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Artigo de método

Ex vivo de imagens ao vivo de pulmão Metástase e seu microambiente

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⸱

DOI:

10.3791/53741

⸱

3 de fevereiro de 2016

 ,  ,  , 
1Department of Anatomy, University of California, 2Hubrecht Institute-Royal Dutch Academy of Science and University Medical Center Utrecht, 3Department of Cell and Developmental Biology, Sackler Faculty of Medicine

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Descreve-se um método relativamente simples para a imagiologia ex vivo, ao vivo das interacções de células de estroma tumoral dentro de metástase pulmonar, utilizando repórteres fluorescentes, em ratinhos. Utilizando microscopia confocal de disco rotativo, esta técnica permite a visualização de células vivas durante pelo menos 4 horas e pode ser adaptado para estudar outras condições inflamatórias do pulmão.

Resumo

A metástase é uma das principais causas de morbidade e mortalidade relacionada ao câncer. A metástase é um processo de várias etapas e, devido à sua complexidade, os processos celulares e moleculares exatos que governam disseminação metastática e crescimento são ainda imperceptíveis. imagens ao vivo permite a visualização das interações dinâmicas e espaciais das células e seu microambiente. Os tumores sólidos geralmente metástases para os pulmões. No entanto, a localização anatômica dos pulmões representa um desafio para imagiologia intravital. Este protocolo fornece um método relativamente simples e rápido para ex vivo imagens ao vivo das interações dinâmicas entre as células tumorais e sua estroma circundante dentro de metástase pulmonar. Usando este método, a motilidade de células cancerosas, bem como as interacções entre as células cancerosas e as células do estroma no seu microambiente podem ser visualizados em tempo real, durante várias horas. Ao utilizar ratinhos transgénicos repórter fluorescentes, uma linha de células fluorescentes, injectável marcado fluorescentementemoléculas e / ou anticorpos, vários componentes do microambiente do pulmão pode ser visualizado, tais como os vasos sanguíneos e células do sistema imunológico. Para imagem os diferentes tipos de células, foi utilizado um disco giratório microscópio confocal que permite imagens contínuo a longo prazo com rápida, de quatro cores de aquisição de imagem. filmes de lapso de tempo compilados a partir de imagens recolhidas ao longo de várias posições e planos focais mostram interações entre metastático ao vivo e células do sistema imunológico durante pelo menos 4 horas. Esta técnica pode ser também utilizada para testar a quimioterapia ou terapia-alvo. Além disso, este método pode ser adaptado para o estudo de outras patologias relacionadas com o pulmonares que podem afectar o microambiente do pulmão.

Introdução

O aspecto mais mortal do câncer é a metástase, que é responsável por mais de 90% da morbidade e mortalidade relacionadas ao câncer1. A metástase é um processo de várias etapas e, devido à sua complexidade, os mecanismos celulares e moleculares exatos que governam a disseminação e o crescimento metastático ainda são indefinidos. Para metastatizar, as células tumorais no tumor primário devem se desprender de suas células vizinhas e da membrana basal, atravessar a matriz extracelular, intravasar, viajar através de vasos sanguíneos ou linfáticos, extravasar no local secundário e, finalmente, sobreviver e estabelecer tumores secundários. Além das propriedades das células tumorais, a contribuição do microambiente, que inclui o estroma adjacente junto com as contrapartes normais das células cancerígenas, é crucial para a semeadura e estabelecimento de lesões metastáticas2.

Os métodos tradicionais para estudar a semeadura e o crescimento metastáticos examinam os estados estáticos, pois os tecidos são excisados e seccionados para histologia. Esses dados geram apenas um instantâneo desse processo altamente dinâmico. Embora algumas informações úteis possam ser obtidas com esses estudos, o complicado processo pelo qual as células tumorais e estromais interagem durante a formação metastática não pode ser avaliado adequadamente por esses métodos. Além disso, não é possível obter informações sobre os padrões de migração de células tumorais ou estromais, que são importantes para estabelecer uma colônia no local distante. Para estudar efetivamente o processo metastático, é essencial visualizar várias interações entre as células cancerígenas e seu microambiente de maneira contínua e em tempo real.

O pulmão é um local comum para metástases de tumores sólidos como câncer de mama, colorretal, pâncreas, melanoma e sarcoma3. A imagem intravital foi usada anteriormente para estudar a interação célula-célula em vários modelos primários de tumores e metastáticos4,5. Métodos de imagem pulmonar em camundongos, incluindo imagens intravitais, imagens de seção pulmonar e um ensaio de metástase pulmonar ex vivo, foram publicados6–9. A imagem intravital dos pulmões de camundongos utiliza uma janela de sucção torácica para estabilizar os pulmões6. Este método é usado para imagens de lapso de tempo da microcirculação pulmonar e espaços alveolares. A localização anatômica dos pulmões representa um desafio para a imagem intravital. Para acessar os pulmões, a cavidade torácica deve ser aberta, o que leva à perda de pressão negativa e ao colapso dos pulmões. Este método permite apenas a visualização de uma pequena parte dos pulmões e é tecnicamente exigente; uma complicação desnecessária em estudos que examinam processos independentes do fluxo sanguíneo. Além disso, esse método também requer o movimento de bloqueio causado pela respiração. Isso é feito por meio da coleta de imagens entre as respirações ou durante as análises pós-aquisição de imagens10. A imagem alternativa de corte pulmonar ex vivo fornece estabilidade e profundidade, além de preparar o parênquima pulmonar para imunomarcação7. No entanto, o longo processo de seccionamento leva a um grande atraso entre o momento do sacrifício do animal e o início da sessão de imagem. Além disso, o processo de secção de um pulmão de camundongo causa uma quantidade considerável de morte celular8, interferindo assim na qualidade e quantidade de amostras de imagem e talvez alterando desnecessariamente as interações tumor-estroma. A fim de tecnicamente fazer a ponte entre os métodos de imagem intravital e imagem de seção pulmonar, explorando as vantagens das duas técnicas, foi desenvolvido um método relativamente rápido e fácil para imagens pulmonares ex vivo. Este método foi obtido por imagem de lobos pulmonares inteiros não seccionados. Usando este método, a motilidade das células cancerígenas, bem como as interações entre as células cancerígenas e as células estromais em seu microambiente, podem ser visualizadas em tempo real por várias horas.

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Protocolo

Todos os procedimentos descritos devem ser realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos para o uso de animais vertebrados, incluindo a aprovação prévia por parte do Care local Institucional Animal e Comitê de Uso (IACUC).

1. Geração de metástases pulmonares por ex vivo Imagens ao vivo (Transgenic ou veia caudal Injection)

NOTA: As metástases pulmonares pode ser gerado através da utilização de modelos de ratinho geneticamente modificadas ou por injecção intravenosa (iv) a injecção de células cancerosas.

  1. Gerar metástases pulmonares para a imagem latente do cruzamento de um modelo de rato tumor geneticamente modificado em um rato repórter transgênicos, por exemplo, atravessar o modelo do rato do cancro da mama, rato antígeno do vírus do tumor mamário terminal longa do meio repeat-polioma T (MMTV-PyMT) 11 em ACTB-ECFP modelo do rato 12.
    NOTA: O modelo ACTB-ECFP expressa reforçada ciano proteína fluorescente (ECFP) sob a β-actno promotor de modo a que todas as células fluoresce na, canal PCP azul. No entanto, as células cancerosas são, de longe, o mais proeminente e aparecem como uma massa de células eCFP-positiva sob o microscópio. O modelo de rato de MMTV-PyMT desenvolve uma doença progressiva, em que o crescimento do tumor mamário está associada com a difusão de células de cancro para a periferia, especialmente para os pulmões. Em ratinhos MMTV-PyMT no FVB / N fundo, micrometástases pode ser observada cerca de 10-11 semanas de idade. Geralmente, estes progressos para macrometástases em cerca de 14 semanas de idade de 13 anos.
    OU
  2. Gerar metástases experimentais utilizando células primárias ou linhas de células singeneicas. Utilização em células de tumor primário in vitro manipulado ou linhas de células (por ex., Transdução), seguido por injecção IV 14.
    1. Resumidamente, neste protocolo, injetar uma proteína verde fluorescente (GFP) -expressing (+) linha de células MMTV-PyMT em ratos fluorescentes Repórter (ACTB-ECFP) ou ratinhos de tipo selvagem. Depois,visualizar essas células referidas como células VO-PyMT 15 usando o verde, canal de GFP.
      NOTA: A linha celular VO-PyMT original foi derivada no Vanderbilt Ortopedia em Nashville, TN. VO significa Vanderbilt Ortopedia.
    2. A seguir à injecção de 10 6 células (em 200 uL), observar o extravasamento de células de cancro imediatamente e até algumas horas após a injecção; observar micrometástases entre 1-3 semanas após a injecção e detectar macrometástases 3 semanas após a injecção 15.
      NOTA: menor número de células pode ser injectado para prolongar o tempo de injecção para o crescimento metastático.

2. Rotulagem de componentes de interesse na metastático Microenvironment (Transgenic e / ou injetáveis)

NOTA: A rotulagem pode ser conseguida por murganhos transgénicos e / ou por vários injectáveis. Certifique-se usar diferentes cores fluorescentes para a rotulagem dos vários tipos de células.

  1. Os componentes Label do microambiente metastático utilizando camundongos transgênicos. Cruzar o modelo de tumor de rato anteriormente mencionado (por exemplo., MMTV-PyMT x ACTB-ECFP) em um modelo de rato transgénico, em que as células estromais de interesse são marcados por uma proteína fluorescente que não é ECFP, por exemplo., C-fms-EGFP 4,16.
    NOTA: Além de visualização de células cancerosas no canal PCP, este permite a visualização de células mielóides no canal de GFP 4.
    E / OU
  2. Rotular vários componentes do microambiente metastático em ratinhos usando injectáveis ​​repórter fluorescente ou transgénicos (não fluorescentes) ratinhos de tipo selvagem.
    NOTA: Vários compostos podem ser injectados para marcar vários componentes do microambiente metastático, por exemplo, um anticorpo conjugado AF647-Gr-1 é aqui utilizada para rotular neutrófilos e alguns monócitos e 13 diferentes dextranos de peso molecular são usadospara rotular capilares pulmonares. Para a preparação desses injetáveis ​​consulte a etapa 4.

3. Preparação de Materiais Antes Dissecação

  1. 2% de agarose
    1. Pesar 0,2 g de agarose e adicionar 10 ml de 1 x PBS. Aquece-se a solução para dissolver a agarose. Agarose irá solidificar à TA, assim mantê-lo em um banho de água a 37 ° C até ser utilizado para a inflação.
  2. CO 2 e controlador de temperatura
    1. Verifique DDH 2 O na câmara de umidificação. Reabastecer quando necessário. Inserir a placa de configuração no suporte da placa de estágio de temperatura (câmara climática). Ligue o controlador de CO 2 e definir de CO 2 a 5%. Certifique-se a taxa de fluxo de ar é fixada em 0,4 Nl / min.
    2. Abra o ar e o CO 2 válvulas. Ligue o controlador de temperatura. Certifique-se de que a temperatura da câmara climática e a tampa são definidas a 37 ° C.
    3. Liberar a pressão do ar no CO 2 metros. Entrada de CO 2 a aumentar, equilibration pode levar até 30 min.
  3. disco giratório microscópio confocal
    NOTA: Os detalhes do microscópio set-up foram previamente descritos 4,17.
    1. Ligue os lasers (o laser de argônio para 488 nm de excitação e de estado sólido 405 nm, 561 nm e 640 nm lasers). Ligue o microscópio, a câmera, a unidade de controle disco giratório, o AOTF, a unidade de controle do laser e o controlador da câmara.
    2. Abra o obturador microscópio, ligue o computador a executar o microscópio e abrir o software.
  4. Preparação das ferramentas e plataforma de dissecção.
    1. Ligue o esterilizador talão quente e deixá-la atingir 250 ° C. Limpos 2 pares de tesouras cirúrgicas e pinças com água e sabão. Esterilizar as ferramentas durante pelo menos 30 seg. Deixe as ferramentas refrescar. Utilize uma tampa de poliestireno como plataforma de dissecção. Cubra-o com um pedaço de imersão laboratório.

4. Preparação de injecções

NOTA: Dependendo da meia-vida ea resposta preferida, injetar fluorescente etiquetado anticorpos e / ou moléculas fluorescentes ou imediatamente antes do sacrifício animal ou um par de horas a dias antes.

  1. Para neutrófilos imagem Gr1-positivos e monócitos, preparar uma seringa com 7 ul de anticorpo conjugado com AF647-Gr-1 da (1 mg / ml) em 100 ul de PBS estéril sob o capô. Coloque um G ½ agulha 27 na seringa.
  2. Para capilares pulmonares imagem, preparar uma segunda e terceira seringa com 100 ul de quer 70 kD rodamina conjugada com dextrano (4 mg / ml) ou dextrano 10 kD AF647-conjugado (4 mg / ml). Coloque um G ½ agulha 27 nas seringas.
  3. Injectar a AF647 conjugado com solução de anticorpo iv 5 horas antes da excisão 'pulmões.
  4. Injectar uma ou ambas as soluções de dextrano iv imediatamente anteriores à excisão 'pulmões.

5. Preparação de Pulmões por ex vivo Imagens ao vivo

NOTA: Tente trabalhar como estéril e cuidadosa quanto possível para evitar a desnecessária desafios de células imunes dentro dos pulmões.

  1. Injectar o rato por via intraperitoneal (ip) com uma sobredosagem letal de um anestésico permitida pelo protocolo animais aprovados pelo IACUC, por exemplo., 1 ml de Avertin 2,5%. Aguarde até que o mouse para parar de respirar e ser completamente não-responsivos a estímulos nocivos (pata traseira pitada).
    NOTA: deslocamento cervical e os eutanásia dióxido de carbono deve ser evitado, pois pode afectar negativamente a viabilidade das células do pulmão.
  2. Imobilizar o rato em uma placa de dissecção e esterilizar o mouse com 70% de etanol.
  3. Use tesouras cirúrgicas primeiro fazer uma incisão epigástrica transversal através da pele, seguido por uma incisão semelhante através do peritoneu. Segure a placa de dissecção na posição vertical e cortou a aorta descendente, de modo que as piscinas de sangue para baixo no abdômen e não na cavidade torácica.
  4. Sbeliscar uma pequena abertura no diafragma para libertar vácuo. Corte ao longo da nervura 10 e 12 para excisar o diafragma e tenha acesso visual para os pulmões.
  5. Use uma tesoura cirúrgica para cortar a pele até à traqueia através da caixa torácica, mas deixar a caixa torácica intacta. Separar a pele da caixa torácica. Expor a traqueia através da remoção do tecido conjuntivo circundante, tomando cuidado para não danificar o próprio (Figura 1A) traqueia.
  6. Cortar uma pequena abertura aproximadamente 1 mm de diâmetro na traqueia exposta paralela aos anéis cartilaginosos, tão perto quanto possível da laringe (Figura 1B). Tenha cuidado para não cortar completamente através da traquéia.
  7. Dê uma agulha G 20 e gentilmente inserir a agulha 4-5 mm na traqueia, sem qualquer força contrária (Figura 1D). A extremidade da agulha deverá ser visível através da traqueia (Figura 1C). Use uma pinça para estabilizar a agulha na traqueia. Alternativamente, um fio de sutura pode ser amarrado Around a traqueia para manter a agulha no lugar.
    NOTA: Através da inserção muito profunda, a carena pode ser traumatizada ou apenas um lado dos pulmões pode ser insuflado.
  8. Encher uma seringa com 400 ul de 37 ° C de agarose de ponto de fusão de baixa temperatura a 2% (feita directamente a partir de um banho de temperatura constante). Verifique se a placa de dissecção está de pé e, lentamente, incutir a agarose quente através da agulha para os pulmões, usar ~ 400 ul para inflar os pulmões.
    NOTA: Assista os pulmões inflar dentro da caixa torácica. Não excesso de inflar o pulmão como ele irá se romper.
  9. Uma vez que os pulmões são inflados, enchendo ~ ⅔ da caixa torácica, retire a seringa e manter a agulha no interior da traqueia para evitar qualquer agarose vazem.
  10. Pour aproximadamente 50 ml de PBS 20 ° C ao longo dos pulmões inflados para permitir que a agarose dentro dos pulmões para definir e solidificar. retirar a agulha devagar e fechar a traqueia com uma pinça para evitar qualquer não-solidificou agarose vazem.
  11. Expor os pulmões através da realização de uma esternotomia e subsequentemente excisar os pulmões. Para a excisão dos pulmões, segurar a traqueia, enquanto cortando a traqueia completamente. Puxe cuidadosamente a traqueia para cima, cortar o tecido conjuntivo e do esôfago enquanto puxa os pulmões para fora da cavidade torácica, até os pulmões é separado do rato (Figura 1E).
  12. Mergulhe os pulmões em warm RPMI-1640 para lavar excessiva de sangue e delicadamente separar os lóbulos usando tesouras e pinças para cortar brônquio principal dos lobos na hilo (Figura 1F).
  13. Colocar os lóbulos, com a superfície plana virada para baixo para maximizar a superfície de imagem, em um poço de uma placa de imagem de 24 poços (Figura 1G). Adicionar 100 ul de 37 ° C, meio RPMI-1640 por cima dos lóbulos. Coloque várias 15 mm tampa desliza microscópio circular em cima dos lóbulos para evitar que ele flutua.
  14. Despeje quente PBS nos poços ao redor para evitar a mídia RPMI-1640 de evaporating. Inserir a placa de 24 poços na câmara climatizada equilibrada e manter os lobos pulmonares a 37 ° C com ar e 5% de CO 2. Inserir a câmara climatizada na fase do microscópio confocal.
    NOTA: Outras misturas de gases (por exemplo, 5% de O2, 5% de CO 2 em N 2 para examinar o comportamento das células sob condições de hipoxia / oxigénio inferior) também poderia ser considerado.

figure-protocol-1
Figura 1. Protocolo para a preparação dos pulmões para geração de imagens ao vivo. (A) A exposição da traquéia após a preparação do mouse. (B) pinas pequena feita na traqueia exposta paralela aos anéis cartilagíneos. (C) 20 G agulha inserida 4-5 mm na traqueia. (D) A instilação de 400 ul de 2% de baixo ponto de fusão à temperatura de agarose para os pulmões. (E) Inflpulmões ated separado do mouse. (F) Lobes separados após a inflação. (G) lóbulos colocado em um poço de uma placa de imagem de 24 poços. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

6. Aquisição e Análise de Imagens

NOTA: As imagens podem ser adquiridas com uma variedade de fiação de disco microscópios confocal apoiados por vários programas de software. Neste protocolo, quer μManager com um giro de disco microscópio confocal feito por encomenda ou Zen com um disco giratório microscópio confocal comercialmente disponível é utilizada para a aquisição de imagem, enquanto Imaris é usado para edição de filmes e análise.

  1. Adquirir imagens usando μManager. Um detalhado passo a passo protocolo para a aquisição de imagens usando software μManager é descrito anteriormente 18.
    OU
  2. adquirir imagensusando a imagem de software de análise, tais como Zen (ver figura S1).
    1. Clique na guia 'Localizar', e escolha objetiva (10x ou 20x) no "Caminho de Luz" ferramenta (Figura S1A, caixa vermelha). Posteriormente, clique em 'Eyes - DAPI' olhar para o canal PCP através da ocular (Figura S1A, caixa azul). Localize a amostra manualmente usando o microscópio. Clique em 'All Off'after o tecido é o centro do campo de visão.
    2. Clique na guia "Aquisição" para definir todos os parâmetros para aquisição de imagem.
    3. Na ferramenta "canais", clique no botão '+' (Figura S1B, caixa vermelha). Um menu pop-up aparece e procurar o corante (s) presente na amostra no 'Dye banco de dados' (Figura S1B). Selecione o corante e clique em "Adicionar".
      NOTA: O programa irá definir todos os filtros de ser otimizado. Um corante pode ser suprimidoselecionando-o seguido, clicando no botão da lixeira (Figura S1B, caixa amarela).
    4. No menu "Modo de Aquisição", set 'Binning' para 5x5. Clique duas vezes no ECFP no menu de canais para a seleccionar. Diminuir a potência do laser para 20% assim que a amostra não será branqueada ao configurar os parâmetros para aquisição de imagem.
    5. Marque a caixa "Azulejo 'na seção' Experiment Manager 'e a ferramenta de telhas aparece no grupo de ferramentas" Multidimensional Aquisição "(Figura S1C). Clique no botão 'Configuração Avançada' para ver a imagem ao vivo da câmera. Clique no botão "Adicionar" na seção "Posições" para adicionar 4 a 6 posições para o experimento. Para excluir uma posição, selecione a posição e clique no botão de lixeira.
    6. No grupo de ferramenta "Aquisição Parâmetro ', abra a ferramenta' estratégia de foco ', e selecione' Absolute fixa Z-position 'na lista suspensa.
    7. Marque a caixa Z-Stack na seção 'Experiment Manager' ea ferramenta Z-Stack aparece no grupo de ferramentas a «Aquisição Multidimensional '(Figura S1D). Clique duas vezes em uma das posições na secção "Posições" e pressione 'Live'. definir manualmente primeiro e definir última posição do campo de imagem. Defina o intervalo para 4 mm.
      NOTA: O programa irá determinar o número de fatias para a gama escolhida e do intervalo. Idealmente, 5-7 fatias são convenientes para permitir a visualização suficiente e aquisição de imagem rápida.
    8. Marque a caixa "Série Time 'na seção' Experiment Manager '. Set desejado 'Duração' e os tempos de "intervalo" na ferramenta 'Time Series ", que apareceu no grupo de ferramentas' Multidimensional Aquisição" (Figura S1E).
    9. No 'AcquisiModo ção 'de menu, defina "Binning' para 2x2. Dê um clique duplo em um fluoróforo no menu de canais para selecioná-lo e aumentar a potência do laser a 100%. Pressione 'Live' e ajuste o 'Tempo de Exposição ". Repita esse procedimento para cada fluoróforo.
    10. Marque a caixa "Ativar Auto Save". Selecione uma pasta e digite o nome do arquivo. Todas as imagens adquiridas serão salvas automaticamente nesta pasta.
    11. Clique em 'Start Experiment' na seção 'Experiment Manager' para começar a aquisição de imagem.
  3. Após a aquisição da imagem, compilar os dados brutos em software Imaris. Converter imagens para .IMS arquivos e ajustes podem ser feitos. Um detalhado passo a passo protocolo para a conversão de arquivos, fazendo ajustes e filmes salvar usando Imaris é descrito anteriormente 18.
  4. Ao salvar o filme, defina o "Frame Rate" 5 quadros por segundo (fps).

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Resultados

Utilizando microscopia confocal de disco rotativo, vários sistemas modelo rato e injectáveis, o microambiente metastático pode ser visualizado e rastreada ao longo do tempo. Usando um MMTV-PyMT; ACTB-ECFP; modelo de ratinho transgénico triplo EGFP c-fms, diferentes componentes celulares são marcado de forma fluorescente (Figura 2A, um filme). A estrutura típica do parênquima pulmonar pode ser visualizado no canal PCP uma vez que todas as células expressam ECFP sob o pr...

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Discussão

Este manuscrito descreve um método detalhado para ex vivo imagens ao vivo da metástase pulmonar em modelos de ratos com metástases. Este protocolo de imagem fornece uma visualização direta das interações tumor de células-estroma dinâmicas e espaciais dentro do microambiente do pulmão. É um método relativamente fácil e rápido que permite imagens de confiança de metástases do pulmão durante pelo menos 4 h. Filmes adquiridos a partir destas experiências pode ser utilizada para controlar processos dinâmicos como a ...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar. Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com os protocolos aprovados pela IACUC, UCSF.

Agradecimentos

Agradecemos a Nguyen H. Nguyen por sua ajuda técnica e a Audrey O'Neill pelo suporte com o microscópio confocal de disco giratório Zeiss Cell Observer. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de pós-doutorado do Departamento de Defesa (W81XWH-11-01-0139) e pelo Programa Nacional de Prêmio de Pós-Doutorado do Instituto Weizmann de Ciência para o Avanço das Mulheres na Ciência (para VP).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Camundongos MMTV-PyMT/FVBJackson Laboratory2374Camundongos fêmeas
Camundongos ACTB-ECFP/FVB LaboratórioUCSF WerbCamundongos fêmeas Camundongos
c-fms-EGFP/FVB LaboratórioCamundongos fêmeas
Camundongos FVB LaboratórioJackson1800Camundongos fêmeas
Células GFP+ VO-PyMT Laboratório
70.000 kDa Dextran,InvitrogenD1818Diluir para  4mg/ml em 1 x PBS e armazenar a -20   C. Use 0,4 mg por animal. 
10.000 kDa Dextran, Alexa Fluor 647 conjugadoInvitrogenD22914Diluir para  4mg/ml em 1 x PBS e armazenar a -20   C. Use 0,4 mg por animal. 
Anticorpo anti-rato Gr-1 Alexa Fluor 647UCSF NúcleoEstoque 1mg / ml. Use 7 ug por animal.
Anestesia anestésicaaprovada pela IACUC, usada para anestesia e/ou eutanesia
1X PBSInstalação
PBS, USP estéril Amresco INCK813-500MLGrau ultra puro para injeção intravenosa
PlataformaSerá usado como placa de dissecação
Tesoura fina afiada Pinça Fine ScienceTools 14060-11
RobozSurgical StoreRS-5135
Esterilizador de esferas quentesFerramentas Fine Science18000-45Ligue 30min antes de usar
AirUCSF
OxigênioUCSF
Dióxido de CarbonoUCSF
Seringa de 1 mL sem agulha BD309659
27 G x 1/2 agulha   BD305109para injeção intravenosa
20 G x 1 agulha, bisel curto   BD305178
Agarose de baixa temperatura de fusão Lonza50111Para fazer 10 ml de solução, pesar 0,2 g de agarose, adicionar a 10 ml 1 x PBS e aquecer para dissolver. A agarose solidificará à temperatura ambiente, portanto, mantenha em uma temperatura de 37 &graus; C banho-maria até ser usado para inflação.
Meio RPMI-1640 sem vermelho de fenolLife Technologies11835-030
Placa de imagem de 24 poços E & K scientificEK-42892
Corrediças de cobertura de vidro, 15 mm Fisher Scientific22-031-144
Controlador digital de CO2 e temperaturaOkolabDGTCO2BXhttp://www.oko-lab.com
Câmara climáticaOkolabhttp://www.oko-lab.com
Cell Observer microscópio confocal de disco giratórioZeiss
Zen softwareZeiss
MicroscópioinvertidoCarl Zeiss IncZeiss Axiovert 200M
Câmera ICCDStanford PhotonicsXR-Mega-10EX S-30
Cabeçote de varredura confocal de disco giratórioYokogawa CorporationCSU-10b
ImarisBitplane
mManagerVale lab, UCSFSoftware de código aberto
UCSF Werb UCSF Werb conjugado com rodamina de anticorpo monoclonal de cultura de células UCSF de isopor

Referências

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  3. Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
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