concentrador de vácuo (4-6 h).
   NOTA: N-glicanos podem ser armazenadas a -20 ° C durante até seis meses antes da derivatização.

4. Proteína FASP Digestão

NOTA: Se proteómica ou análise do local desamidação não é desejada, secção 4 do protocolo pode ser ignorada.

1. Lavar tele filtrar, contendo os péptidos desamidados, com 400 ul de tampão de ureia 8 M. Tapar o frasco de recolha e levemente vortex para misturar. Concentra-se no filtro a 14000 xg durante 15 min. Descarte todo o flow-through.
   1. Repetir o passo 4.1 mais duas vezes, para um total de três lavagens com tampão de ureia.
2. Lavar o filtro, contendo os péptidos desamidados, com 400 ul de 2 M de ureia, 10 mM CaCl ₂ (tampão de tripsina digerir tampão). Tapar o frasco de recolha e levemente vortex para misturar. Concentra-se no filtro a 14000 xg durante 15 min. Descarte todo o flow-through.
   1. Repetir etapa 4.1 duas vezes adicionais para um total de três lavagens com tampão de tripsina de digerir.
   2. frasco de recolha de descarte vez lavagens estão completos. Colete todos os eluentes futuros e lavagens em um novo frasco de coleta.
3. Adicionar 50 ul de tripsina porcina modificado de 1:50 ou 1: 5 de tripsina: proteína (w / w) proporção para a descoberta ou proteómica quantitativos experiências, respectivamente.Tapar o frasco de recolha e levemente vortex para misturar.
4. Incubar as amostras a 37 ° C durante 2 h. Trabalhando rapidamente, retire amostras e pico de um adicional de 50 ul de tripsina na 1:50 ou 1: relação proteína: tripsina 5. Levemente vortex as amostras para 1-2 segundos para misturar. Incubar as amostras a 50 ° C durante mais 2 horas.
5. Elui-se os péptidos por centrifugação a 14000 xg durante 15 min.
6. Lavar os péptidos restantes do filtro com 400 ul de ácido fórmico a 1% e 0,001% de Zwittergent 3-16 (tampão de têmpera). Elui-se fora o filtro por centrifugação a 14000 xg durante 15 min.
7. Quantificar a concentração de peptídeo nas amostras por Bradford ¹⁹ ou ensaio BCA ^20.
8. Incubar as amostras de péptidos na -80 ° C congelador até congelado (30-60 min). A seco de conclusão, à temperatura ambiente, em concentrador de vácuo (4-6 h).
   NOTA: secada péptidos podem ser armazenadas a -20 ° C durante até três meses.
9. Ressuspender proteínas trípticos pouco antes de Liquicromatografia de massa espectrometria de d (LC-MS) análise em 2% de acetonitrilo, 98% _H2O, e ácido fórmico a 0,1% (fase móvel A) a concentração desejada. As concentrações de peptídeos trípticos de gama plasma 2,5 ul 100-300 ng / mL.

5. A derivatização de N glicanos com -linked hidrofóbicos hidrazida Marcações

1. Reconstituir pesados ​​(SIL) ou luz (NAT) reagentes P2GPN secas em 1 ml de 75:25 MeOH: ácido acético (solução de derivatização), para uma concentração final de 0,25 mg / ml. Reagentes vai levar até 10 min para solubilizar completamente. Extensivamente vortex para assegurar a solubilização completa.
   Nota: Na eventualidade de este protocolo de derivatização é usado com N-glicanos normais, contra glicanos purificada, a razão molar de P2GPN: glicano deve ser aproximadamente (e não menos) do que 17: 1.
2. Tag seca N-glicanos com 200 ul (50 ug) de SIL ou NAT P2GPN reagente. Pipeta cima e para baixo para voltar a suspender glicanos secos. Vortex samples e depois girar amostras para ~ 5 segundos em uma centrífuga de bancada.
3. Reagir os glicanos com o reagente durante 3 h a 56 ° C.
4. Imediatamente mover glicanos da incubadora para o concentrador de vácuo. A seco para completar a 55 ° C (3-5 h).
   Nota: Esta etapa sacia a reação de derivação; a amostra deve estar completamente seca para evitar reactividade cruzada nas etapas subsequentes.
   NOTA: As amostras secas, marcadas podem ser armazenadas a -20 ° C durante até seis meses.
5. Ressuspender etiquetado N-glicanos em 25-50 ul de _H2O imediatamente antes da análise LC-MS. Pipeta cima e para baixo para garantir N-glicanos são totalmente solubilizado.
   NOTA: O volume de ressuspensão é dependente da concentração de partida de glicoproteína que pode ser estimada a partir da concentração de proteína inicial. No entanto, o intervalo vai variar consoante o tipo de amostra e devem ser otimizados individualmente.
6. Centrifugar as amostras a 14.000 xg durante 5 min. Remover o supernatant, tomando cuidado para não deixar a ponta da pipeta tocar o fundo do tubo de centrifugação.
   Nota: O excesso de marcação pode não ser visível a olho nu, mas irá ser reduzida por centrifugação.
7. Combinar um par de amostras de NAT e SIL, se desejado para a quantificação relativa, em uma proporção de 1: 1 para análise em tandem.

6. pressão ultra-elevada Cromatografia Líquida e Espectrometria de Massa de Análise

NOTA: A LC e MS condições descritas para um Fácil NLC-1000 e um Q Exactive alta campo, respectivamente, foram otimizados in-house para análise proteômica e análise de glicanos ^21. Estas condições podem ser adaptadas para outros sistemas de LC de pressão ou de nano ultra-altos e outros espectrómetros de massa de alta resolução de energia, mas pode necessitar de modificações ligeiras. A utilização de alta resolução de espectrometria de massa de potência é necessário para a identificação e análise de glicano desamidação ^22,23.

NOTA: As etapas 6,1-6,3 pode ser skipped se uma cromatografia de fase inversa apropriado ou interacção hidrófila armadilha comercial e são utilizados em coluna.

1. Sintetizar um filtro poroso em ID 100 uM capilar de acordo com Meiring et al. ^24, para utilização como uma armadilha.
2. Embalar a armadilha sob pressão com 2,6 uM, 100 A, C _18, o material de embalagem e cortar um comprimento de 5 cm.
3. Pacote de uma coluna de 75 uM ID emissor sob pressão com 2,6 uM, 100 A, C _18, o material de embalagem e cortar um comprimento de 30 cm.
4. Prepare dois métodos diferentes de LC-MS para a proteômica (6.4.1) e Glycomics (6.4.2) workflows.
   Nota: Proteína e amostras de glicano pode ser executado na mesma configuração de armadilha / coluna em qualquer ordem.
   1. Para a análise de proteínas, injectar ~ 400 ng de proteína para a coluna de fase A móvel (MPA). Executar a amostra em 300 nl / min, de acordo com a Tabela 1, com um 1 ml de equilíbrio pré-coluna (500 bar) e uma 5 ul de equilíbrio coluna analítica(500 bar). Ionizar proteínas nas condições MS fornecidos na Tabela 2.
   2. Para a análise de glicano, 5 ul de injectar ressuspensas, com etiquetas P2GPN amostras equimolares NAT / SIL na coluna. Executar a amostra em 300 nl / min, de acordo com a Tabela 3, com um 2 ul de equilíbrio pré-coluna (500 bar) e uma coluna analítica de equilíbrio 5 ul (500 bar). Ionizar glicanos nas condições MS fornecidos na Tabela 4.

Tempo	% MPA	% MPB
0	100	0
5	98	2
105	80	20
135	68	32
136	5	95
151	5	95
152	100	0
167	100	0

Quadro 1. Condições de LC para análise proteómica. Um gradiente de eluição com a fase móvel B (MPB, 98% de acetonitrilo, 2% _{de H2O,} 0,1% ácido fórmico) foi realizada para eluir os péptidos para proteómica shot-gun, dados dependentes de aquisição , experiências de EM.

MS 1 Parâmetros
Faixa de massa (Th)	375-1500
Resolução	120.000
AGC	1 x 10 6
Max Ionização Tempo	30
S-Lens FR Nível	55
capilar TemP (° C)	300
Spray de tensão	1.75
MS 2 Parâmetros
aquisição Tipo	Top20
Resolução	15.000
AGC	1 × 10 5
Max Ionização Tempo	30
Rácio underfill	2%
Isolamento Window (Th)	1.4
Exclusão cobrança Estado	+1
Normalizado energia de colisão	27
Tempo (s) de Exclusão	20

Tabela 2: Condições MS para análise proteômica Os parâmetros para ionização electrospray, MS ¹ aquisição e MS ² aquisição de um instrumento Orbitrap usando dissociatio de maior energia.n (HCD) são dadas.

Tempo	% MPA	% MPB
0	95	5
1	70	30
41	60	40
46	37	63
47	10	90
55	10	90
56	95	5
66	95	5

Tabela 3:. Condições de LC para a análise de glicano Um gradiente de eluição foi realizada com etiquetas para eluir hidrazida N-glicanos por análise de MS.

MS 1 Parâmetros
Faixa de massa (Th)	600-1900
Resolução	60.000
AGC	5 x 10 5
Max Ionização Tempo	64
S-Lens FR Nível	65
Capilar Temp (° C)	325
Spray de tensão	1.75
MS 2 Parâmetros
aquisição Tipo	Top12
Resolução	15.000
AGC	5 x 10 4
Max Ionização Tempo	100
Rácio underfill	1%
Isolamento Window (Th)	1.4
Corrigido Primeira Missa
Pisou Normalizada energia de colisão	10/20/30
Exclusão Tempo (seg)	15

125

Tabela 4: Condições MS para hidrazida marcado N análise de glicanos Os parâmetros para ionização electrospray, MS ¹ aquisição, e aquisição de MS ² em um instrumento Orbitrap usando a dissociação de maior energia (HCD) são dadas..

7. Proteomics e Análise desamidação

1. Identificar proteínas / péptidos usando o padrão ferramentas de pesquisa bioinformática.
   Nota: O seguinte protocolo de análise foi projetada usando as bases de dados Swiss-Prot / Trembl em UniProtKB e busca através SEQUEST no 1.4 software Proteome Discoverer, no entanto, o protocolo pode ser diretamente traduzidos para qualquer motor de busca de proteínas e de pontuação usando um software GUI. Todos os comandos a seguir indicados podem ser acessados ​​em interfaces de software através de menus drop-down.
   1. Criar ou baixar um banco de dados de sequência de proteína organismo apropriado de dados genômicos ou bancos de dados proteoma disponíveis como descrito por Apweiler et al. ²⁵
      Nota: as bases de dados comuns incluem proteoma da Swiss-Prot, TrEMBL, e NCBI, mas pode ser construída a partir de dados in-house bem.
2. Dentro do software, escolher um motor de busca de banco de dados e seleccione os parâmetros de acordo com a qualidade dos dados adquiridos e o rigor da busca desejada, como descrito por Perkins et al. para MASCOTE ²⁶ ou Eng et al. para SEQUEST ^27.
   1. Para dados de alta massa de precisão, definir parâmetros para a busca no software da seguinte forma: Max 2 perdeu clivagens, 5 ppm precursor tolerância de massa, e 0,02 Da fragmento de tolerância de massa (para otimizado de detecção desamidação precisas ²²⁾ e incluem as seguintes modificações de péptidos trípticos : "carbamidomethyl (C)" modificação estática e "desamidação (N / Q)" e "boiidation (M) "alterações dinâmicas. Se usando ^18O digestão rotulagem, incluem" desamidação ¹⁸ O (1) ", tal como uma modificação dinâmica adicional.
   2. Search, usando o motor seleccionado, os dados de peptídeos matérias contra o banco de dados de proteínas (7.1.1).
      Nota: tolerâncias de massa deve ser apropriado para o instrumento utilizado e não arbitrariamente baixa.
      Nota: A função de busca é concluída automaticamente pelo software utilizando algoritmos específicos diferentes de pesquisa do motor. O algoritmo coador (MASCOTE), SEQUEST, ou outras combinações de algoritmos são utilizados para identificar proteínas de peptídeos e para marcar a validade dos hits; obter mais informações sobre as ferramentas disponíveis são cobertas em uma revisão de Gonzalez-Galarza et al. ^28,29. Dependendo do software, parâmetros de pesquisa adicionais podem precisar ser selecionados de acordo com o critério do usuário.
3. Exportar os peptídeos identificados para curadoria manual e furthanálise er.

Curador manualmente uma lista de péptidos contendo uma desamidação na asparagina identificados da N -linked motivo de glicosilação (NX- (S / T), onde X ≠ P). Cross-validar esses sites com motivos de glicosilação conhecidos da literatura e criar dois conjuntos de resultados (validados e teórica).

Use contagem espectral ³⁰ a comparar a percentagem de ocupação de um dado sítio de glicosilação através da comparação da abundância de formas desamidada e não desamidada.

8. Quantificação Relativa Glycan

Nota: O seguinte identificação e quantificação foi completada usando o software XCalibur. No entanto, qualquer software que analisa os dados em bruto e integra automaticamente picos cromatograf icos podem ser substituídos.

1. Gerar uma lista teórica de composições de glicano dos biologicamente possíveis combinações de hexoses, desoxi-hexoses, hexosaminas, ácidos siálico, e outras saccharides. Para este efeito, uma base de dados de glicano humano foi publicada por Walker et ai. ¹⁵ e pode ser usado como está. Para bancos de dados teóricos, as restrições biológicas específicas da espécie deve ser imposta ao espaço combinatória, e essas regras são descritas por Kronewitter et al. ^31.
2. Calcule as massas monoisotópico glicanos (M) das massas atômicas para cada composição para estados de carga de prótons + 1-3. Modificar as massas monoisotópico para incluir a adição de NAT (254,14191 g / mol) ou SIL (260,162042 g / mol) tag P2GPN.
3. Abra o programa "Setup Processing" do ponto de vista roteiro em XCalibur. Configurar um método de processamento de como exatamente o descrito no material suplementar de Walker et al. ^15, utilizando a lista gerada na etapa 8.2, contendo as massas monoisotópico teóricas para o [M + H] ^1+, [M + 2H] ²⁺ e [ M + 3H] ³⁺ espécies.
   Nota: Para confirmar a identidade de glicanos além precisasmassa, por NAT / SIL duplexado corridas, verificar se NAT e SIL N-glicanos pares co-eluir com o mesmo tempo de retenção. Qualitativamente, cruzada validar identificações com os espectros de MS ^2, que deve conter picos que pertencem à série de iões oxónio ^32.
4. Exportar o, cromatograma de iões extraídos integrado (XIC) áreas para o Excel para obter as abundâncias SIL e NAT como exatamente descritas no material suplementar de Walker et al. ¹⁵
5. No Excel, programa as células de uma nova coluna para calcular a correcção para a sobreposição de peso molecular ajustando a abundância SIL de acordo com a equação de publicada por Walker et ai ^{5 1.:}
   ,
   em que A é o pico monoisotópico e a sobreposição isótopo teórico, , Pode ser calculada de forma independente por composição.
6. Em uma segunda coluna, o programa das células para normalizar os canais de NAT e SIL usando a equação para o total do factor de glicano normalizada (TGNF), por espectro, como descrito por Walker et ai ^{5 1.:}
   ,
   onde N é o número de N-glicanos acima do limite de quantificação.
7. Em uma nova coluna, as células programa para levar a razão entre SIL: glicanos NAT (ou vice-versa) para calcular a dobra-a mudança de concentração entre as duas amostras.

Resultados

Figura 1:. O esquema do método FANGS-P2GPN marcação hidrofóbico acoplado (Método A) para a proteômica e glycomics combinados análise é dado passos que diferem entre glycomics de processamento e em tandem Glycomics apenas e análise do proteoma e com identificação do local de glicosilação, são destacados. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A in-line e proteómica glycomics, P2GPN método de marcação hidrófobo à base de filtro (Método A) foi validado para a identificação, quantificação, e polarização peso molecular usando amostras de plasma de galinha em pool (Figura 1). Para exclusiva experimentos Glycomics, inter-comparações nas abundâncias de N-glicanos extraído pelo métodoA a carbograph SPE (ouro-padrão, Método B) foram feitas (Figura 2). Não houve diferenças significativas nas abundâncias de glicanos entre os dois métodos. A variabilidade intra-foi também avaliada quantificando-se a SIL: NAT proporção de glicanos extraídos pelo mesmo método. Os log ₂ -distributions de ambos os métodos foram gaussiano, centrada no zero, e não é significativamente diferente (Figura 3A-B). O peso molecular varia entre os dois protocolos completamente sobrepostas, sugerindo que o filtro não discriminaram N-glicanos com base no intervalo de peso molecular e de hidrofilicidade (Figura 4).

Figura 2: Uma mistura equimolar de NAT e SIL N-glicanos extraiu-se pelo Método A ou Método B foi preparado a partir de 2,5 mL de plasma de galinha (n = 4) As amostras foram Anal.yzed por UPLC-MS de acordo com os parâmetros recomendados sugeridas na secção 6. As abundâncias para cada glicano, em cada canal NAT / SIL, foram calculados por integração da área sob o cromatograma de iões extraídos (MMA = 3 ppm), corrigindo para o molecular sobreposição de peso e ajuste pelo TGNF. Estas proporções são mostrados com os seus erros padrões. As abundâncias de Método B: Método A glicanos N não foram significativamente diferentes (p> 0,05). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: A variabilidade intra-no (A) Método A (n = 133) ou (B) Método B (n = 123) foi comparada estratégias. NAT e SIL misturas equimolares de N-glicanos, a partir do mesmo esquema de extracção, Foram analisadas mais de três repetições técnicas. O log ₂ -distributions foram centradas em zero e não foram significativamente diferentes entre os dois fluxos de trabalho. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: As gamas de pesos moleculares de glicanos a partir de cada uma das estratégias foram comparados. Os dois fluxos de trabalho rendeu glicanos abrangendo a mesma faixa de peso molecular. N-glicanos detectado em um protocolo contra o outro caiu um pouco acima do limite de detecção (1 × 10 ⁵ abundância) e não refletem tendência sistemática. Por favor clique aqui para ver uma maior versão desta figura.

(Tabela 5). O nosso filtro típico de 18 horas com base PNGase F digestão, seguido por digestão de tripsina FASP (protocolo Std) resultaram em níveis significativos de desamidação não-específica, o que pode interferir com a identificação de glycosites. Por conseguinte, um método utilizando um tempo de incubação mais curto a temperatura elevada (50 ° C) e um passo de pico-a PNGase F (protocolo SPI) foi explorada como uma alternativa, juntamente com um protocolo de digestão microondas (protocolo MD), para minimizar não- desamidação específica. Os glicanos observadas nos novos métodos de digestão não foram significativamente diferentes em composições ou abundâncias do padrão 18 horas, 37 ° C filtro PNGase F digest ( (Tabela 5).

		proteínas					peptídeos					péptidos desamidados					Glycosites					glicoproteínas
		+		-			+		-			+		-			+		-			+		-
FASP								3083					795					5					5
18hr		217		304			6013		5086			1029		733			257		24			112		18
MD		270		266			5190		5125			465		455			254		8			102		7
SPI		281		288			4729		4482			602		573			232		10			145		8

. Tabela 5: Comparação de dados proteomic de uma tripsina padrão digerir versus o método de marcação em-linha PRESAS-P2GPN foram feitas preparações foram realizadas com (+) e sem (-) de PNGase F para determinar as taxas de desamidação e estimativa não específica de fundo glycosite taxas de falsos positivos. As proteínas foram identificadas com 1% de taxa de descoberta de falsas (FDR); peptídeos foram filtradas com base na confiança peptídeo "alta" em Proteome Discoverer 1.4 (q <0,01); glycosites foram identified com base em sequências únicas contendo desamidação do motivo conservado de glicosilação (NXS / T); e glicoproteínas foram definidos como proteínas identificadas contendo, pelo menos, um glycosite identificado.

Figura 5: encurtado protocolos para glicanos foram desenvolvidos para minimizar a desaminação das amostras e em comparação com o 18hr PRESAS PNGase F Digest. As diferenças médias em abundâncias foram de 10% e 5% para o MD (2.2.3) e (2.2.2) SPI protocolos, respectivamente. Dos 48 glicanos identificados, 90% apresentaram menor que a variação de 1,5 vezes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Métodos quantitativos de alto rendimento são necessários para facilitar a análise rotineira de glicanos. Nos últimos trinta anos, a análise glicômica foi limitada a um subconjunto de grupos de pesquisa, apesar de sua importância em doenças, aplicações clínicas e farmacêuticas. O método de purificação e marcação FANGS-P2GPN para glicômica e proteômica realiza a mesma análise em uma única alíquota de amostra, reduzindo o custo de suprimentos e a quantidade de material necessário (particularmente importante em estudos em humanos e camundongos). Além disso, os esforços para minimizar a variabilidade nas preparações são extremamente importantes, pois cada etapa adicional contribui para o erro, potencialmente mascarando mudanças importantes, mas pouco abundantes, nos estudos de caso-controle. O acoplamento de FANGS à marcação de hidrazida hidrofóbica permite que amostras de proteínas e glicanos sejam executadas na mesma coluna RPLC, aumenta a ionização de glicanos, fornece quantificação relativa e pode ser aplicada quantitativamente ao plasma.

Para a análise de N-glicanos, é fundamental usar o nível sugerido de PNGase F para atingir a desglicosilação completa. Embora os glicanos sejam expostos a solventes, a desnaturação das proteínas e o excesso de enzimas ajudam a garantir uma clivagem eficiente e completa. Para uma quantificação precisa dos glicanos, é necessário garantir que eles estejam completamente secos após a derivatização para extinguir a reação e evitar reações cruzadas ao misturar as espécies NAT e SIL. Finalmente, ao estender o fluxo de trabalho para a análise de glicossítios, o tempo das etapas é fundamental para minimizar a desamidação não específica. Os protocolos modificados fornecidos para análise combinada de glicômica e proteômica funcionam de forma consistente quando realizados de acordo.

O fluxo de trabalho alcança a quantificação relativa precisa de N-glicanos do plasma em comparação com o método SPE padrão-ouro. Não há viés aparente nos tipos de glicanos extraídos em termos de peso molecular, hidrofilicidade e estrutura composicional. Embora não tenhamos explorado a análise qualitativa de glicanos ligados a O, esperamos que o FANGS possa acomodar a adição de uma etapa de eliminação de β após a digestão da PNGase F de glicanos ligados a N. No entanto, os procedimentos exigiriam modificações significativas para a limpeza do reagente antes da espectrometria de massa, e a análise de peptídeos será significativamente afetada. Para proteômica, a mesma profundidade de cobertura de proteoma é alcançada em comparação com os métodos tradicionais de FASP. É importante ressaltar que os métodos atingem uma taxa mínima de descoberta falsa para desamidação de N-glicanos. Embora o método seja compatível com a marcação de ¹⁸O de Asn durante a etapa de digestão da PNGase^22,23, a baixa taxa de descoberta de falso local de glicosilação sugere que pode não ser necessário, reduzindo ainda mais os custos e a complexidade.

O proteoma não é enriquecido para glicoproteínas neste método, o que tem vantagens e desvantagens. Certas glicoproteínas pouco abundantes podem não ser detectadas na análise. No entanto, a ocupação de sítios glicosilados por proteína, pode ser comparada entre amostras biológicas. Além disso, o erro e o viés introduzidos na purificação da afinidade da lectina ou no enriquecimento químico são eliminados. Em conclusão, o acoplamento de FANGS à normalização da individualidade ao marcar com a estratégia de marcadores de hidrazida de glicano resulta em um método simplificado, quantitativo e de alto rendimento para a análise em tandem do glicoma e do proteoma com grande potencial de aplicação em estudos clínicos de caso-controle.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ácido Acético (50%)	Sigma Aldrich	45754
Acetonitrila, grau HPLC	Burdick & Jackson	AH015-4
Bicarbonato de Amônio	Sigma Aldrich	Reagente Bradford A6141
	Sigma Aldrich	B6916	Alternativa: Kit de ácido bicinchonínico (Sigma Aldrich BCA1)
Cloreto de cálcio	Sigma Aldrich	C1016
Centrífuga	Eppendorf	5804 R	Centrífugas alternativas que atingem 14.000 x g são adequadas
DL-Ditiotreitol, 1  M em solução	Sigma Aldrich
Easy-nLC 1000	Thermo Scientific	LC120 LCs	alternativos de nano ou ultra alta pressão produzirão dados semelhantes, como: 1. Dionex UltiMateÒ 3000 LC (Thermo Scientific); 2. Acquity UPLC (Águas).
Suporte para Tubos Flutuantes	TedPella	20831-20
Fetuin	New England Biolabs	P6042S
Fornos de Laboratório Padrão Isotemp da Fisher Scientific	Fisher Scientific	11-690-625F	Incubadoras alternativas que atingem 56  ° C são adequados
para Ácido Fórmico	Sigma Aldrich	GE 56302
General	Electric	57B5 E82904	Qualquer micro-ondas com configurações de potência ajustáveis é adequado
Kit de Marcação de Glicanos INLIGHT	Cambridge Isotope Laboratories	GTK-1000	O kit INLIGHT fornece versões NAT e SIL do reagente P2GPN.
Iodoacetamida	Sigma Aldrich	A3221
Kinetix 2.6 mM, 100 &, C18 fase estacionária a granel	Phenomenex	Alternativa de mídia em massa	: Qualquer fase C18 estacionária 5
mM Mascot Daemon Software e Server	Matrix Science		Alternativa: Proteome Discoverer Software (Thermo Scientific)
Metanol, grau HPLC	Burdick & Jackson	AH230-4
PicoFrit Self-Pack Coluna: 360  μ m, OD 75  μ m ID, 15  μ m, não revestido, 5 por caixa, 50 cm	Novo Objective	1 5 PF360-75-15-N-5
PNGase F (sem glicerol), 75.000  unidades/ml	New England BioLabs	P0705L
	Thermo Scientific		Precisão alternativa de alta massa (5  ppm) espectrômetros de massa fornecerão dados semelhantes
RNase B	New England Biolabs	P7817S
Tripsina do Pâncreas Suíno	Sigma Aldrich	T6567-5X
Ureia	Sigma Aldrich	Concentrador de Vácuo 51456
Concentrador de Vácuo Savant SPD131DDA SpeedVac	Thermo Scientific	SPD131DDA	Concentradores de vácuo alternativos são adequados
Filtros Vivacon 500 30 kDa	Alternativa VN01H22 da Sartorius Stedim Biotech		: Unidades de Filtro Centrífugo Amicon Ultra 0.5 com Ultracel-10  Membrana kDa (Millipore UFC501096)
Água, grau HPLC	Burdick & Jackson	AH365-4
Água, 18O	Cambridge Isotope Laboratories	OLM-240-97-1	A adição de 18O na etapa de digestão da PNGase F é opcional e pode não ser necessária para estudos de desamidação concluídos com 95% de confiança
Xcalibur 2.0	Thermo Scientific	XCALIBUR20
Zwittergent Test Kit	Merck Millipore	693030