Este protocolo descreve as técnicas específicas usadas para a caracterização estrutural da(s) sequência(s) glicosila(s) final(is) e da região interna redutora(s) de heteroxilanas, marcando o ER com 2 aminobenzamida antes da hidrólise enzimática (endoxilanase) e, em seguida, análise dos oligossacarídeos resultantes usando espectrometria de massa (MS) e ressonância magnética nuclear (RMN).
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Artigo de método
Sequenciamento de parede planta heteroxilanos Usando enzimática, química (metilação) e físico (espectrometria de massa, ressonância magnética nuclear) Técnicas
Neste artigo
Resumo
Resumo
Este protocolo descreve as técnicas específicas utilizadas para a caracterização de reduzir extremidade (RE) e a sequência de glicosilo região interna (s) de heteroxilanos. As paredes celulares do endosperma do trigo de-engomados foram isolados como um resíduo de álcool insolúvel (AR) 1 e sequencialmente extraída com água (W-Sol Pe) e 1 M de KOH contendo 1% NaBH4 (KOH-Sol Fr) como descrito por Ratnayake et al. (2014) 2. Duas abordagens diferentes (ver o resumo na Figura 1) são adotados. No primeiro, AXs W-Sol intactas são tratados com 2AB para marcar o RE espinha dorsal resíduo de açúcar cadeia original e, em seguida, tratada com uma endoxilanase para gerar uma mistura de RE marcado com 2AB região interna e reduzindo oligossacidos, respectivamente. Numa segunda abordagem, o FR-Sol KOH é hidrolisado com endoxilanase a primeira geração de uma mistura de oligossacáridos, que são, subsequentemente, rotulados com 2AB. Os enzimaticamente liberados ((ONU) tag) oligossacarídeos de ambosW- e Pes de KOH-SOL são então metilado e a análise estrutural detalhada de ambos os oligossacáridos nativos e metilados é realizada usando uma combinação de MALDI-TOF-MS, de RP-HPLC-ESI-MS e QTOF-ESI-MS n. Endoxilanase digerido KOH-Sol AXs são também caracterizados por ressonância magnética nuclear (RMN) que também fornece informações sobre a configuração anomérica. Estas técnicas podem ser aplicadas a outras classes de polissacáridos, utilizando os endo-hidrolases adequadas.
Introdução
Heteroxilanos são uma família de polissacarídeos que são predominantes os polissacáridos não celulósicas das paredes primárias de gramíneas e as paredes secundárias de todas as angiospérmicas 3-6. Os backbones xylan diferem em seus tipos e padrões de substituição com glicosil (ácido glucurónico (GlcA), arabinose (Araf)) e de resíduos, dependendo do tipo de tecido, estágio de desenvolvimento e de espécies não-7 glicosilo (O-acetil, ácido ferúlico).
Paredes de trigo (Triticum aestivum L.) endosperma são compostos principalmente de arabinoxilanos (AXs) (70%) e (1 → 3) (1 → 4) glucanos -β-D-(20%) com quantidades....
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Protocolo
1. A rotulagem do Fim Reduzir (RE) resíduo de açúcar de AXs W-sol com 2-aminobenzamida (2AB)
- Incubar AXs W-sol com 2AB (0,2 M) na presença de 1 M de NaBH3CN (cianoboro-hidreto de sódio) (pH 5,5) durante 2 h a 65 ° C para converter as extremidades redutoras das cadeias de polissacárido espinha dorsal de seus derivados fluorescentes.
CUIDADO: O passo seguinte deve ser realizada na capela como NaBH3CN libera o gás venenoso cianureto quando está em contacto com a água.- Pesar NaBH3CN (62,8 mg) e dissolver em ua (1 mL) num tubo de microcentrifugação (1,5 ml) para preparar uma solução 1 M de NaBH3CN. Dis....
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Resultados
Digestão da endoxilanase de 2AB marcado W-Sol AXs gera uma mistura de oligossacáridos RE marcado com 2AB e uma série de oligossacáridos (sem rótulo 2AB) marcado com un derivadas das regiões internas da cadeia de xilano (Figura 1; a partir Ratnayake et ai. 2). Uma série de abordagens cromatográficos é então utilizado para fraccionar a mistura complexa de isómeros. Finalmente, técnicas de MS são utilizados para identificar as estruturas isoméricas que s.......
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Discussão
A maioria dos polissacáridos da parede celular fase de matriz têm aparentemente de forma aleatória espinhas dorsais substituído (com ambos glicosilo e resíduos de não-glicosilo) que são altamente variáveis dependendo da espécie de planta, fase de desenvolvimento e tipo de tecido 3. Desde polissacarídeos são produtos de genes secundários sua sequência não é modelo de derivados e não há, portanto, nenhuma abordagem analítica única, como existe para os ácidos nucléicos e proteínas, por sua sequenciação. A disp.......
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Divulgações
Não temos nada a divulgar.
Agradecimentos
Este projeto foi apoiado por fundos do Programa de Pesquisa Colaborativa Flagship da Organização Científica e de Pesquisa da Commonwealth, fornecido ao Cluster de Grãos de Alta Fibra por meio do Food Futures Flagship. A AB também reconhece o apoio de uma doação do Conselho de Pesquisa da Austrália (ARC) ao Centro de Excelência em Paredes Celulares Vegetais (CE110001007).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 2 aminobenzamida (2AB) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | A89804 | |
| borohidreto de sódio (NaBH4) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 247677 | Perigoso, manuseie com cuidado |
| o cianoborohidreto de sódio (NaBH3CN) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 156159 | Perigoso, manuseie com cuidado |
| endo-1,4-β-Xylanase M1 (de Trichoderma viride) (120101a) | Megazyme (www.megazyme.com) | E-XYTR1 | |
| Óxido de deutério (D2O) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 151882 | |
| Liofilizador (CHRIST-ALPHA 1-4 LD plus) | |||
| RP C18 Zorbax eclipse plus coluna | A Agilent | (2.1× 100 mm; 1,8 µ m tamanho da conta) | |
| MicroFlex MALDI-TOF MS (Modelo - MicroFlex LR) | (Bruker Daltonics, Alemanha) | ||
| (ESI) - (QTOF) MS (Modelo # 6520) | (Agilent, Palo Alto, CA ) | ||
| ESI-MSn - armadilha de íons (Modelo # 1100 HCT) | (Agilent, Palo Alto, CA). | ||
| Bruker Avance III 600 MHz -NMR | Bruker Daltonics, Alemanha | ||
| Topspin (versão 3.0)-Biospin- software | Bruker | ||
| GC-MS (Modelo # 7890B) | Agilent |
Referências
- Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B., Bacic, A. Determining the polysaccharide composition of plant cell walls. Nature Protocols. 7, 1590-1607 (2012).
- Ratnayake, S., Beahan, C. T., Callahan, D. L., Bacic, A. The reducing end sequence of wheat endosperm cell wall arabinoxyla....
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Reimpressões e permissões
