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Artigo de método

Sequenciamento de parede planta heteroxilanos Usando enzimática, química (metilação) e físico (espectrometria de massa, ressonância magnética nuclear) Técnicas

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DOI:

10.3791/53748

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24 de março de 2016

 ,  , 
1ARC Centre of Excellence in Plant Cell Walls, School of BioSciences, University of Melbourne

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve as técnicas específicas usadas para a caracterização estrutural da(s) sequência(s) glicosila(s) final(is) e da região interna redutora(s) de heteroxilanas, marcando o ER com 2 aminobenzamida antes da hidrólise enzimática (endoxilanase) e, em seguida, análise dos oligossacarídeos resultantes usando espectrometria de massa (MS) e ressonância magnética nuclear (RMN).

Resumo

Este protocolo descreve as técnicas específicas utilizadas para a caracterização de reduzir extremidade (RE) e a sequência de glicosilo região interna (s) de heteroxilanos. As paredes celulares do endosperma do trigo de-engomados foram isolados como um resíduo de álcool insolúvel (AR) 1 e sequencialmente extraída com água (W-Sol Pe) e 1 M de KOH contendo 1% NaBH4 (KOH-Sol Fr) como descrito por Ratnayake et al. (2014) 2. Duas abordagens diferentes (ver o resumo na Figura 1) são adotados. No primeiro, AXs W-Sol intactas são tratados com 2AB para marcar o RE espinha dorsal resíduo de açúcar cadeia original e, em seguida, tratada com uma endoxilanase para gerar uma mistura de RE marcado com 2AB região interna e reduzindo oligossacidos, respectivamente. Numa segunda abordagem, o FR-Sol KOH é hidrolisado com endoxilanase a primeira geração de uma mistura de oligossacáridos, que são, subsequentemente, rotulados com 2AB. Os enzimaticamente liberados ((ONU) tag) oligossacarídeos de ambosW- e Pes de KOH-SOL são então metilado e a análise estrutural detalhada de ambos os oligossacáridos nativos e metilados é realizada usando uma combinação de MALDI-TOF-MS, de RP-HPLC-ESI-MS e QTOF-ESI-MS n. Endoxilanase digerido KOH-Sol AXs são também caracterizados por ressonância magnética nuclear (RMN) que também fornece informações sobre a configuração anomérica. Estas técnicas podem ser aplicadas a outras classes de polissacáridos, utilizando os endo-hidrolases adequadas.

Introdução

Heteroxilanos são uma família de polissacarídeos que são predominantes os polissacáridos não celulósicas das paredes primárias de gramíneas e as paredes secundárias de todas as angiospérmicas 3-6. Os backbones xylan diferem em seus tipos e padrões de substituição com glicosil (ácido glucurónico (GlcA), arabinose (Araf)) e de resíduos, dependendo do tipo de tecido, estágio de desenvolvimento e de espécies não-7 glicosilo (O-acetil, ácido ferúlico).

Paredes de trigo (Triticum aestivum L.) endosperma são compostos principalmente de arabinoxilanos (AXs) (70%) e (1 → 3) (1 → 4) glucanos -β-D-(20%) com quantidades menores de celulose e heteromannans (2% cada) 8. A espinha dorsal xilano pode ser variadamente não-substituído e predominantemente mono-substituído (principalmente O-2 posição e, em menor extensão O na posição 3) e (O-2 e O-3 posições) com α-L-Ara di-substituído F 9 resíduos. A extremidade redutora (RE) de heteroxilanas de dicotiledóneas (por exemplo, de Arabidopsis thaliana 10) e gimnospermas (por exemplo, abeto vermelho (Picea abies) 11) contém uma sequência de tetrassacárido glicosilo característicos; -β-D-Xil P - (1 → 3) -α-L-Rha P - (1 → 2) -α-D-Gal P A- (1 → 4) -D-Xil p. Para compreender a biossíntese e função (biológica e industrial) heteroxylan, é importante para sequenciar completamente a espinha dorsal xilano de compreender os tipos e os padrões de substituição, bem como a sequência da extremidade redutora (RE).

As técnicas específicas utilizadas para a caracterização estrutural de redução final (RE) e sequência glicosil região interna (s) de heteroxilanos são descritos neste manuscrito. As técnicas dependem de fluoróforo marcação (com 2 aminobenzamida (2AB)) na extremidade redutora (RE) da cadeia heteroxylan antes enzimática (endoxilanase) hidrólise. Esta abordagem, em particular para a sequenciação RE, estavaprimeiro reportados pelo laboratório Iorque 10,12-13 mas agora é alargado para incluir a sequência e a região interna é uma combinação de técnicas estabelecidas que é igualmente adaptável a todos os heteroxilanos, independentemente da sua fonte de isolamento. Esta abordagem também pode ser aplicada a outras classes de polissacáridos usando (quando disponíveis), os endo-hidrolases adequadas.

No presente estudo, as paredes celulares do endosperma do trigo engomado-de foram isolados como um resíduo de álcool insolúvel (AR) e sequencialmente extraída com água (W-Sol Pe) e KOH 1M contendo 1% de NaBH 4 (KOH-Sol Fr) como descrito em Ratnayake et al. (2014) 2. Os oligossacidos libertados de ambos W- e Pes de KOH-SOL são então metilado e a análise estrutural detalhada dos oligossacidos nativos e metilados é realizada usando uma combinação de MALDI-TOF-MS, ESI-MS-QTOF-acoplado com HPLC, com a separação cromatográfica utilizando uma linha de RP C-18 de colunae n ESI-MS. Endoxilanase digerido KOH-Sol AXs também foi caracterizado por ressonância magnética nuclear (RMN).

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Protocolo

1. A rotulagem do Fim Reduzir (RE) resíduo de açúcar de AXs W-sol com 2-aminobenzamida (2AB)

  1. Incubar AXs W-sol com 2AB (0,2 M) na presença de 1 M de NaBH3CN (cianoboro-hidreto de sódio) (pH 5,5) durante 2 h a 65 ° C para converter as extremidades redutoras das cadeias de polissacárido espinha dorsal de seus derivados fluorescentes.
    CUIDADO: O passo seguinte deve ser realizada na capela como NaBH3CN libera o gás venenoso cianureto quando está em contacto com a água.
    1. Pesar NaBH3CN (62,8 mg) e dissolver em ua (1 mL) num tubo de microcentrifugação (1,5 ml) para preparar uma solução 1 M de NaBH3CN. Dissolve-se o reagente 2AB (27,2 mg) numa solução 1 M de NaBH3CN (1 ml) por aquecimento a 65   ° C e ajustar o pH da mistura de reacção (0,2 M 2AB, 1 M de NaBH3CN) para pH 5,5 com ácido acético a 10%.
    2. Adicionar 200 uL de mistura de reacção (0,2 M 2AB, 1 M de NaBH3CN) para W-assiml AXs (1 mg) em um tubo de vidro com uma tampa e misture utilizando um misturador de vórtice. Incubar durante 2 horas a 65   ° C em um exaustor. Arrefece-se a suspensão até à temperatura ambiente e adicionar 4 vols. de etanol absoluto.
    3. Colocar a suspensão num armazenamento a frio (4 ° C) O / N para precipitar polissacarídeos.
    4. Centrífuga (1500 xg, 10 min, RT) para remover o sobrenadante. Lava-se a pelete extensivamente com etanol absoluto (4x), acetona (1x) e metanol (1x), centrifugação entre cada lavagem. Secar sob vácuo a 40 ° CO / N.
      Nota: Ampla de lavar também remove 2AB residual.

2. Geração de xilo-oligossacarídeos de 2 AB etiquetado W-sol AXs

  1. Dissolver 2AB marcado W-Sol AXs (1 mg) em 500 ul de tampão de acetato de sódio (100 mM, pH 5) num tubo de microcentrifugação (1,5 ml). Adicionar 4 unidades de endoxilanase de GH (11, [M1]) e incubar a 37   ° C durante 16 horas.
  2. Destruir a actividade da enzima por aquecimento dos MIXT reaccionaisure durante 10 min num banho de água a ferver. Arrefece-se a suspensão até à temperatura ambiente e transferir para um tubo de vidro com tampa. Adicione 4 vols. de etanol absoluto e colocar a suspensão em um armazenamento a frio (4 ° C) O / N para precipitar os polissacáridos não digeridos.
  3. Centrífuga (1500 xg, 10 min, RT) para separar polissacáridos não digeridos (grânulo) e endoxilanase gerado xilo-oligossacáridos (sobrenadante). Decantar o sobrenadante para um tubo de vidro limpo e colocá-lo em um banho de água quente (40 ° C).
  4. Evapora-se o etanol sob uma corrente de gás de azoto para um volume de ponto final (~ 500 mL). Congela-se o sobrenadante a -80 ° C durante 4 h e o sobrenadante seco congelada num secador por congelação para se recuperar xilo-oligossacáridos.

3. Geração de xilo-oligossacarídeos de KOH-sol AXs e Rotulagem 2AB

  1. Tratar KOH-Sol AXs com endoxilanase (GH 11, [M1]) para gerar xilo-oligossacáridos como descrito acima (secções de 2,1-2,4).
  2. Trate endoxylanase gerado xilo-oligossacáridos a partir de KOH-Sol AXs com mistura reaccional 2AB (0,2 M 2AB, 1 M de NaBH3CN) como descrito acima (secções 1.1.1-1.1.2).
  3. Decantar o sobrenadante para um tubo de vidro limpo e colocá-lo em um banho de água quente (40 ° C). Evapora-se o etanol sob uma corrente de gás de azoto para um volume de ponto final (~ 500 mL). Congela-se o sobrenadante a -80 ° C durante 4 h e o sobrenadante seco congelada num secador por congelação para se recuperar xilo-oligossacáridos.

4. MALDI-TOF-MS encontrado

  1. Preparação de Solução de MALDI-matriz
    1. Adicionar uma pequena colher de 2, 5-ácido dihydroxbenzoic (DHB) a 50% de acetonitrilo (500 ml) contendo 0,1% de ácido fórmico em um tubo (solução-matriz MALDI). Misture usando um vortex, se dissolve rapidamente, adicione outra pequena colher de DHB. Nota: concentração ideal de solução de MALDI-matriz é 10 mg / mL -1.
  2. Preparação da placa alvo de MALDI-
    1. Depositar o aqueonos oligossacárido amostras (nativas) (5-10 ug) (W-Sol e / ou KOH-Sol) numa placa de MALDI-alvo. Adicionar solução de MALDI-matriz de 0,3 mL utilizando uma ponta separada e misture pipetando cima e para baixo. Permitir que a mistura se secar à temperatura ambiente.
      Observação: as amostras devidamente secas deve consistir de cristais em forma de agulha comprida apontando para o centro do local. Se o depósito não é pegajoso e / ou manchada na amostra podem ser quer demasiado concentrada ou consistem em sais, estes depósitos não são susceptíveis de produzir um bom espectro e a amostra deve ser ainda purificado.
    2. Introduzir a placa-alvo para a fonte MS e operar em modo de ião positivo (+ ive). Ajustar a voltagem do acelerador de 19,0 kV na fonte iónica 1 e 16,3 kV na fonte iónica 2. Ajustar a potência do laser para mais do que 70%. Selecione o local da amostra na placa MALDI-alvo e clique em Iniciar para começar a disparos de laser.
      Nota: Todas as áreas do alvo não produzirá sinais. Um ponto particular só irá dar um sinal para alguns disparos de laser devidas quer adepleção da mistura amostra / matriz ou as características do cristal.
      1. Mova o laser para diferentes áreas do alvo durante a aquisição e média, cerca de 200 espectros aleatória para obter o sinal-ruído satisfatório.

5. ESI-MS-QTOF

  1. Analise oligossacáridos gerado-endoxilanase (nativo) usando nano-HPLC acoplado com uma ionização por electrospray (ESI) tempo de quadrupolo de voo do instrumento (QTOF) MS com separação cromatográfica em linha usando um RP coluna C-18 (75 um x 150 mm; 3,5 um grânulo tamanho).
    1. Transferir a mistura de oligossacáridos aquosas gerado-endoxilanase para um frasco e colocá-las no amostrador automático de HPLC. Programar o gradiente de eluição de 5-80% com as fases móveis 0,1% (v / v) de ácido fórmico em água e 0,1% (v / v) de ácido fórmico em acetonitrilo, respectivamente, durante 60 min.
    2. Ajustar a taxa de fluxo de 0,2 mL / min. Ajuste o modo de ião positivo na faixa de varredurade 300-1,600 m / z e uma taxa de varredura de 0,5 varreduras / segundo, utilizando as condições da fonte de ESI da seguinte forma: Cortina de gás 10, GS1 4, temperatura da fonte de 100 ° C, tensão de pulverização de iões de 2.300 V, e de-agrupamento potencial de 50 V. Execute o programa LC cromatográfica e oligossacarídeos eluir. O cromatograma iónico total resultante (TIC) é salvo automaticamente pelo software.
    3. Abra o TIC salva e selecione extrato cromatograma. Tipo as massas esperadas (por exemplo, 271, 403, 535, 667, 799 e 931 m / z) na linha de comando. cromatograma digitalização clicando Enter. Processar os varrimentos de iões seleccionados dos dados do cromatograma ESI-MS QTOF utilizando software de acordo com as instruções do fabricante 14.

6. ESI-MS N

  1. Inserção de 1 a 2 ul de per-O-metilado oligosacárido (metilado como descrito por Pettolino et ai. 1) da amostra em 50% de acetonitrilo em uma ponta de nanospray, utilizando uma seringa. aparara ponta nano-pulverização usando um cortador de vidro para se ajustar dentro do suporte de nano-pulverização a discreto ligado à MS.
  2. Definir a massa de acordo com o intervalo esperado de massa (200-1,500 m / z) e gás de cortina para 10, a tensão ionspray a 1.900 V e polaridade para positiva.
  3. Pressione o botão AQUISIÇÃO para abrir a janela relevante, digite o nome do arquivo de dados para obter uma varredura total de iões (ESI-MS 1). Em seguida, pressione o botão STOP.
  4. Alterar o tipo de digitalização a partir de íons produto para fragmentar um pico de interesse. Indicar a massa de interesse (por exemplo, 885 m / z) para fragmentar e ajustar a faixa de massa (200-900 m / z). Pressione o botão de adquirir e ajustar a energia de colisão (para cima e / ou para baixo na guia composto) para atingir toda a fragmentação do ião pai (885 m / z) e adquirir uma varredura fragmento ion (ESI-MS 2).
  5. Indicar a massa de iões de fragmento de interesse (por exemplo, 711 m / z) e ajustar a faixa de massa (200-720 m / z). Pressione o botão de adquirir umd ajustar a energia de colisão para alcançar toda a fragmentação do ião precursor (711 m / z) e adquirir um fragmento de verificação de iões (ESI-MS 3).

7. H 1 RMN Espectroscopia

  1. Dissolve-se endoxilanase gerado mistura de oligossacáridos (KOH-Sol, forma nativa) (~ 500 mg) em D 2 O (1,0 mL, 99,9%) num tubo de ensaio de plástico (15 ml). Congelar a suspensão a -80 ° C durante 4 h e seca-se a suspensão congelada num secador por congelação para se recuperar xilo-oligossacáridos.
  2. Repita duas vezes 7.1 a fim de trocar completamente a H2O com D 2 O.
  3. Dissolver oligossacáridos secas em D 2 O (0,6 mL, 99,9%) e adicionar 0,5 mL de acetona (5% em D 2 O) como um padrão interno. Transferir os oligossacáridos deuterados para o tubo de amostra de RMN.
  4. Segure o tubo contendo a amostra NMR por cima e inserir o tubo de amostra em um spinner de plástico. Coloque o botão rotativo no medidor de profundidade amostra. Push ou puxar o tubo de amostra para ajustar a profundidade da amostra para assegurar que a linha de centro da parte superior da amostra e indicadores de profundidade inferior são iguais.
  5. Remover o medidor de profundidade e inserir a amostra para o amostrador automático acoplado a um espectrómetro de RMN de 600 MHz equipado com uma crio-sonda.
  6. Login e software de controle espectrômetro aberto. Digite o nome do arquivo de amostra. Abrir um conjunto de dados existente e, em seguida, use o comando "EDC" para salvá-lo com um novo nome. Digite o número da posição da amostra no amostrador automático e pressione "Enter".
    Nota: Pressionar o botão "ENTER" vai cair o tubo de amostra suavemente para o magneto onde será posicionado na parte superior da sonda.
  7. Definir a temperatura da amostra desejado, digitando "edte" na linha de comando. Espera para a temperatura da amostra até atingir o valor desejado antes de prosseguir para o próximo passo. Enter "bloquear" na linha de comando e selecione solvente apropriado (D 2 O). Espere pelo " bloquear mensagem acabada "para aparecer na parte inferior da janela.
  8. Digite "ATMM" na linha de comando e clique em "otimizar" no topo da barra de menu ATMM. Escolha Iniciar para o ajuste e combinação da sonda para o canal selecionado (1 H, neste caso).
  9. Digite "topshim" na linha de comando para o processo de calços em que pequenos ajustes são feitos para o campo magnético até campo magnético uniforme é conseguido em torno do sample.Acquire o sinal, digitando "zg" na linha de comando e digite.
  10. Analisar os espectros utilizando o software 15 de acordo com as instruções do fabricante, com um desvio químico H referenciado a um padrão interno de acetona a 2.225 ppm.

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Resultados

Digestão da endoxilanase de 2AB marcado W-Sol AXs gera uma mistura de oligossacáridos RE marcado com 2AB e uma série de oligossacáridos (sem rótulo 2AB) marcado com un derivadas das regiões internas da cadeia de xilano (Figura 1; a partir Ratnayake et ai. 2). Uma série de abordagens cromatográficos é então utilizado para fraccionar a mistura complexa de isómeros. Finalmente, técnicas de MS são utilizados para identificar as estruturas isoméricas que s...

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Discussão

A maioria dos polissacáridos da parede celular fase de matriz têm aparentemente de forma aleatória espinhas dorsais substituído (com ambos glicosilo e resíduos de não-glicosilo) que são altamente variáveis ​​dependendo da espécie de planta, fase de desenvolvimento e tipo de tecido 3. Desde polissacarídeos são produtos de genes secundários sua sequência não é modelo de derivados e não há, portanto, nenhuma abordagem analítica única, como existe para os ácidos nucléicos e proteínas, por sua sequenciação. A disp...

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Divulgações

Não temos nada a divulgar.

Agradecimentos

Este projeto foi apoiado por fundos do Programa de Pesquisa Colaborativa Flagship da Organização Científica e de Pesquisa da Commonwealth, fornecido ao Cluster de Grãos de Alta Fibra por meio do Food Futures Flagship. A AB também reconhece o apoio de uma doação do Conselho de Pesquisa da Austrália (ARC) ao Centro de Excelência em Paredes Celulares Vegetais (CE110001007).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
2 aminobenzamida (2AB)Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)A89804
borohidreto de sódio (NaBH4)Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)247677Perigoso, manuseie com cuidado
o cianoborohidreto de sódio (NaBH3CN)Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)156159Perigoso, manuseie com cuidado
endo-1,4-β-Xylanase M1 (de Trichoderma viride) (120101a)Megazyme (www.megazyme.com)E-XYTR1
Óxido de deutério (D2O)Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)151882
Liofilizador (CHRIST-ALPHA 1-4 LD plus)
RP C18 Zorbax eclipse plus coluna A Agilent (2.1× 100 mm; 1,8 µ m tamanho da conta) 
MicroFlex MALDI-TOF MS    (Modelo - MicroFlex LR)(Bruker Daltonics, Alemanha)
(ESI) - (QTOF) MS     (Modelo # 6520)(Agilent, Palo Alto, CA )
ESI-MSn  - armadilha de íons  (Modelo # 1100 HCT)(Agilent, Palo Alto, CA).
Bruker Avance III 600 MHz -NMRBruker Daltonics, Alemanha
Topspin (versão 3.0)-Biospin- software Bruker 
GC-MS (Modelo # 7890B)Agilent 

Referências

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  4. York, W. S., O'Neill, M. A. Biochemical control of xylan biosynthesis - which end is up? Plant Biol. 11, 258-265 (2008).
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  14. Agilent MassHunter Workstation Software - Quantitative Analysis Familiarization Guide. , Agilent Technologies. Available from: http://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G3335_90061_Quant_Familiarization-EN.pdf (2010).
  15. Topspin User Manual. , Bruker. Available from: http://www.nmr.ucdavis.edu/docs/user_manual_topspin_ts30.pdf (2010).
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  18. Gruppen, H., Hoffmann, R. A., Kormelink, F. J. M., Voragen, A. G. J., Kamerling, J. P., Vliegenthart, J. F. Characterisation by 1H NMR spectroscopy of enzymically derived oligosaccharides from alkali-extractable wheat-flour arabinoxylan. Carbohydr. Res. 233, 45-64 (1992).
  19. Kosik, O., Bromley, J. R., Busse-Wicher, M., Zhang, Z., Dupree, P. Studies of enzymatic cleavage of cellulose using polysaccharide analysis by carbohydrate gel electrophoresis (PACE). Methods Enzymol. 510, 51-67 (2012).

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Reimpressões e permissões

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