Isolamento, caracterização e exploração funcional da célula de rede gengival Imune

Resumo

Nós estabelecemos uma técnica para o isolamento, caracterização fenotípica e análise funcional de células imunes de gengiva murino.

Resumo

As redes de células imunes nos tecidos desempenham um papel vital na mediação da imunidade local e na manutenção da homeostase tecidual, mas pouco se sabe sobre as populações de células imunes residentes na mucosa oral e na gengiva. Estabelecemos uma técnica para o isolamento e estudo de células imunes de tecidos gengivais murinos, uma área de exposição microbiana constante e um local vulnerável a uma doença inflamatória comum, a periodontite. Nosso protocolo permite uma caracterização fenotípica detalhada das populações de células imunes residentes na gengiva, mesmo em estado estacionário. Nosso procedimento também produz células suficientes com alta viabilidade para uso em estudos funcionais, como a avaliação da secreção de citocinas ex vivo. Essa combinação de caracterização fenotípica e funcional da rede de células imunes gengivais deve ajudar a investigar os mecanismos envolvidos na imunidade oral e na homeostase periodontal, mas também avançará nossa compreensão dos mecanismos envolvidos na imunopatologia local.

Introdução

Tecidos gengivais rodeiam a dentição humana e de murídeo e são constantemente expostos ao biofilme complexo ^do dente 1. A rede celular imune policiais a barreira gengival é vital para manter a integridade do tecido, garantindo a homeostase com os micróbios comensais locais e, ao mesmo tempo, proporcionando uma imunidade eficaz contra o desafio patogénico ^2. Para alcançar a homeostase, o sistema imunológico é cuidadosamente adaptado ao ambiente gengival criação de uma rede de células imunes altamente especializados, mas poucos detalhes são conhecidos das populações de células imunes gengivais e seu papel na manutenção da imunidade tecido ^2.

Quando a homeostase imune é interrompido na gengiva, quer através do aumento da susceptibilidade do hospedeiro e / ou presença de comunidades microbianas dysbiotic, uma condição inflamatória, periodontite surge ^{3 4.} A periodontite é uma doença inflamatória comum, levando à perda do dente sestruturas upporting. Nas suas formas mais graves que é observada em cerca de 10% da população em geral ^5. Dissecando os principais fatores envolvidos na susceptibilidade a periodontite e progressão tem sido difícil ^6. No entanto, os modelos animais têm sido extremamente útil na compreensão dos mecanismos de iniciação e progressão da periodontite ^7. Os modelos podem ser utilizados para definir as populações de células principais e mediadores moleculares que são vitais para a manutenção da homeostase imune e desenvolvimento unidade de periodontite. Essa visão vai transformar a nossa compreensão do controle específico da gengiva da homeostase imunológica e promover nossa compreensão atual da patogênese da doença.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais descritos neste protocolo seguido orientações necessários e foram aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use, NIDCR / NIH.

1. preparar com antecedência

1. Prepare meio completo: RPMI suplementado com 2 mM de L-glutamina, 100 unidades / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina e 10% de FBS.
2. Prepare a mídia de DNase: 50 ml de meio RPMI suplementado com 7,5 ug DNase (Faça fresco, manter em gelo em todos os momentos).
3. Prepare meios colagenase-ADNase: 5 ml de meio de ADNase mais 3,2 mg / mL de colagenase tipo IV (Adicione fresca, manter em gelo em todos os momentos).
4. tampão FACS pré-cool: 0,5% FBS diluído em PBS.
5. Pré-cool centrífuga a 4 ° C.
6. incubador agitador Aquece-se até 37 ° C.

2. Isolamento, Dissecção e isolamento de células a partir gengivais Blocks

1. Eutanásia ratos por expondo-os _a CO2 numa câmara apropriada, de acordo com orientações de AraC.
2. Abra a cavidade torácica e abdominal para expor o coração e os órgãos internos. Para perfundir, fazer uma incisão na veia cava inferior e perfundir 3 ml de PBS através do ventrículo esquerdo usando uma seringa de 3 ml com uma agulha G 27.
3. Imobilizar o corpo ea cabeça do mouse sobre uma almofada com o estômago virado para cima.
4. Corte cada comissura do lábio para o pescoço com uma tesoura, que separa a pele que cobre mandíbula e pescoço região, expondo os tecidos e músculos subjacentes. Dissecar o lábio inferior para descobrir a mandíbula.
5. Corte entre os incisivos inferiores para separar ambos os lados da mandíbula e imobilizar cada lado para aceder à cavidade oral.
6. Visualizar e dissecar o paladar de distância a partir da cavidade nasal.
7. Dissecar áreas usando uma lâmina de 10 e incluem áreas molares superiores e inferiores com circundante gengiva (Figura 1). Fazer incisões verticais imediatamente anterior ao primeiro molar e posterior ao terceiro molar e uma incisão horizontal naa borda da gengiva (colarinho branco de tecido dentes adjacentes).
8. Coloque o maxilar e mandibular blocos em um tubo de 50 ml com 5 ml de colagenase / DNase (manter em gelo).
9. Incubar numa incubadora com agitação a 37 ° C durante 1 hora e durante os últimos 5 minutos de incubação adicionar 50 ul de EDTA 0,5 M.
10. Adicionar 5 ml de meio de ADNase frio para o tubo de 50 ml com os tecidos e agitar suavemente para misturar.
11. Transferir os 4 blocos de tecidos em uma caixa de Petri e cobrir com 500 ul de meios de DNase. Remover gengiva de cada bloco de tecido, utilizando uma lâmina de bisturi e apontando a lâmina para as áreas gengivais e interdentais.
12. Transferir os tecidos e os meios de comunicação a partir do prato de petri, bem como os meios de comunicação de ADNase anteriores utilizados durante a dissecção, para um novo tubo de 50 ml através do filtro de células (70 um de tamanho). Lavar com media DNase (3-5 ml) todos os instrumentos utilizados e filtro.
13. Usando o êmbolo estéril de uma seringa de 3 ml, triturar o tecido contra o filtro,filtragem com meios ADNase fria (30 a 35 ml).
14. Lave o filtro de células com a mídia DNase frio.
15. Centrifugar a 4 ° C, 314 xg durante 6 minutos.
16. Descartar o sobrenadante, re-suspender em 1 mL de meio completo.
17. Contagem de células (a quantidade esperada deve variar entre 8 x 10 ^5-1,2 x 10 ⁶ células, com uma viabilidade> 80%), utilizando um contador de células automatizado.

3. Estímulo e FACS coloração de células gengivais

1. Estimular a suspensão de célula única com PMA (50 ng / ml) e ionomicina (2,5 fig / ml) na presença de 1 ul / ml de brefeldina A.
2. Incubar por 3,5 horas a 37 ° C e 5% de CO _2.
3. Girar para baixo e lava-se com PBS e centrifugação a 4 ° C; 314 g durante 6 min.
4. Corar as células utilizando uma mancha de viabilidade seguindo as instruções do fabricante.
5. Stain para marcadores extracelulares (CD45, TCRγδ, TCRβ, CD4, CD8, TCRγδ ou formigaibodies de escolha) seguindo as instruções do fabricante.
6. Lavam-se as células com tampão FACS frio e centrifugação a 4 ° C, 314 xg durante 5 min.
7. Suavemente vortex para perturbar o sedimento celular.
8. Fixar as células com 2% de paraformaldeído durante 20 min à temperatura ambiente.
9. Lavam-se as células com tampão FACS frio, centrifugar a 4 ° C, 314 xg durante 5 min e mancha de citocinas intracelulares.
   1. Encher os tubos de FACS com uma solução fria de saponina a 0,5% diluído em tampão de SCAF e centrifugar a 4 ° C, 314 xg durante 5 min.
   2. Adicionar 300 uL de solução de saponina a 0,5% para os tubos de FACS, incubar durante 15 minutos no escuro a 4 ° C e depois centrifugar a 4 ° C, 314 xg durante 5 min.
   3. Corar as células de marcadores intracelulares (IL-17A e IFNy ou citocinas de escolha) seguindo as instruções do fabricante. Lavam-se as células com solução de saponina a 0,5% e centrifuga-se a 4 ° C, 314 xg durante 5 min.
   4. Lave novamente com FACSde tampão e centrifuga-se a 4 ° C, 314 xg durante 5 min.
   5. Re-suspender as células em 300 ul de tampão de FACS.
10. Analisar os resultados em um citômetro de fluxo.

4. Análise por Citometria de Fluxo

1. células visualizar a serem analisados ​​na frente (FSC) e dispersão lateral (SCC) e portão para excluir detritos.
2. Selecionar células individuais com área de dispersão para a frente (FSC-A) vs. altura parâmetros (FSC-H).
3. Células portão que são vivo (como indicado através de coloração de viabilidade) e positiva para o marcador CD45 ⁺ hematopoiéticas para posterior análise (Figura 2A e 2C).
4. Continue a análise de marcadores específicos, como mostrado na Figura 2 e na Figura 3.

Resultados

Para ilustrar a aplicação do protocolo, mostramos resultados representativos que examinam a rede de células imunes na gengiva de ratos com e sem periodontite (WT vs. LFA ^{- / -,} a Figura 2a - C). Representante FACS gráficos mostram células CD45 ⁺ hematopoiéticas ao vivo na gengiva (Figura 2A, 2C). Isolamento e tratamento de células do sistema imunológico com este protocolo produz cél...

Discussão

A técnica actual produz com sucesso um grande número de células do sistema imunológico (a partir de um único rato) apropriado, não só para a caracterização fenotípica, mas também para estudos funcionais ex vivo. Outro grupo havia publicado anteriormente um protocolo para isolar e caracterizar células imunes gengivais murino e introduziu o valor do uso de multicolor citometria de fluxo no estudo da periodontite em modelos animais ^9. Na sequência de resolução de problemas consideráveis ​​a modificação ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tesoura Fina	Ferramentas de ciência fina	14058-11
Cabo de bisturi #3	Ferramentas de ciência fina	10003-12
Lâminas de bisturi #10	Ferramentas de ciência fina	10010-00	de estéril
	Integra Miltex	6-304
Agulhas com chanfro regular	BD Medical	305109	27 G, 12,7 mm de comprimento
Seringas Monoject	Covidien	8881513934	ponta Luer-lock, 3 ml
PBS, pH 7,4	Life Technologies	10010-049	Sem Cálcio e Magnésio
RPMI 1640	Lonza	12-167F	Sem L-glutamina
DNase I de pâncreas bovino	Sigma-Aldrich	DN25-1G
Colagenase tipo IV	Gibco (por Life technologies)	17104-019
Soro Fetal Bovino	Gemini Bioprodutos	100-106
Gentamicina 50 mg / ml	Qualidade biológica	120-098-661EA
Caneta Strep	Gibco (por Life technologies)	15140-122
L-Glutamina	Gibco (por Life technologies)	25030-081
0,5 M EDTA pH 8,0	Qualidade biológica	351-027-721EA
Tubos de 50 ml	Corning	352070	Polipropileno, estéril
70 μ Filtros de células M	Corning	352350
Placas de Petri	Corning	351029	Tubos FACS estéreis
5 ml Corning		352052	Estéril
BD GolgiPlug	BD Biosciences	555029	Contém brefeldina Uma solução
Phorbol 12-Miristato 13-Acetato (PMA)	Sigma-Aldrich	P8139
Sal de Cálcio Ionomicina	Sigma-Aldrich	13909
Saponina da casca de quillaja	Sigma-Aldrich	S4521
LIVE/DEAD Kit de coloração de células mortas Aqua corrigível	Life Technologies	L34957
Anti-Mouse CD45 Alexa Fluor 700	eBioscience	56-0451-82
Anti-Mouse CD4 eFluor 450 eBioscience		48-0042-82
Anti-Mouse TCR beta APC eFluor 780	eBioscience	47-5961-82
Anti-Mouse gamma delta TCR FITC	eBioscience	11-5711-82
Anti-Mouse IL-17A APC	eBioscience	12-7311-82
Anti-Mouse IFN-&gama; PE	eBioscience	11-5931-82
Anti-Mouse NK1.1 PE-Cy7	eBioscience	25-5941-82
Anti-Mouse CD90.2 APC eFluor 780	eBioscience	47-0902-82
Anti-Mouse CD3e FITC	eBioscience	11-0031-82
Anti-Mouse CD19 FITC	eBioscience	11-0193-82
Anti-Mouse CD11b FITC	eBioscience	11-0112-82
Anti-Mouse CD11c FITC	eBioscience	11-0114-82
Anti-Mouse TCR beta FITC	eBioscience	11-5961-82
Anti-Mouse Ly-6G FITC	eBioscience	11-5931-82
Anti-Mouse Ly-6C FITC	BD Pharmingen	553104