Imunocoloração fosfo-epitopos em ciliadas Órgãos da Whole Mount embriões Zebrafish

Resumo

Técnicas são descritas a imunocoloração fosfo-epitopos em embriões de peixe-zebra inteiros e em seguida, realizar duas cores localização confocal fluorescente em estruturas celulares tão pequenos quanto cílios. As técnicas de fixação e de imagem pode definir a localização e cinética da aparência ou a activação de proteínas específicas.

Resumo

A rápida proliferação das células, a expressão específica de tecido dos genes e o surgimento de redes de sinalização caracterizar o desenvolvimento embrionário no início de todos os vertebrados. A cinética e localização de sinais - mesmo dentro de uma única célula - no embrião em desenvolvimento complementa a identificação de genes de desenvolvimento importantes. técnicas de imunocoloração são descritas que têm sido mostrados para definir a cinética de sinais intracelulares e animais inteiros em estruturas tão pequenas quanto cílios. As técnicas para imagens de fixação, de imagem e de processamento usando um laser de varredura composto microscópio confocal pode ser concluído em apenas 36 horas.

Peixe-zebra (Danio rerio) é um organismo desejável para os investigadores que buscam realizar estudos com uma espécie de vertebrados que é acessível e relevante para a doença humana. nocautes genéticos ou knockdowns deve ser confirmada pela perda do produto de proteína real. Essa confirmação da perda de proteínapode ser conseguido usando as técnicas descritas aqui. Pistas sobre as vias de sinalização também pode ser decifrada por utilização de anticorpos que são reactivos com as proteínas que foram modificadas pós-translacionalmente pela fosforilação. Preservar e otimizar o estado fosforilada de um epitopo é, portanto, fundamental para esta determinação e é realizado por este protocolo.

Este estudo descreve técnicas para fixar o primeiro embriões durante 72 h de desenvolvimento e de co-localizar uma variedade de epitopos relevantes com ciliares de vesículas de Kupffer (KV), o rim e o ouvido interno. Estas técnicas são simples, não exigem dissecção e pode ser completada num período relativamente curto de tempo. Projectar pilhas de imagens confocal em uma única imagem é um meio útil de apresentar estes dados.

Introdução

As técnicas descritas aqui são o resultado de estudos que buscaram definir alvos a jusante dos sinais de Ca²⁺ durante eventos que ocorrem durante o desenvolvimento inicial, incluindo fertilização, gastrulação, somitogênese e formação de tronco, olhos, cérebro e órgãos. ^1-3 As descobertas originais da sinalização embrionária de Ca²⁺ dependiam do uso de indicadores naturais e projetados de Ca²⁺, como aequorin⁴ e fura-2. ⁵ Mesmo com a tecnologia atual, a detecção de elevações transitórias de Ca²⁺ requer ferramentas analíticas complicadas e não revela os alvos de tais sinais de Ca²⁺.

Este laboratório investiga sinais de Ca²⁺ que atuam através da proteína quinase dependente de Ca²⁺/calmodulina (multifuncional) conhecida como CaMK-II, uma enzima que é enriquecida no sistema nervoso central e originalmente identificada como um regulador da potenciação de longo prazo. ⁶ O CaMK-II não é específico do cérebro, é amplamente expresso e altamente conservado ao longo de toda a vida e corpos de espécies em todo o reino animal, incluindo invertebrados. ^7,8 CaMK-II tem a capacidade única de sustentar sua própria atividade mesmo após os níveis de Ca²⁺ terem diminuído devido à sua capacidade de autofosforilar em Thr²⁸⁷. Nesse estado autofosforilado, o CaMK-II permanece ativo de maneira independente de Ca²⁺/CaM, até ser desfosforilado. ⁶ Assim, a localização de CaMK-II fosforilado (Thr²⁸⁷) pode identificar células nas quais ocorreram elevações naturais e relevantes de Ca²⁺.

Um anticorpo contra o CaMK-II de mamíferos autofosforilados (P-Thr²⁸⁷) foi bem caracterizado e foi inicialmente usado para localizar o CaMK-II ativado no tecido cerebral. ⁹ O peixe-zebra (Danio rerio) possui sete genes CaMK-II^10,11 cujos produtos proteicos contêm uma sequência de MHRQE[pT²⁸⁷]VECLK nesta região. ^10,11 Esta sequência é muito semelhante ao antígeno fosfopeptídico usado para criar este anticorpo policlonal de coelho (MHRQE[pT]VDCLK; Upstate/Millipore) e, portanto, não foi uma surpresa completa que esse anticorpo tenha reagido de forma cruzada com o peixe-zebra CaMK-II. Este laboratório mostrou que este anticorpo reage com o peixe-zebra CaMK-II em proporção à autofosforilação e atividade independente de Ca²⁺/CaM. ¹² Anticorpos adicionais de CaMK-II pan-específicos também demonstraram reação cruzada com CaMK-II de peixe-zebra. ¹³

Este anticorpo tem sido usado para demonstrar que o CaMK-II do peixe-zebra é preferencialmente ativado em células de um lado da vesícula de Kupffer (KV) do peixe-zebra, o órgão ciliado necessário para o estabelecimento da assimetria esquerda/direita. ¹² Este anticorpo foi usado para demonstrar que o CaMK-II é ativado transitoriamente em quatro células adjacentes no lado esquerdo do KV durante a mesma fase de desenvolvimento em que o posicionamento do órgão é determinado. ¹² Além da Vesícula de Kupffer (KV), a autofosforilada (P-T²⁸⁷) também estava localizada em locais intracelulares específicos em outros tecidos ciliados, incluindo rim, neuromastos e ouvido interno. ^12,13 No rim do peixe-zebra, o P-T^287-CaMK-II é enriquecido ao longo da borda apical das células ductais ciliadas e dentro dos cílios cloacaiais, onde influencia sua montagem. ¹³ Finalmente, no ouvido interno em desenvolvimento, o PT^287-CaMK-II está intensamente concentrado na base dos cílios e influencia a diferenciação celular através da via de sinal Delta-Notch. ¹⁴ Em resumo, a detecção de CaMK-II ativado identificou locais de liberação intracelular de Ca²⁺ e iluminou novas vias de sinalização potenciais.

Essas descobertas foram completamente dependentes do desenvolvimento de um método sensível e preciso para localizar CaMK-II ativado (P-T 287-autofosforilado). Os métodos para fixar e imunocorar o peixe-zebra KV, rim e ouvido interno são descritos. As limitações dessa técnica também são descritas. Essas técnicas devem ser úteis para qualquer investigador que busque obter imagens de alta resolução em dois canais fluorescentes não apenas de fosfo-epítopos, mas de qualquer epítopo, durante o desenvolvimento inicial de vertebrados.

Protocolo

Os procedimentos de peixe-zebra neste protocolo ter sido aprovado pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Virginia Commonwealth University.

1. Preparação dos Reagentes

1. 4% PFA / PBS. Pesar 8 g de paraformaldeído (PFA), na hotte. Enquanto ainda no exaustor de fumos, dissolve-se o PFA seco em ~ 80 _mL de H2O destilada com agitação e aquecimento para 50 ° C. Enquanto se agita, adicionar 3 - 10 gotas de NaOH 1N fresco até que esteja completamente dissolvido PFA e solução fique límpida. Retire do fogo e adicione 100 ml 2x tampão fosfato salino (PBS). Levar o volume a 200 ml com _H2O destilada Arrefecer até à TA e confirmar pH de 7,4 antes da utilização. Guardar no escuro a 4 ° C, mas usar dentro de uma semana.
2. Usar 100% de metanol sem quaisquer suplementos. Use etanol a 95%, sem quaisquer suplementos.
3. Prepare com fosfato Tween (PBT). Suplemento de solução salina tamponada com fosfato (PBS) com 0,1% de Tween-20. Adicionar 0.5 ml de uma solução de Tween-20 da 20% a 100 ml de 1x PBS. Armazenar à temperatura ambiente.
4. Prepara-fosfato tamponada de Triton-X (PbTx). Suplemento de PBS com 0,1% de Triton X-100. Adicionar 0,5 ml de Triton um estoque 20% X-100 a 100 ml de PBS. Armazenar à temperatura ambiente.
5. Preparar 10% NGS / PbTx. blocos normais de soro de cabra (NGS) Os locais de ligação não específicos. NGS armazenar em alíquotas a -20 ° C. Para usar, adicionar 1 ml de 9 ml PbTx.
6. Preparar 50% de glicerol / PBS. Misturar completamente partes iguais de 2x PBS e 100% de glicerol. Armazenar à temperatura ambiente.

Fixação 2. Embrião

1. . (. Por exemplo, β-actina: CAAX-GFP) Breeding Obter tipo selvagem (AB e WIK) ou transgênico embriões através de acasalamentos naturais. Se desejado, injectar embriões com construções ou morfolinos, como descrito ^15,16.
2. Elevar embriões. Recolhe embriões e incuba-se a 28,5 ° C, na presença de 0,003% de 1-fenil-2-tioureia (PTU) para bloquear a pigmentação, como descrito. ¹⁷ p>
3. Fix. Quando os embriões atingiram o estágio de desenvolvimento ^desejado, 18,   anestesiar os embriões utilizando MESAB, remover tanta água quanto possível do sistema e adicionar fresco PFA a 4% / PBS durante 3-4 horas à temperatura ambiente. NOTA: Às vezes com menos de 20 horas após a fertilização (hpf), corrigir antes dechorionation. Às vezes após 20 hpf, dechorionate antes de fixação com dois pares de pinças de ponta fina sob um microscópio de dissecação.
4. Mudando soluções. Transferência de embriões utilizando uma ampla pipeta furo, como descrito. ¹⁷ soluções para a mudança em 1,5 ml tapados microtubos, simplesmente permitindo embriões para resolver pela força da gravidade, sem centrifugação.
5. Pós-fixador Após 3 -. 4 horas, remova PFA / PBS, substitua com 100% de metanol e armazenar a -20 ° C durante pelo menos 48 horas. NOTA: Para máxima imunorreactividade de P-CaMK-II, limitar o tempo de armazenamento total de metanol a uma semana.

"> 3. Imunomarcação Whole Embriões

1. Coloque um mínimo de 10 embriões para cada condição experimental em tubo de microcentrífuga de 1,5 ml tampado, e rotulá-los.
2. Permitir que os embriões para resolver. Remover e descartar o metanol e re-hidratados com lavagens progressivas contendo 0,5 ml de concentrações decrescentes de etanol, tal como indicado no passo seguinte. Cada etapa é uma lavagem de 5 minutos com balanço.
3. Progressivamente hidratar com estes 5 Soluções: 66% de etanol / 33% PbTx, 33% de etanol / 66% PbTx, 100% PbTx, 100% PbTx (esta é a primeira repetição de PbTx), 100% PbTx (esta é a segunda repetição PbTx).
4. Remover última lavagem PbTx. Adicionar 0,5 ml de 10% NGS / PbTx. Incuba-se durante pelo menos 1 h à temperatura ambiente com agitação suave e em seguida, remover e descartar solução.
5. Preparar a solução de anticorpo primário por diluição em 10% NGS / PbTx. Se co-imunocoloração, utilize o anticorpo maior afinidade em primeiro lugar. Para este estudo, incubar com o anticorpo monoclonal de ratinho anti tubulina-acetilado diluído a 1: 500. para example, se existem 10 amostras, combinam 6 ul de solução de anticorpo com 3 ml de estoque de 10% NGS / PbTx e, em seguida, distribuem 0,3 mL desta a cada tubo.
6. Adicionar 0,2 - 0,5 ml do anticorpo primário diluído a cada tubo de mergulhar todos os embriões. Incube com agitação suave O / N à temperatura ambiente.
7. Na parte da manhã, remova e elimine a solução de anticorpo. Adicionar 0,5 ml de 2% NGS / PbTx para lavar anticorpo primário em excesso. Agite delicadamente por 5 min. Remover e solução descartar. Repita duas vezes.
8. Dim luzes do tecto e dilui-se o anticorpo secundário fluorescente apropriado conjugado em 10% NGS / PbTx de modo que cada condição contém, pelo menos, 0,5 ml. Com o anticorpo primário tubulina de ratinho anti-acetilado, utilizar a IgG anti-ratinho de cabra corante fluorescente verde a uma diluição de 1: 500.
9. Incubar anticorpo secundário durante 4 h, com agitação suave à TA no escuro. A partir de agora, o processo as amostras sob luzes se apagaram e incubar em um recipiente escuro ou por envolvimento em folha de alumínio.
10. No final da incubação, remover e descartar a solução de anticorpo secundário. Adicionar 0,5 ml de 2% NGS / PbTx para lavar. Agite delicadamente por 5 min. Remover e solução descartar. Repita duas vezes.
11. Se for co-imunocoloração, obter o segundo anticorpo primário a partir de uma espécie diferente do que o primeiro anticorpo primário. Nestes estudos, a seguir o anticorpo de coelho anti-fosfo-CaMK II pelo anticorpo secundário IgG conjugado com corante de cabra anti-coelho-vermelho fluorescente.
12. Dilui-se anticorpo de coelho anti-fosfo-II CaMK anticorpo 01:20. Para cada tubo de embriões, suspensão em 0,3 ml de 10% NGS / PbTx, em seguida, adicionar 15 ul de solução de anticorpo estoque.
13. Certifique-se de que os embriões são imersos e luzes se apagarem. Incube com agitação suave O / N à temperatura ambiente no escuro.
14. Na parte da manhã sob as luzes ofuscantes, remova e elimine a solução de anticorpo. Adicionar 0,5 ml de 2% NGS / PbTx. Agite delicadamente por 5 min. Remover e solução descartar. Repita duas vezes.
15. Mantenha luzes do teto dim e diluir o suficiente da fluorescência-conju apropriadaanticorpo secundário fechado de modo a que cada condição contém, pelo menos, 0,5 ml. Neste estudo, diluir o corante de cabra conjugado com anticorpo anti-coelho-vermelho fluorescente IgG secundário (canal vermelho) 1: 500 em 10% NGS / PbTx.
16. Incubar segundo anticorpo secundário durante 4 horas com agitação suave à TA no escuro.
17. No final desta incubação e sob luz fraca, remover e descartar a solução de anticorpo secundário. Adicionar 0,5 ml de PbTx. Agite delicadamente por 5 min. Remover e solução descartar. Repita duas vezes. Armazenar em qualquer PbTx ou 50% de glicerol / PBS, dependendo do procedimento de imagiologia.

4. confocal Imaging and Processing

1. Mount embriões para a imagem latente. Coloque 1 - 5 embriões em uma lâmina de vidro. Criar uma câmara entre a lamela principal e o slide usando fragmentos lamela em cada lado da câmara. Normalmente, quatro # 1 lamelas são usados ​​para fazer estas pilhas espaçadores sem vedação.
   NOTA: No meio de montagem é necessária.
2. Use uma imersão em óleo de 100Xobjetivo trazer único embrião em foco usando luz transmitida. Apague a luz. Ligue microscópio confocal. Assegurar que os lasers apropriados (verde e / ou vermelho) estão ligados e accessary foco remoto está envolvida.
3. Ligue o programa confocal. No "bar Acquire", selecione o próprio objecto. No bar "XY Basic", definir o tamanho da imagem para 1024, clicando no botão 1.024.
4. No "Laser e Detector" bar, clique na caixa de 488 vermelho e 568 a caixa verde para ligar a laser e detector para cada canal. Definir pinhole para médio e ajustar o ganho no bar "Gain" de cada canal de visualizar.
5. No bar "Configurações de Obtenção de", clique em "Live" para começar a aquisição de imagens. No bar "Ver Definições", desmarque a caixa "Forçar Integral Zoom" para o centro na janela "Live".
6. No bar "Adquirir Configurações", na guia "Z", percorrer as camadas da imagem. Depois de seleccionar o Number de secções ópticas de incorporar a imagem, mover-se para algum ponto no "centro" do plano z.
7. Sob a guia "Z", clique na pequena caixa vermelha "Referência". Isto irá zerar a RFA no ponto escolhido como o "centro". Na caixa "Tamanho do Passo", selecione a espessura das camadas (entre 0,25 mm e 2,0 mm é ideal). Preste atenção para a caixa "Tamanho" e tentar limitar a 1GB.
   NOTA: Normalmente, até 40 secções ópticas de 0,5-1,0 uM são obtidos, mas o número de secções podem ser determinadas empiricamente.
8. Para encontrar o extremo superior da imagem, clique no círculo ao lado de "Top" e mover-se através das camadas z. Agora clique no círculo ao lado de "Bottom", o computador terá a imagem de volta para a camada como o centro. Mais uma vez se mover através das camadas para encontrar o extremo inferior da imagem.
9. Clique em "Live" novamente em "Configurações de Obtenção de" caixa para parar o laseraquisição. Neste painel, clique nas caixas vermelhas marcadas média e Z-stack. Estas caixas ficará verde.
10. Na caixa "Configurações de Obtenção de", clique em "Single" para adquirir toda a série de imagens. Você pode monitorar o progresso como ele verifica em ambos os canais e através de todo o z-stack.
11. Para salvar, clique na janela de volume e clique em "salvar como" e nomeie o arquivo. Salvar como um arquivo ".IDS". Ao volume de processar o arquivo enquanto o z-stack ainda está em aberto, selecione os dados no menu suspenso e clique em "volume de render". Salve o arquivo processado como um arquivo TIFF. Esta é a imagem projectada que são mostrados nesta publicação.

Resultados

Condições ideais para a visualização de fosfo-epítopos

Métodos que descrevem a imunolocalização de epitopos da proteína em embriões de peixe-zebra foram relativamente escassas em comparação com aqueles para a localização de ARNm através de hibridação in situ. Os fixadores usados ​​na localização de epítopos de proteínas em células ciliadas de embriões de peixe-zebra incluíram 4% PFA / PBS e fixador de...

Discussão

O método / metanol PFA foi desenvolvido neste laboratório com o objetivo principal de otimizar a imunolocalização do fosfo-T ²⁸⁷ -CaMK-II epitopo durante o desenvolvimento do peixe-zebra. Este método localizada com êxito P-CaMK-II durante a formação de vários órgãos, incluindo o ciliadas KV peixe-zebra, ¹² ouvido interno ¹⁴ e do rim. ¹³ em particular na fase KV, esta técnica foi necessário. O sucesso deste método é provavelmente devido a uma combinação de a) minimização da aut...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1-fenil-2-tioureia (PTU)	Sigma	P-7629	0,12% Solução estoque. Diluir 1:40 em água do sistema
Alexa488 anti-mouse IgG	Life Technologies	A11001	Cabra policlonal, use a 1:500
Alexa488 anti-coelho IgG	Life Technologies	A11008	Cabra policlonal, use a 1:500
Alexa488 faloidina	Life Technologies	A12379	Liga-se preferencialmente à F-actina
Alexa568 anti-mouse IgG	Life Technologies	A11004	Cabra policlonal, use a 1:500
Alexa568 anti-coelho IgG	Life Technologies	A11011	Cabra policlonal, use a 1:500
anti-acetilada α-tubulina	Sigma	T7451	Camundongo monoclonal, use a 1:500
anti-fosfo-T287 CaMK-II	EMD Millipore	06-881	Coelho policlonal, use a 1:20
anti-total CaMK-II	BD Biosciences	611292	Monoclonal de camundongo, use a 1:20
Etanol	Fisher	S96857	Grau de laboratório, 95% desnaturado
Fórceps	Fine Science Tools	11252-20	Dumont #5
Lâminas de vidro	VWR	16004-330	#1  espessura
Lâminas de microscópio de vidro	Fisher	12-550-15	Lâminas de vidro padrão
Metanol	Fisher	A411	Armazenar no congelador
Tubos de microcentrífuga	VWR	20170-038	tubos tampados, não estéreis
Soro de cabra normal	Life Technologies	16210-064	Alíquota Tubos de 1 ml, armazenar no congelador
Paraformaldeído	Sigma	P-6148	Grau de reagente,
salina tamponada com fosfato cristalino (PBS)	Qualidade Biológica	119-069-131	10x solução de estoque ou feita em laboratório
Triton X-100	Sigma	BP-151	Solução de 10% em água, armazene em RT
Tween-20	Life Technologies	85113	Solução de 10% em água, armazene em RT
Microscópio composto	Nikon	E-600	Monte em mesa sem vibração
C1 Plus confocal de varredura a laser de dois	Nikon	C1 Plus	Executado pelo programa EZ-C1, mas as atualizações usam " Elementos"