Cortical actina Fluxo nas células T quantificada pela correlação espacial e temporal Imagem Espectroscopia de iluminação estruturada Microscopia Dados

Resumo

Para investigar as velocidades de fluxo e a direcionalidade da actina filamentosa na sinapse imunológica das células T, a imagem de super-resolução de células vivas é combinada com fluorescência de reflexão interna total e quantificada com espectroscopia de correlação de imagem espaço-temporal.

Resumo

-Actina filamentosa desempenha um papel crucial na maioria dos processos celulares, incluindo a motilidade e, em células do sistema imunológico, a formação de uma interacção célula-célula chave conhecida como a sinapse imunológica. F-actina também é especulado para desempenhar um papel na regulação da distribuição molecular na membrana de células, incluindo vesículas dinâmica sub-membranoso e agrupamento da proteína. Embora as técnicas de microscopia de luz padrão permitem observações generalizadas e limitou-difração de ser feita, muitos eventos celulares e moleculares, incluindo clustering e fluxo molecular ocorrem em populações de comprimento escalas muito abaixo do poder de resolução da microscopia de luz padrão. Através da combinação total de fluorescência de reflexão interna com o método de iluminação estruturada microscopia de super-resolução de imagem, o fluxo molecular bidimensional da actina F na sinapse imune das células T foi gravado. Espectroscopia de correlação de imagem espaço-temporal (STICS) foi então aplicada, o que gera resul quantificávelts na forma de histogramas de velocidade e mapas vetoriais que representam a direcionalidade e fluxo magnitude. Este protocolo descreve a combinação de técnicas de imagem e os paus de super-resolução para gerar vetores de fluxo em níveis sub-difração de detalhe. Esta técnica foi utilizada para confirmar uma fluxo de actina que é simetricamente retrógrada e centrípeta ao longo da periferia de células T mediante a formação de sinapses.

Introdução

O objectivo da experiência é a imagem e caracterizar o fluxo molecular de filamentous- (F-) actina em células T vivo, para além do limite de difracção, a fim de estabelecer a direcção do fluxo e durante a magnitude sinapse imunológica (IS) formação. Esta técnica irá ser realizada utilizando um microscópio de iluminação estruturada (SIM) no modo de reflexão interna total de fluorescência (TIRF), imagiologia de células T de Jurkat que formam uma sinapse artificial sobre a activação das lamelas revestidas com anti-CD3 e anti-CD28. Os formulários está entre uma célula T e seu alvo; uma célula que apresenta antigénios (APC) em cima do receptor de células T (TCR) ^1,2 activação. Como esta é a primeira etapa para determinar se o sistema imunitário adaptativo gera uma resposta imunitária a uma infecção, as consequências da capacidade de resposta a estímulos incorrecta pode provocar um certo número de doenças. A importância da interacção de células T-APC está bem documentada, no entanto, o papel (s) do maduro é depois Si TCR inicialinternalização nal ainda estão para ser totalmente compreendido.

Como o citoesqueleto é pensado para auxiliar dois processos ligados à activação de TCR (o movimento de moléculas na membrana plasmática e do controlo de moléculas de sinalização dependentes do citoesqueleto de actina ^3,4), compreender como o citoesqueleto reorganiza espacial e temporalmente irá elucidar os passos de reorganização molecular durante a formação de sinapses. O fluxo retrógrado de F-actina é pensado para encurralar aglomerados de TCR em direcção ao centro da sinapse imunológica, esta translocação se acredita ser fundamental para a cessação do sinal e de reciclagem; auxiliando o bom equilíbrio de activação de células T ^5.

Enquanto a microscopia de fluorescência padrão é uma ferramenta flexível que continua a fornecer uma visão sobre muitos eventos biológicos, incluindo interações célula-célula, ela é limitada pela capacidade do sistema para resolver com precisão vários fluoróforos que residem mais perto do que o diffrlimite de acção (≈200 nm) de cada outro. Como muitos eventos moleculares dentro das células envolvem densas populações de moléculas e apresentam rearranjo dinâmico quer na quietude ou mediante estimulação específica, microscopia de luz convencional não fornece a imagem completa.

A utilização de super-resolução de imagem permitiu a investigadores para contornar o limite de difracção utilizando uma variedade de técnicas. Microscopia molécula única localização (SMLM), tais como PALM e STORM ^6,7 tem a capacidade de resolver o local de moléculas até uma precisão de cerca de 20 nm, no entanto, estas técnicas dependem de longos tempos de aquisição, a criação de uma imagem ao longo de muitos quadros . Geralmente isso requer amostras a serem fixos ou para estruturas mostrou baixa mobilidade fluorophores tão simples não são mal interpretados como vários pontos. Enquanto esgotamento emissão estimulada (STED) imagiologia permite super-resolução através da excitação confocal muito seletivo ^{8, a} digitalização necessáriaabordagem pode ser lento sobre os campos de células inteiras de vista. STED também demonstra fototoxicidade significativo para resoluções mais elevadas devido ao aumento do poder do feixe de esgotamento.

Microscopia de iluminação estruturada (SIM ⁹⁾ proporciona uma alternativa a estes métodos, capazes de duplicar a resolução de um microscópio de fluorescência padrão e é mais compatível com a imagem de células vivas do que as técnicas correntes SMLM. Ele usa poderes de laser inferiores, em um sistema de campo amplo para campos de células inteiras de vista; proporcionando maior velocidade de aquisição, e é compatível com rotulagem fluoróforo padrão. A natureza de campo amplo de SIM também permite a utilização de fluorescência total interno de reflexão (TIRF) para excitação altamente seletivo, com profundidades de penetração na dimensão axial de <100 nm.

Espectroscopia de correlação de imagem (ICS) é um método de correlacionar as flutuações na intensidade de fluorescência. Uma evolução do ICS; Im espaço-temporalespectroscopia de correlação de idade (STICS ¹⁰⁾ correlaciona sinais fluorescentes intracelulares no tempo e no espaço. Ao correlacionar intensidades de pixel com áreas pixels em quadros mais atrasadas através de uma função de correlação, a informação é adquirida com as velocidades de fluxo e direcionalidade. Para garantir objectos estáticos não interfiram com a análise STICS, um filtro objecto imóvel é implementado, o qual funciona através da subtracção de uma média móvel da intensidade dos pixels.

A técnica aqui apresentada acredita-se ser a primeira demonstração de espectroscopia de correlação de imagem a ser aplicada aos dados de microscopia de super-resolução para quantificar o fluxo molecular em células vivas ^11. Este método melhora na imagem limitado por difração de fluxo de F-actina via análise STICS ¹² e serviria para pesquisadores que desejam determinar o fluxo molecular bidimensional em células vivas, a partir de dados adquiridos em resoluções espaciais para além do limite de difração da luz.

Protocolo

Nota: Fases 1 e 2 têm lugar antes do dia de imagem; assegurar todos os meios e suplementos para ser utilizado antes ou no dia da imagiologia são equilibradas. A equilibração é conseguida através do aquecimento de meios e suplementos para 37 ° C numa incubadora a 5% de CO _2. Todas as etapas do trabalho de cultura celular e lamela chapeamento ter lugar em condições estéreis sob uma capela de fluxo laminar.

1. A transfecção celular

1. Transfectar as células T a ser trabalhada 24 horas antes da experiência, com um plasmídeo que codifica uma fusão de rotulagem fluorescente construir GFP F-actina e imagiologia. Nota: As células devem ser dividida 24 h antes da transfecção (48 h antes da imagem) para garantir as células estão em óptima saúde e na sua fase de crescimento logarítmica.
   1. Colocar 5 ml de suplemento de meio RPMI (meio RPMI 1640 mais 10% de FBS e 1% de Pen-Strep (opcional)) em um único poço de uma placa de 6 poços na incubadora para equilibrar.
   2. Agregar 2 x 10 ⁷ células T cultorado a 37 ° C, 5% de CO _{2 em} meio RPMI suplemento utilizando um tubo de centrifugação a 327 xg durante 5 minutos e lava-se em um volume igual de meio de electroporação pré-aquecido. Nota: médio Eletroporação é um meio de soro reduzido contendo buffers e suplementos (ver consumíveis).
   3. Depois de re-granulação a 327 xg durante 5 min, ressuspender as células em 500 ul de meios de electroporação e lentamente adicionar a uma cuvete, adicionam-se 5 ug do plasmídeo em PCR grau _de dH2O para rotulagem de F-actina.
   4. Bata suavemente a tina no espaço de trabalho capa para assegurar a remoção de quaisquer bolhas de ar nos meios de comunicação, que podem provocar faíscas da eletricidade e para distribuir uniformemente as células dentro dos meios de comunicação.
   5. Ligue o aparelho de eletroporação e ajuste a tensão para 300 V e capacidade para 290 Ω. Electroporate amostra utilizando um decaimento exponencial de 20 mseg. Nota: Optimização podem ser necessários para diferentes células e diferentes construções de plasmídeos.
   6. Uma vez que o protocolo de transfecção é, células de lojas completas sobre gelo durante 1 min antes de continuar.
   7. Transferir cuidadosamente as células da cuvete para a placa de 6 poços contendo 5 mL de meio RPMI suplemento equilibrada a partir do passo 1.1.1.
   8. Incubar as células O / N a 37 ° C + 5% de CO _2.

2. Lamelas casaco e Pré-quente Suplemento de imagem

1. Lamelas revestimento com anticorpos para induzir a estimulação de células T.
   1. Bata de cada uma das câmaras de uma lamela 8 poços com 1 ug / ml oCD3 e αCD28 em 200 ul de PBS.
   2. Armazenar a 4 ° CO / N. Alternativamente, lamelas de revestimento de 2 horas antes da imagem e manter-se em uma incubadora a 37 ° C para reduzir a dispersão durante o processo de imagem ao minimizar as mudanças de temperatura para a lamela.
2. Criar uma amostra de teste lamela com 0,1 um sub-difração de microesferas fluorescentes.
   1. Solução estoque Vortex de esferas para evitar grumos.
   2. Em uma nova lamela, limpo de the mesmo tipo que os utilizados no passo 2.1.1, pipeta de 5 ul da solução de microesferas fluorescentes sobre a superfície (conforme as instruções do fabricante).
   3. Espalhe solução microesfera sobre a lamela com ponteira.
   4. Deixe secar, em seguida, aplicar 200 � de meio de montagem, como a PBS.
      Nota: o meio de montagem deve corresponder ao utilizado para amostras de células de imagem.
3. Equilibrar HBSS (+ 20 mM de HEPES, a seguir designado por "HBSS suplemento ') num tubo de centrifugação por colocação dentro de uma incubadora para pré-aquecer O / N a 37 ° C + 5% de CO _2.
   Nota: a adição de HEPES é para tamponar CO _2, se estiver usando uma câmara de incubação com CO ₂ de entrada pular esta suplementação.

3. Microscópio Set-up

1. Ligue a fase de topo incubadora do microscópio e lugar suficiente água destilada TIRF-SIM no reservatório do microscópio para cobrir completamente a base do elemento de aquecimento. Permitir que a água para equilibrate a 37 ° C. Adicionar o colar de aquecimento para a lente da objectiva, também definido como 37 ° C.
   Nota: Devido à sensibilidade do set-up, essas etapas são feitas na noite anterior para que os componentes ópticos estão a uma temperatura estável antes da imagem.
2. Coloque o TIRF 488 compatível bloco ralar no caminho óptico do microscópio e prenda no lugar.
   1. Mude o modo de canal e do cabo de fibra para a posição 'Single' no palco cama laser e microscópio, respectivamente, para envolver o caminho óptico correto para o modo TIRF-SIM. Nota: Ignorando este passo conduzirá a um erro (Figura 1A) na janela do software.
3. Ligue todos os componentes do microscópio e computador e abra o software de controle de aquisição.
   1. Abra o painel de OC, Ti Pad, N-SIM Pad e ND Aquisição janelas (Figura 1B). No 'Painel de OC' selecione a opção 'TIRF 488' (Figura 2B, seta amarela).
   2. Na janela de N-Pad SIM, selecione a opção 'TIRF-SIM' e configurações 'em movimento "(Figura 2C, setas amarelas). Selecione o botão de configurações (Figura 1C, caixa amarela) e selecione 'TIRF 488 (para 100x TIRF 488nm)' no menu suspenso, clique em 'Aplicar' e 'OK'.
   3. Defina as configurações da câmera dentro das configurações DU897 'Para: Frame Rate 50 ms, modo de leitura, Gain EM 3 MHz em 14 bits, e EM Gain Multiplicador 300 com um ganho de conversão de 1 (Figura 1C, caixa verde).
      Nota: Os resultados representativos para ver considerações taxa de quadros.
   4. Calibrar a iluminação do microscópio para TIRF-SIM, seleccionando a NA CFI Apochromat TIRF objetivo 100x 1,49, no 'N-SIM Pad' virar a potência do laser de 488 nm para 10%.
      Nota: O tamanho do pixel das imagens cruas é de 60 nm, com um campo de 512 x 512 pixels de vista.
   5. Limpe a lente objetiva usando lenço de papel para remover o pó e óleo.
4. Encontre o plano focal TIRF-SIM.
   1. Comece com o objetivo no menor z-plano possível. Coloque uma gota de óleo na lente objetiva e adicione a amostra de microesferas fluorescentes a partir do passo 2.2 para o palco microscópio.
   2. Seleccionar a função perfeito sistema de focagem (PFS) situado no corpo do microscópio.
   3. Mover-se lentamente o objectivo acima através do plano z até que o botão de PFS pára de piscar para confirmar o plano focal foi atingido.
   4. Mudar para a Visão 'Live' no software de controle e imagem das microesferas para ajustes finais feitas usando a roda de micro-manipuladora PFS.
5. Observe a iluminação uniforme sem emissão de fluorescência fora de foco acima da onda evanescente 75 nm.
   Nota: Confirme iluminação estruturada é cumprida observando um padrão de iluminação flutuante a partir da amostra de microesferas fluorescentes.
6. Meça fluorescente amostra microesfera e quantificar a melhoria resolut imagemion, observando toda a largura à meia altura (FWHM) do perfil de intensidade.
   1. Abra o software Analisar (v4.20.01), com o módulo de NIS-A N-SIM Análise instalado e selecione "Aplicativos" -> "janela mostra N-SIM '.
   2. Com o contraste de modulação iluminação (IMC) e supressão de ruído de alta resolução (HRNS) definido como 1 para conjuntos de dados TIRF-SIM (Figura 2), reconstruir a imagem da amostra microesfera para gerar uma imagem reconstruída de 1.024 x 1.024 pixels com um tamanho de pixel de 30 nm.
   3. Usando a ferramenta de perfil de linha com uma largura de 1 de pixel (Figura 3A, caixa amarela), desenhar uma linha através do centro de uma única microesfera.
   4. Selecione o botão FWHM (Figura 3B, caixa amarela) e clique no maxima intensidade da distribuição de Gauss, seguido por seu mínimos intensidade.
   5. Confirmar a FWHM da microesfera está na gama de 100 nm (Figura 3C). Nota: o ach resoluçãoquando imaging amostras biológicas quistada irá variar dependendo da relação sinal-ruído de fundo e eficiência de marcação por fluorescência.

4. Preparação de Amostras for Imaging

1. Preparação lamela.
   1. Recuperar lamela αCD-revestido do passo 2.1 do refrigerador ou incubadora e remover PBS contendo oCD3 e αCD28 de cada poço.
   2. Adicionar 200 ul de pré-aquecido suplemento HBSS a partir do passo 2.3 em cada poço da lamela. Lavar e remover para assegurar o mínimo oCD3 e αCD28 é deixado em solução. Adicionar mais 200 ul de HBSS o suplemento aos poços lamela.
   3. Limpar o lado de baixo da lamela com o tecido da lente para retirar o óleo e partículas.
2. Posição lamela na platina do microscópio e encontrar o plano focal TIRF da lamela, utilizando o plano z PFS como encontrado na etapa 3.4.
3. Preparação de Células.
   1. Pipetar 200 mL da mídia contenção células transfectadas do passo 1.1.8 para um tubo de micro-centrífuga.
   2. Células de pellets em uma micro-centrífuga a 268 xg durante 20 segundos e remova a mídia celulares.
   3. Ressuspender as células em 200 ul de pré-aquecido suplemento HBSS a partir do passo 2.3.

5. Células de imagem

1. Tome-célula suplemento contendo HBSS ao microscópio e pipeta suavemente em 200 ul de um dos poços.
2. Mantendo-se no plano focal TIRF na lamela (no modo de PFS), utilize a ocular microscópios e iluminação epifluorescência para rastrear células fluorescentes que se aproximam da lamela.
3. Uma vez que as células pousar na lamela, alternar para o modo 'Live' no N-SIM Pad para trazer a imagem no monitor e verifique as células estão em foco na tela do computador.
4. Para gravar tempo-cursos, abra a janela ND Aquisição e selecione a guia 'Time', clique em 'Adicionar' e configure 'Intervalo' para Nenhum atraso, 'Duração'a 10 min, 'Loops' é definido como 1.
   Nota: A duração pode ser alterada, dependendo do processo de interesse; o software STICS pode extrair resultados quantitativos com pilhas de imagens de = 10 quadros quando capturadas com "Sem atraso '.
5. Com configurações de aquisição idênticos aos da amostra talão, iniciar a gravação de dados selecionando 'Executar agora' na janela do ND Aquisição.

6. Reconstructing SIM Images

1. Depois de imagem estiver concluída, abra o software Analisar (v4.20.01), com o módulo de NIS-A N-SIM Análise instalado e selecione "Aplicativos" -> "janela mostra N-SIM '.
2. Com o contraste de modulação iluminação (IMC) e supressão de ruído de alta resolução (HRNS) definido como 1 para conjuntos de dados TIRF-SIM (Figura 2), reconstruir um (ou múltiplos usando a ferramenta Batch) arquivo SIM-prima para produzir uma imagem de SIM reconstruído.
3. Confirme o arquivo reconstruído tem um tamanho de pixel de 30 nm, indicado nobarra de status da imagem.
   Nota: o tamanho do pixel não afecta análise STICS mas deve ser de pelo menos 2x menor em dimensão do que a resolução espacial PSF, a fim de assegurar a correlação espacial entre os pixels.
4. Exportar os dados como .tiff arquivos, pronto para análise STICS.

7. Análise STICS

1. Baixe e extraia o STIC (C) S pacote de software Matlab (Wiseman laboratório, disponível como informação suplementar). O stics_vectormapping.m roteiro é o núcleo de uma única análise STICS canal e os primeiros 30 linhas de código são usados ​​para definir os parâmetros de entrada, tal como definido no ponto 2.1 do manual. Abra esse script e definir os parâmetros de entrada para a análise de dados TIRF-SIM. Sugere-se também adicionar a pasta S STIC (C) com subpastas para o Matlab caminho da máquina local, conforme detalhado no apêndice do manual.
   1. Defina os parâmetros de entrada para a análise dos dados, editando as linhas correspondentes do código
   2. Para executar analise dos dados TIRF-SIM para gerar um vector mapa, defina os parâmetros temporais para sub-região temporal na linha 31 para o número máximo de quadros ea mudança temporal na linha 32 para 1. Para obter uma série temporal de mapas vetoriais variar esses parâmetros .
   3. Para o filtro de remoção de Immobile, defina o parâmetro "filtragem" (linha 23) para 'Média móvel' e definir o parâmetro 'MoveAverage' (linha 24) a 21.
      Nota: Esta definição foi mostrado para trabalhar em movimento mais lento e grandes sinais de fluorescência, como ele é baseado em subtraindo quadros de série do quadro que está sendo analisado.
   4. Alterar linhas 33-38 para definir o nome dos arquivos de saída e títulos dos mapas saída do vetor, bem como o caminho do diretório de saída e definir em que formato as imagens vetoriais mapa deve ser salvo.

Tamanho do pixel (um)	0,03 mm	A linha 19
Taxa de quadros (seg)	1 segundo	Linha 20
O tempo máximo de atraso (quadros)	20 quadros	Linha 21
Tamanho sub-região (pixels)	8 pixels	Linha 29
Espaçamento sub-região (pixels)	1 pixel	Linha 30

2. Abra as run1ChannelSTICS script na janela Editor de Matlab. Carregue a série de imagens, executando linhas 1-23 deste script.
   Nota: Este script pode ser usado para carregar e pré-processo de série de imagens, traçar os mapas vetoriais e histogramas de velocidade e executar um processamento em lote para muitos arquivos. Se necessário, cortar a imagem de uma região de interesse, usando a linha 24-26 deste script.
   1. Linhas correm 29-35 de run1ChannelSTICS para iniciar a análise STICS. Quando solicitado, selecione um polígono para indicar uma região específica de interesse (ROI), se necessário. Certifique-se de que o ROI não se sobreponha com a borda de célula, como ocorre artefatos de limite quando STICS analisa esses reregiões.
   2. Linhas 38-52 executados para exibir os mapas vetoriais. Para traçar o histograma velocidade magnitude, linhas 53-72 executado.

Resultados

Configurações de microscópio

Depois de atingir com sucesso todas as etapas o pesquisador terá iluminação estruturada realizada (SIM) imageamento de fluxo de F-actina em uma sinapse das células T (vídeo 1) e quantificou esse fluxo molecular por espectroscopia de correlação de imagem espaço-temporal (Figura 4 ^11). Antes de gravar imagens, assegurar a iluminação da amostra é uniforme para as nove image...

Discussão

Esta técnica permitirá aos investigadores a imagem e quantificar previamente detalhes insolúveis em células que expressam fluorescência. Nos nossos resultados que mostram que os fluxos de F-actina de um modo simétrico a partir da periferia em direcção ao centro da célula a célula na célula T IS. Estes resultados são consistentes com os resultados anteriores de dados de perfil quimógrafo linha 1D ¹³ e ampliar a capacidade de análise de dados 2D e super-resolução.

A técnica apresent...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Consumíveis:
Jurkat E6.1 células	APCC	ATTC TIB-152
RPMI	Life Technologies	21875-091
FBS	Sigma	F7524-500ML
Penicilina-Estrepromicina	Life Technologies	15140-122
HBSS	Life Technologies	14025-050
HEPES	Life Technologies	15630-056
#1.5 lamínulas Labtek de 8 poços	NUNC, Labtek	155409
LifeAct GFP construct	Ibidi	60101
OptiMem	Life Technologies	51985-042
anti-CD3	Cambridge Bioscience	317315
anti-CD28	BD Bioscience / Insight Biotechnology	555725
PBS	Life Technologies	20012-019
Óleo de
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Equipamento:
Gene Pulsar Xcell System	BioRad	165-2660
Cubeta (0.4cm)	BioRad	165-2088
Centrífuga (5810R)	Eppendorf	5805 000.327
Centrífuga (Heraeus)	Biofuga pico 75003235
placa de 6 poços	Corning	3516
Incubadora de palco	Tokai Hit	INUH-TIZSH
Nikon Microscópio N-SIM	Nikon	Empresa
Nikon Software de análise	Empresa de contato
Incubadora ( 190D)	LEEC	Empresa