Isolamento, caracterização e exploração funcional da célula de rede gengival Imune

Summary

Nós estabelecemos uma técnica para o isolamento, caracterização fenotípica e análise funcional de células imunes de gengiva murino.

Abstract

As redes de células imunes nos tecidos desempenham um papel vital na mediação da imunidade local e na manutenção da homeostase tecidual, mas pouco se sabe sobre as populações de células imunes residentes na mucosa oral e na gengiva. Estabelecemos uma técnica para o isolamento e estudo de células imunes de tecidos gengivais murinos, uma área de exposição microbiana constante e um local vulnerável a uma doença inflamatória comum, a periodontite. Nosso protocolo permite uma caracterização fenotípica detalhada das populações de células imunes residentes na gengiva, mesmo em estado estacionário. Nosso procedimento também produz células suficientes com alta viabilidade para uso em estudos funcionais, como a avaliação da secreção de citocinas ex vivo. Essa combinação de caracterização fenotípica e funcional da rede de células imunes gengivais deve ajudar a investigar os mecanismos envolvidos na imunidade oral e na homeostase periodontal, mas também avançará nossa compreensão dos mecanismos envolvidos na imunopatologia local.

Introduction

Tecidos gengivais rodeiam a dentição humana e de murídeo e são constantemente expostos ao biofilme complexo ^do dente 1. A rede celular imune policiais a barreira gengival é vital para manter a integridade do tecido, garantindo a homeostase com os micróbios comensais locais e, ao mesmo tempo, proporcionando uma imunidade eficaz contra o desafio patogénico ^2. Para alcançar a homeostase, o sistema imunológico é cuidadosamente adaptado ao ambiente gengival criação de uma rede de células imunes altamente especializados, mas poucos detalhes são conhecidos das populações de células imunes gengivais e seu papel na manutenção da imunidade tecido ^2.<....

Protocol

Todos os procedimentos experimentais descritos neste protocolo seguido orientações necessários e foram aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use, NIDCR / NIH.

1. preparar com antecedência

1. Prepare meio completo: RPMI suplementado com 2 mM de L-glutamina, 100 unidades / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina e 10% de FBS.
2. Prepare a mídia de DNase: 50 ml de meio RPMI suplementado com 7,5 ug DNase (Faça fresco, manter em gelo em todos os momentos).
3. Prepare meios colagenase-ADNase: 5 ml de meio de ADNase mais 3,2 mg / mL de colagenase tipo IV (Adicione fresca, manter em gelo em todos os momentos).
4. ta....

Results

Para ilustrar a aplicação do protocolo, mostramos resultados representativos que examinam a rede de células imunes na gengiva de ratos com e sem periodontite (WT vs. LFA ^{- / -,} a Figura 2a - C). Representante FACS gráficos mostram células CD45 ⁺ hematopoiéticas ao vivo na gengiva (Figura 2A, 2C). Isolamento e tratamento de células do sistema imunológico com este protocolo produz cél.......

Discussion

A técnica actual produz com sucesso um grande número de células do sistema imunológico (a partir de um único rato) apropriado, não só para a caracterização fenotípica, mas também para estudos funcionais ex vivo. Outro grupo havia publicado anteriormente um protocolo para isolar e caracterizar células imunes gengivais murino e introduziu o valor do uso de multicolor citometria de fluxo no estudo da periodontite em modelos animais ^9. Na sequência de resolução de problemas consideráveis ​​a modificação .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tesoura Fina	Ferramentas de ciência fina	14058-11
Cabo de bisturi #3	Ferramentas de ciência fina	10003-12
Lâminas de bisturi #10	Ferramentas de ciência fina	10010-00	de estéril
	Integra Miltex	6-304
Agulhas com chanfro regular	BD Medical	305109	27 G, 12,7 mm de comprimento
Seringas Monoject	Covidien	8881513934	ponta Luer-lock, 3 ml
PBS, pH 7,4	Life Technologies	10010-049	Sem Cálcio e Magnésio
RPMI 1640	Lonza	12-167F	Sem L-glutamina
DNase I de pâncreas bovino	Sigma-Aldrich	DN25-1G
Colagenase tipo IV	Gibco (por Life technologies)	17104-019
Soro Fetal Bovino	Gemini Bioprodutos	100-106
Gentamicina 50 mg / ml	Qualidade biológica	120-098-661EA
Caneta Strep	Gibco (por Life technologies)	15140-122
L-Glutamina	Gibco (por Life technologies)	25030-081
0,5 M EDTA pH 8,0	Qualidade biológica	351-027-721EA
Tubos de 50 ml	Corning	352070	Polipropileno, estéril
70 μ Filtros de células M	Corning	352350
Placas de Petri	Corning	351029	Tubos FACS estéreis
5 ml Corning		352052	Estéril
BD GolgiPlug	BD Biosciences	555029	Contém brefeldina Uma solução
Phorbol 12-Miristato 13-Acetato (PMA)	Sigma-Aldrich	P8139
Sal de Cálcio Ionomicina	Sigma-Aldrich	13909
Saponina da casca de quillaja	Sigma-Aldrich	S4521
LIVE/DEAD Kit de coloração de células mortas Aqua corrigível	Life Technologies	L34957
Anti-Mouse CD45 Alexa Fluor 700	eBioscience	56-0451-82
Anti-Mouse CD4 eFluor 450 eBioscience		48-0042-82
Anti-Mouse TCR beta APC eFluor 780	eBioscience	47-5961-82
Anti-Mouse gamma delta TCR FITC	eBioscience	11-5711-82
Anti-Mouse IL-17A APC	eBioscience	12-7311-82
Anti-Mouse IFN-&gama; PE	eBioscience	11-5931-82
Anti-Mouse NK1.1 PE-Cy7	eBioscience	25-5941-82
Anti-Mouse CD90.2 APC eFluor 780	eBioscience	47-0902-82
Anti-Mouse CD3e FITC	eBioscience	11-0031-82
Anti-Mouse CD19 FITC	eBioscience	11-0193-82
Anti-Mouse CD11b FITC	eBioscience	11-0112-82
Anti-Mouse CD11c FITC	eBioscience	11-0114-82
Anti-Mouse TCR beta FITC	eBioscience	11-5961-82
Anti-Mouse Ly-6G FITC	eBioscience	11-5931-82
Anti-Mouse Ly-6C FITC	BD Pharmingen	553104