Imunocoloração fosfo-epitopos em ciliadas Órgãos da Whole Mount embriões Zebrafish

Resumo

Técnicas são descritas a imunocoloração fosfo-epitopos em embriões de peixe-zebra inteiros e em seguida, realizar duas cores localização confocal fluorescente em estruturas celulares tão pequenos quanto cílios. As técnicas de fixação e de imagem pode definir a localização e cinética da aparência ou a activação de proteínas específicas.

Resumo

A rápida proliferação das células, a expressão específica de tecido dos genes e o surgimento de redes de sinalização caracterizar o desenvolvimento embrionário no início de todos os vertebrados. A cinética e localização de sinais - mesmo dentro de uma única célula - no embrião em desenvolvimento complementa a identificação de genes de desenvolvimento importantes. técnicas de imunocoloração são descritas que têm sido mostrados para definir a cinética de sinais intracelulares e animais inteiros em estruturas tão pequenas quanto cílios. As técnicas para imagens de fixação, de imagem e de processamento usando um laser de varredura composto microscópio confocal pode ser concluído em apenas 36 horas.

Peixe-zebra (Danio rerio) é um organismo desejável para os investigadores que buscam realizar estudos com uma espécie de vertebrados que é acessível e relevante para a doença humana. nocautes genéticos ou knockdowns deve ser confirmada pela perda do produto de proteína real. Essa confirmação da perda de proteínapode ser conseguido usando as técnicas descritas aqui. Pistas sobre as vias de sinalização também pode ser decifrada por utilização de anticorpos que são reactivos com as proteínas que foram modificadas pós-translacionalmente pela fosforilação. Preservar e otimizar o estado fosforilada de um epitopo é, portanto, fundamental para esta determinação e é realizado por este protocolo.

Este estudo descreve técnicas para fixar o primeiro embriões durante 72 h de desenvolvimento e de co-localizar uma variedade de epitopos relevantes com ciliares de vesículas de Kupffer (KV), o rim e o ouvido interno. Estas técnicas são simples, não exigem dissecção e pode ser completada num período relativamente curto de tempo. Projectar pilhas de imagens confocal em uma única imagem é um meio útil de apresentar estes dados.

Introdução

As técnicas descritas aqui são o resultado de estudos que buscaram definir alvos a jusante dos sinais de Ca²⁺ durante eventos que ocorrem durante o desenvolvimento inicial, incluindo fertilização, gastrulação, somitogênese e formação de tronco, olhos, cérebro e órgãos. ^1-3 As descobertas originais da sinalização embrionária de Ca²⁺ dependiam do uso de indicadores naturais e projetados de Ca²⁺, como aequorin⁴ e fura-2. ⁵ Mesmo com a tecnologia atual, a detecção de elevações transitórias de Ca²⁺ requer ferramentas analíticas complicadas e não revela os alvos de tais sinais de Ca²⁺. <....

Protocolo

Os procedimentos de peixe-zebra neste protocolo ter sido aprovado pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Virginia Commonwealth University.

1. Preparação dos Reagentes

1. 4% PFA / PBS. Pesar 8 g de paraformaldeído (PFA), na hotte. Enquanto ainda no exaustor de fumos, dissolve-se o PFA seco em ~ 80 _mL de H2O destilada com agitação e aquecimento para 50 ° C. Enquanto se agita, adicionar 3 - 10 gotas de NaOH 1N fresco até que esteja completamente dissolvido PFA e solução fique límpida. Retire do fogo e adicione 100 ml 2x tampão fosfato salino (PBS). Levar o volume a 200 ml com _H2O destilada A....

Resultados

Condições ideais para a visualização de fosfo-epítopos

Métodos que descrevem a imunolocalização de epitopos da proteína em embriões de peixe-zebra foram relativamente escassas em comparação com aqueles para a localização de ARNm através de hibridação in situ. Os fixadores usados ​​na localização de epítopos de proteínas em células ciliadas de embriões de peixe-zebra incluíram 4% PFA / PBS e fixador de.......

Discussão

O método / metanol PFA foi desenvolvido neste laboratório com o objetivo principal de otimizar a imunolocalização do fosfo-T ²⁸⁷ -CaMK-II epitopo durante o desenvolvimento do peixe-zebra. Este método localizada com êxito P-CaMK-II durante a formação de vários órgãos, incluindo o ciliadas KV peixe-zebra, ¹² ouvido interno ¹⁴ e do rim. ¹³ em particular na fase KV, esta técnica foi necessário. O sucesso deste método é provavelmente devido a uma combinação de a) minimização da aut.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1-fenil-2-tioureia (PTU)	Sigma	P-7629	0,12% Solução estoque. Diluir 1:40 em água do sistema
Alexa488 anti-mouse IgG	Life Technologies	A11001	Cabra policlonal, use a 1:500
Alexa488 anti-coelho IgG	Life Technologies	A11008	Cabra policlonal, use a 1:500
Alexa488 faloidina	Life Technologies	A12379	Liga-se preferencialmente à F-actina
Alexa568 anti-mouse IgG	Life Technologies	A11004	Cabra policlonal, use a 1:500
Alexa568 anti-coelho IgG	Life Technologies	A11011	Cabra policlonal, use a 1:500
anti-acetilada α-tubulina	Sigma	T7451	Camundongo monoclonal, use a 1:500
anti-fosfo-T287 CaMK-II	EMD Millipore	06-881	Coelho policlonal, use a 1:20
anti-total CaMK-II	BD Biosciences	611292	Monoclonal de camundongo, use a 1:20
Etanol	Fisher	S96857	Grau de laboratório, 95% desnaturado
Fórceps	Fine Science Tools	11252-20	Dumont #5
Lâminas de vidro	VWR	16004-330	#1  espessura
Lâminas de microscópio de vidro	Fisher	12-550-15	Lâminas de vidro padrão
Metanol	Fisher	A411	Armazenar no congelador
Tubos de microcentrífuga	VWR	20170-038	tubos tampados, não estéreis
Soro de cabra normal	Life Technologies	16210-064	Alíquota Tubos de 1 ml, armazenar no congelador
Paraformaldeído	Sigma	P-6148	Grau de reagente,
salina tamponada com fosfato cristalino (PBS)	Qualidade Biológica	119-069-131	10x solução de estoque ou feita em laboratório
Triton X-100	Sigma	BP-151	Solução de 10% em água, armazene em RT
Tween-20	Life Technologies	85113	Solução de 10% em água, armazene em RT
Microscópio composto	Nikon	E-600	Monte em mesa sem vibração
C1 Plus confocal de varredura a laser de dois	Nikon	C1 Plus	Executado pelo programa EZ-C1, mas as atualizações usam " Elementos"

solução lasers