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Artigo de método

Isolamento de CD146

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DOI:

10.3791/53782

⸱

17 de junho de 2016

 ,  , 
1Sinclair Centre for Regenerative Medicine, Ottawa Hospital Research Institute, 2University of Ottawa, 3Department of Neonatology and Pediatric Critical Care Medicine, Medical Faculty and University Hospital Carl Gustav Carus, Technische Universität Dresden, 4DFG Research Center and Cluster of Excellence for Regenerative Therapies (CRTD), Technische Universität, Dresden, 5Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve uma técnica de isolamento para a obtenção de células do estroma mesenquimal residentes primários de pulmão de ratos, através do uso de digestão enzimática, separação por gradiente de densidade, e aderência ao plástico CD146 + selecção esférulas magnéticas.

Resumo

células estromais mesenquimais (MSCs) são cada vez mais reconhecida pelo seu potencial terapêutico em uma ampla gama de doenças, incluindo doenças pulmonares. Além disso a utilização de medula óssea e as MSCs do cordão umbilical para a terapia com células exógenas, há também um interesse crescente na reparação e o potencial regenerador das MSCs de tecido residentes. Além disso, é provável que têm um papel no desenvolvimento normal do órgão, e foram papéis na doença, particularmente aqueles com uma natureza fibrótica atribuída. O principal obstáculo para o estudo destas MSCs residentes de tecido é a falta de um marcador claro para o isolamento e identificação destas células. A técnica de isolamento descritas aqui se aplica múltiplas características de MSCs residentes de pulmão (L-MSCs). No momento do sacrifício dos ratos, os pulmões são removidos e enxaguados várias vezes para remover o sangue. Após dissociação mecânica por bisturi, os pulmões são digeridos durante 2-3 hr usando uma mistura de colagenase de tipo I, tipo protease neutra e ADNase I. A obtainesuspensão de células única d é subsequentemente lavado e colocado em camadas sobre média densidade gradiente (densidade 1,073 g / ml). Após centrifugação, as células da interfase foram lavadas e plaqueadas em frascos tratados de cultura. As células são cultivadas durante 4-7 dias em fisiológico 5% de O2, 5% Condições de CO 2. Para esgotar fibroblastos (CD146 -) e para assegurar uma população de apenas, a selecção positiva de L-MSCs (CD146 +) para células CD146 + é realizado por meio de selecção esférulas magnéticas. Em resumo, este processo produz uma população de forma fiável primária G-MSC para posterior estudo e manipulação in vitro. Devido à natureza do protocolo, que pode facilmente ser convertidos a outros modelos animais experimentais.

Introdução

células estromais mesenquimais (MSCs) são cada vez mais reconhecida pelo seu potencial terapêutico em uma ampla gama de doenças, incluindo doenças pulmonares. Além disso a utilização de medula óssea e as MSCs do cordão umbilical para a terapia com células exógenas, há também um interesse crescente na reparação e o potencial regenerador das MSCs de tecido residentes. Durante o desenvolvimento, incluindo o pulmão, o mesênquima é uma importante fonte de sinais de desenvolvimento, e as MSCs residentes é um candidato provável para estar no centro desta. Além disso, estão surgindo evidências de que MSCs residentes são perturbados em doenças de adultos, incluindo o cancro 1,2 e fibrose 3. O principal obstáculo para o estudo destas MSCs residentes de tecido é a falta de um marcador claro para o isolamento e identificação destas células 4. Células-tronco antigénio-1 (Sca-1) foi identificada em ratos como um marcador para uma variedade de células estaminais do tecido, e pode ser utilizado para o isolamento de MSCs de L-5, mas tem infelizmentenão conhecido orthologs em outras espécies 6. Os investigadores relataram uma variedade de diferentes métodos de isolamento para o isolamento de L-MSCs a partir de qualquer tecido ou fluido pulmonar. Estes variam de células activadas por fluorescência (FACS) modos baseados selecionando para CD31 - / CD45 - / CD90 + células 7, CD31 - / CD45 - / molécula de adesão da célula epitelial (EpCAM) - / Sca-1 + células 8, a resistência a múltiplos fármacos transportador ATP cassete de ligação G (ABCG2) células positivas 9 ou Hoechst 33342 dye efluxo 10, a aderência ao plástico 11,12 e migração para fora do tecido picada 13.

As vantagens do método aqui apresentado são várias vezes. Usando uma digestão enzimática suave e em gradiente de densidade 14, obtém-se todas as células da gama de densidades que incluem MSC, mas excluem células epiteliais ou endoteliais. O passo subsequente aderência ao plástico assegura que apenas o mesenchcélulas ymal aderir e ficar em cultura, eliminando leucócitos. Mais importante, no entanto, o passo de selecção CD146 + permite a eliminação de fibroblastos, uma vez que estas células não expressam CD146. Expressão da molécula de adesão celular CD146 é positivamente correlacionada com multipotency, e por isso é um bom marcador para eliminar os fibroblastos a partir de uma população de células mesenquimais 15-19. Esta é uma vantagem sobre o uso de CD90 como um marcador de selecção, uma vez que não só é expressa no MSC, mas também em lipofibroblasts 5,20. Neste protocolo, escolheu explicitamente uma selecção esfera magnética, uma vez que é mais suave sobre as células, e todo o processo pode ser realizado em condições estéreis. Outra vantagem importante do método de isolamento, em oposição ao método de crescimento, é de que é relativamente rápido, 6-10 dias, em oposição a um mês ou mais para o método de desdobramento. Três a cinco dias após o isolamento inicial da população mesenquimal está pronto para CD146 + sele cção; depois de mais de três a cinco dias, as células CD146 + está pronto para ser usado nas experiências, ou pode ser congelado para posterior utilização. O tempo de diminuição de cultura, melhora a qualidade das células como as MSCs transdiferenciar em direcção fibroblastos em cultura ex vivo prolongada 19. Por último, devido à natureza do protocolo, é possível aplicar este método para outras espécies simplesmente escolhendo anticorpos adequados, ou mesmo com outros sistemas de órgãos, ajustando a escolha de enzimas de digestão e tempo de incubação.

Um protocolo detalhado deste método de isolamento é dada a seguir, e uma vista geral esquemática do isolamento e subsequente selecção da sub-população CD146 + é fornecida na Figura 1A e 1B, respectivamente. Além disso, os detalhes são incluídos para Passaging, congelamento e descongelamento estas células.

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Figura 1. Visão esquemática do isolamento de células pulmonares mesenquimais (A) e CD146 + subsequente selecção de células (B) min = minuto.; EDTA = ácido etilenodiaminotetracético; 2 nd Ab = anticorpo secundário; a-CD146 Ab = anticorpo anti-CD146 primário; células negativas -ve = células CD146; + ve células positivas células = CD146. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Protocolo

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados com Animais da Universidade de Ottawa (animal ética protocolo Ohri-1696). cuidados com os animais foi realizada de acordo com as diretrizes institucionais.

1. Isolamento de células estromais mesenquimais do pulmão

  1. Preparar a mistura de enzima em um tubo de 50 ml: pesar 30 U protease neutra, 2.500 U de colagenase I e 500 U DNAse I. Estas quantidades suficientes para os pulmões de um rato adulto ou filhote de rato. Preparam-se no dia de isolamento e armazenar a 4 ° C até à sua utilização.
  2. Sacrifício filhotes de ratazana no dia 13 através de uma injecção intra-peritoneal de pentobarbital de sódio (0,2 mL, 65 mg / ml). Use o aperto reflexo toe para estabelecer inconsciência. A morte do animal é assegurada através da abertura da caixa, tal como delineado abaixo.
  3. Higienizar a pele pulverizando o animal com etanol a 70% e cuidadosamente abrir a caixa torácica usando tesouras cirúrgicas, a partir de o diafragma e o corte no sentido do lado rostral, sendo muito cuidado para nãopara danificar os pulmões. Espalhe a caixa torácica aberta usando grampos hemostáticos, ou alternativamente cortar a caixa torácica para fornecer acesso ao tórax.
  4. Desangrar o animal através da remoção do coração. Para remover o coração, segure o timo e coração com pequenas pinças e cortar estes afastado com uma tesoura cirúrgica. Imediatamente a seguir, absorver o sangue com uma gaze até não haver mais sangue sai da aorta e a artéria pulmonar cortada.
  5. Remover os pulmões do tórax da seguinte forma: mantenha a traqueia com pequenas pinças, em seguida, atingir a traquéia com uma tesoura cirúrgica no lado rostral. Enquanto puxa o pacote de pulmão para fora do tórax, cortar qualquer tecido conjuntivo no lado dorsal ao longo da caixa torácica para libertar os pulmões.
  6. Cortar os pulmões a partir da aorta e do esófago por corte ao longo do diafragma com tesouras cirúrgicas. Agora que os pulmões estão completamente livres do tórax remover qualquer sangue restante cuidadosamente com uma gaze.
  7. Remova a traqueia e os brônquios com surgicos tesoura e transferir cuidadosamente os lobos pulmonares para um tubo de 50 ml contendo citrato-fosfato-dextrose e adenina (CPDA-1) anticoagulante frio de 35 ml de 30% (26,30 g de citrato trissódico di-hidratado, 3,27 g de mono-hidrato de ácido ascórbico, 2,22 g de fosfato monossódico di-hidrogenofosfato, 31,80 g de D-glucose, 0,275 g de adenina em 1 L de H2O purificada; a filtração estéril da solução usando um filtro de membrana de 0,22 um antes da utilização) em tampão fosfato salino (PBS) para remover o sangue e detritos.
  8. Depois de uma lavagem de 5 min em 30% CPDA-1 / PBS, transferir o pulmão para um novo tubo de 50 ml contendo 35 ml de fosfato estéril tamponado salino (PBS) (RT), inverter suavemente para remover o citrato. Transferir para um tubo contendo 35 ml de PBS + Sódio-piruvato de Dulbecco + Glicose (DPBS ++) (RT). Cada passo de lavagem deve demorar cerca de 5 min.
    Nota: DPBS ++ pode ser encomendado no mercado ou a seguinte composição 21: cloreto de cálcio hidratado 132,4 mg, cloreto de magnésio hexa-hidratado 100 mg, cloreto de potássio (anidro) 200 mg, monobásico de fosfato de potássio (anidro) 200 mg de cloreto de sódio (anidro) 8,000 mg, fosfato de sódio dibásico (anidro) 1,144.5 mg, D-glicose 1,000 mg, piruvato de sódio 36 mg em 1 L de H 2 O purificada, pH 7,3. Filtrar em condições estéreis a solução usando um filtro de membrana de 0,22 um antes da utilização.
  9. Dissolve-se a mistura de enzima por adição de 10 ml de DPBS ++ (pré-aquecido a 37 ° C) e invertendo suavemente até se dissolver.
  10. Transferir os pulmões para um novo tubo de 50 ml e cortar o pulmão na parede do tubo, usando um bisturi, até finamente picados. Adicionar a mistura de enzima ao tecido (10 ml de mistura de enzima / por ratinho adulto / cria de rato do pulmão), fechar o tubo firmemente e incubar a 38 ° C com agitação suave (ou em um misturador térmico, um banho de água em agitação, ou uma água banho com agitação manual regular). A duração depende do tipo de tecido: feto tecido 60 min, juvenil / adulto tecido 90-120 min, adulto tecido fibrótico 120-150 min.
  11. Parar a digestão por quelação os cátions bivalentes wom 200 ul de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA, 0,15 M, pH 7,4. a filtração estéril da solução usando um filtro de membrana de 0,22 um antes da utilização).
  12. Adicionar 20 ml de soro de bovino fetal a 5% (FBS) / PBS e passar toda a suspensão através de peneira de 100 uM de células para um novo tubo de 50 ml. Lavar o filtro e tubo de células com 10 ml de 5% de FBS / PBS, levando o volume total a 40 ml.
  13. Centrifugar durante 5 minutos a 500 x g, temperatura ambiente.
  14. Remover o sobrenadante (pellet deve ser claramente visível), ressuspender em 40 ml de 5% FBS / PBS e repita o passo centrifugação 1,13.
  15. Ressuspender em 4 ml de 5% de FBS / PBS (RT) e a camada cuidadosamente sobre 3 ml de meio de gradiente de densidade (1,073 g / cm3) em um tubo de 15 ml de 14. Para obter uma boa interfase, é crucial que as camadas da suspensão única célula ocorre em um ângulo de °> 45 a uma velocidade muito baixa.
  16. Centrifugar 20 min a 900 xg, meio (5/10) de aceleração, desaceleração sem, 19 ° C.
  17. Recolher as células presentes na emterphase e ressuspender-los em 10 ml de PBS estéril.
  18. Centrifugar durante 5 minutos a 500 xg, 21 ° C.
  19. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 10 ml pré-aquecido meio completado cultura G-MSC (meio mínimo essencial de Eagle, modificação alfa (aMEM), suplementada com 2 mmol de L-glutamina por 500 ml de aMEM, 20% vol / vol de FBS e 1% em vol / vol de penicilina / estreptomicina / anfotericina B.
  20. Repita etapa de centrifugação 1,18. Subsequentemente, remover o sobrenadante e ressuspender em 10 ml de meio de cultura fresco pré-aquecido.
  21. Contagem de células utilizando um hemocitómetro ou contador de células automatizado e placa a uma densidade elevada, uma vez que a maioria das células, nesta fase, não são aderentes plástico. A densidade de revestimento exacto depende da espécie e idade dos animais, por exemplo, as células de um pulmão de ratinho adulto são semeadas a 10 5 células / cm2, enquanto que as células de um pulmão cria de rato é suficientemente densa para uma densidade de sementeira de 1-2 x 10 4 células / cm2 . Use 0,2 ml de L-MSC meio de cultura / cm 2.
  22. Culturas de L-MSC numa atmosfera humidificada de 5% de O 2, 5% de CO2 a 37 ° C.
  23. Mudança de meio 24 horas após a inoculação inicial, e, posteriormente, a cada 3 dias após a lavagem uma vez com PBS. As células devem ser cultivadas até 80-90% de confluência, o que leva 3-5 dias, em média, dependendo do animal de origem. confluência superior irá promover a diferenciação em fibroblastos.

2. Seleção de Células CD146 + Lung estromais mesenquimais

  1. O revestimento de esferas magnéticas com anticorpo secundário
    1. O revestimento dos grânulos magnéticos com anticorpo secundário biotinilado, à razão de 10 ug de anticorpo secundário / contas magnéticas em 100 ul de fundo redondo estéreis criotubo de 2 ml em condições estéreis. Use anticorpo secundário 10 ul por esperados células 0,5 x 10 6, e utilizar um mínimo de 100 ul de contas magnéticas e anticorpo ug 10.
      Nota: O rácio de umtibodies usados ​​por volume de contas podem ser diferentes entre os fabricantes, por favor consulte as instruções do fabricante para as contas de escolha. Para este protocolo, consulte a tabela 1 para as contas e anticorpos que foram utilizados na otimização deste protocolo.
    2. Incubar numa misturadora rotativa amostra durante 30 minutos a 30 rotações / min (rpm), a temperatura ambiente.
    3. Ressuspender as contas em 1,5 ml estéril 0,1% de albumina de soro bovino (BSA) / PBS e transferir para um tubo redondo de 3 ml de fundo (tubo de citometria de fluxo). Lavar o frasco de congelação com um adicional de 1,5 mL de 0,1% BSA / PBS e transferir para o tubo 3 ml.
    4. Colocar o tubo em um íman apropriado e esperar 2 min, até que todos os grânulos estão ligados à parede posterior do tubo e a solução permanece límpida. Retirar do escoamento em repetir a lavagem com 3 mL de 0,1% BSA / PBS duas vezes.
    5. Ressuspender as esferas em 3 mL de 0,1% BSA / PBS e armazenar a 4 ° C, protegidos da luz. Utilizar no prazo de 5 dias.
  2. Etiquetas de CD146 + L-MSCs
    1. Colher as células mesenquimais após a lavagem com PBS utilizando uma solução não-tripsina suave.
      Nota: os volumes dependem do tamanho do frasco de cultura (0,2 ml / cm 2 ou meio PBS).
      1. Remover o meio de cultura e lavar as células três vezes com PBS estéril.
      2. Adicionar o volume apropriado de solução não-tripsina suave (ver Tabela 1). Incubar a 37 ° C na incubadora até as células terem individual, com cerca de 10 min quando se utiliza a solução na Tabela 1.
      3. Inactivar a enzima através da adição de meio de cultura L-MSC, e centrifuga-se durante 5 min a 500 x g.
    2. Remover o sobrenadante, as células ressuspender em 0,1% BSA / PBS e contagem das células com um hemocitómetro ou contador de células automatizado.
      Nota: O volume de 0,1% de BSA / PBS depende do tamanho do frasco de cultura: alvo de 5 ou 10 mL de 0,1% BSA / PBS.
    3. Repita o passo 2.2.2 e ressuspender o montante dedicado de células em 3 ml de 0,1% BSA / PBS (blocos unlocais de ligação específicos e mantém as células vivas). Manter as células no gelo.
    4. Preparar um tubo redondo 3 ml de fundo com o anticorpo anti-CD146 primário, e manter em gelo.
      Nota: A concentração de anticorpo primário que é adicionado com a quantidade específica de células depende do anticorpo que é usado. Para um anticorpo anti-CD146 de rato sugeriram ver Tabela 1.
    5. Adicionar o volume total de células a partir do passo 2.2.3 do tubo com o anticorpo primário. Fechar firmemente e incubar 30 min num misturador de amostras de rotação a 15 rpm, 4 ° C.
    6. Centrifugar as células durante 5 min a 500 xg, 4 ° C, remover sedimento celular sobrenadante e ressuspender em 3 mL de 0,1% BSA / PBS. etapa de centrifugação de repetição.
    7. Ressuspender as células em solução de 3 ml contendo esferas revestidas de anticorpo secundário que foi preparado de acordo com as instruções na Secção 2.1 e incubar 30 min num misturador de amostras de rotação a 15 rpm, 4 ° C.
  3. Seleccionar CD146 + L-MSC
    1. Coloque o tubo que contém o marcado CD146 + L-MSCs no ímã. As células positivas vai ser desenhada para a parte de trás do tubo. Sem mover o tubo ou tocar as contas, recolher o sobrenadante com as células negativas lentamente com uma pipeta de Pasteur estéril (estes podem ser recolhidas ou descartadas com base no design experimental).
    2. Remover o tubo do íman e ressuspender as células em 3 ml de 10% de BSA / PBS. Repita o procedimento de selecção descrito no passo 2.3.1. mais quatro vezes (passos Σ 5 seleção).
    3. Ressuspender o CD146 + L-MSCs em meio de cultura L-MSC pré-aquecida e retornar para o íman.
    4. Remover o sobrenadante, ressuspender em meio de cultura L-MSC e placa num frasco de cultura de tamanho apropriado (0,2 ml / cm 2). Como uma regra de ouro, células da placa no mesmo frasco de cultura de tamanho a partir do qual as células foram retiradas antes do grânulo-selecção. O número de CD146 + L-MSC, e, portanto, a densidade de revestimento, serádepender da idade, espécie e da estirpe do animal de origem. Sempre apontar para uma densidade de revestimento de ~ 5000 células / cm2.
      Nota: As contas não vai perturbar o crescimento celular e irá gradualmente desaparecer à medida que as células proliferam.

3. Células de congelação

  1. Utilizar os seguintes tipos de congelação: solução pentastarch 60% (10% pentastarch em 0,9% de NaCl), FBS a 20%, 12,5% CPDA-1, 2,5% de NaCl (0,9%), 5% de dimetilsulfóxido (DMSO) 22.
    Nota: Se nem todos os ingredientes estão disponíveis, uma solução contendo 5% de DMSO, 30% de FBS e 65% aMEM é uma boa alternativa.
  2. Ressuspender as células em 0,5 X 10 6 células / ml, da alíquota para criotubos de 1 ml de cada vez e congelar O / N à temperatura de -80 ° C utilizando um recipiente de congelação.
  3. Transferir para um tanque de armazenamento de azoto líquido no dia seguinte.

4. Células descongelamento

  1. Descongelar uma ampola de células num banho de água a 37 ° C durante 5 min.
  2. Ressuspender as células em 10 mlmeio de cultura pré-aquecido e centrifugar durante 5 minutos a 500 xg, 21 ° C.
  3. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em meio de cultura de 10 mL. Semear as células em uma cultura de células tampa ventilada frascos tratados a 5000 células / cm2 em 0,2 ml de meio / cm2 (por exemplo, 15 mL para um frasco de 75 2 cm).
  4. Células de cultura em 5% de O2, 5% de CO2, até 80-90% confluentes para a colheita e / ou o uso experimental. O excesso de confluência irá induzir a diferenciação. Quando semeando a 5000 células / cm 2, G-MSC irá chegar a 80-90% de confluência dentro de 3-4 dias de cultura.

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Resultados

Duas das características físicas mais fiáveis ​​de MSC, densidade e aderência ao plástico, são usadas na primeira parte deste protocolo para obter a fracção de células mesenquimais do pulmão que contém L-MSCs. Embora a interfase em gradiente de densidade incluem monócitos e macrófagos, além de células mesenquimais do pulmão, a aderência ao plástico seguido de 3-5 dias de cultura garante que apenas as células mesenquimais do pulmão permanecem. Na verdade, esta população de células express...

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Discussão

O isolamento e cultura de principal L-MSCs apresenta uma oportunidade para entender melhor a sua função ea sua interacção com outras populações de células em um nível celular, e seu papel no desenvolvimento do pulmão, a saúde ea doença. Isto é especialmente importante porque a falta de um marcador único específica destas células faz com que seja quase impossível para estudar estas células in situ. Tal como acontece com todas as populações de células primárias, deve-se ter em mente que estas células são mais pro...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

O JJPC é apoiado por uma bolsa de pós-doutorado do Canadian Institutes of Health Research (CIHR). O MAM recebe uma bolsa de mérito da Fundação Acadêmica Nacional Alemã - Studienstiftung des Deutschen Volkes e é apoiado por uma bolsa da EFCNI (Fundação Europeia para o Cuidado do Recém-Nascido). A BT é apoiada pelo CIHR, pela Canadian Lung Association, pela Stem Cell Network e pelo Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Protease NeutraWorthington Biochemical CorporationLS02104Prepare no dia do isolamento e armazene a 4 > C até o uso
Colagenase IWorthington Biochemical CorporationLS004196Prepare no dia do isolamento e armazene a 4 & C até o uso
DNAse ISigma-AldrichD5025Prepare no dia do isolamento e armazene a 4 ° C até o uso
Pentobarbital sódico (Euthanyl)Bimeda-MTC Animal Health Inc, Dublin,Irlanda-Use0,2 ml para filhotes de ratos entre 20-30 g; animais maiores podem precisar de mais.
Dulbecco' s PBS + piruvato de sódio + glicoseLife Technologies14287-072Muito importante usar este tipo de D-PBS, pois o cálcio e o magnésio presentes neste D-PBS facilitam a digestão enzimática
Ficoll-Paque PREMIUM (1.073 g/cm3)GE Healthcare17-5446-52Mídia de gradiente de densidade. Para obter uma boa interfase, é crucial que a estratificação da suspensão unicelular ocorra a uma >45> ângulo em velocidade muito baixa, e que a centrifugação subsequente seja feita a 19 °C.
&alfa; MEMSigma-AldrichM8042Quente em 37 ° C banho-maria antes do uso
200 mM L-GlutaminaLife Technologies25030-164
100x Antibiótico-AntimicóticoLife Technologies15240-062Penicilina/Estreptomicina/Fungizone
M-280 DynabeadsLife Technologies11205DGrânulos magnéticos
biotinilados policlonais coelho-anti-rato IgG Dako, Agilent TechnologiesE0464Anticorpo secundário biotinilado que corresponde ao anticorpo anti-rato CD146 descrito abaixo
Ímã DynaMag5Life Technologies12303DÍmã recomendado para uso com Dynabeads. NOTA: o ímã deve ser escolhido com base no fabricante' s instruções das contas magnéticas de sua escolha.
TrypLE express Life Technologies12605-028Alternativa suave sem tripsina, use 1 ml de TrypLE express/25 cm2 de área de superfície. Após o descolamento, 10 ml de meio de cultura L-MSC são suficientes para inativar 3 ml
de anticorpo TrypLE anti-rat CD146Lifespan Biosciences Inc.C3584112.5 μ l por 0,5 x 106
células Pentaspan (solução de pentaamido)Bristol-Myers SquibbCanadá-Podeser obtido através de serviços locais de doação de sangue ou departamentos de hematologia. Alternativamente, pode-se usar a solução de pentaamido PSI 20% (Preservation Solutions, PST001) diluída 1:1 com NaCl a 0,9%.
Recipiente de congelamento Mr. FrostyThermoFisher Scientific5100-0001Melhora a viabilidade ao congelar L-MSCs durante a noite a -80 ° O

Referências

  1. Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432, 332-337 (2004).
  2. Wei, H. J., et al. FOXF1 mediates mesenchymal stem cell fusion-induced reprogramming of lung cancer cells. Oncotarget. 5, 9514-9529 (2014).
  3. Marriott, S., et al. ABCG2pos lung mesenchymal stem cells are a novel pericyte subpopulation that contributes to fibrotic remodeling. Am J Physiol Cell Physiol. 307, 684-698 (2014).
  4. Collins, J. J., Thebaud, B. Lung mesenchymal stromal cells in development and disease: to serve and protect. Antioxid Redox Signal. 21, 1849-1862 (2014).
  5. McQualter, J. L., et al. Endogenous fibroblastic progenitor cells in the adult mouse lung are highly enriched in the sca-1 positive cell fraction. Stem Cells. 27, 623-633 (2009).
  6. Holmes, C., Stanford, W. L. Concise review: stem cell antigen-1: expression, function, and enigma. Stem Cells. 25, 1339-1347 (2007).
  7. Gottschling, S., et al. Mesenchymal stem cells in non-small cell lung cancer--different from others? Insights from comparative molecular and functional analyses. Lung Cancer. 80, 19-29 (2013).
  8. Bertoncello, I., McQualter, J. Isolation and clonal assay of adult lung epithelial stem/progenitor cells. Current protocols in stem cell biology. , Chapter 2, Unit 2G 1 (2011).
  9. Jun, D., et al. The pathology of bleomycin-induced fibrosis is associated with loss of resident lung mesenchymal stem cells that regulate effector T-cell proliferation. Stem Cells. 29, 725-735 (2011).
  10. Majka, S. M., et al. Identification of novel resident pulmonary stem cells: form and function of the lung side population. Stem Cells. 23, 1073-1081 (2005).
  11. Hennrick, K. T., et al. Lung cells from neonates show a mesenchymal stem cell phenotype. Am J Respir Crit Care Med. 175, 1158-1164 (2007).
  12. Salama, M., et al. Endothelin-1 governs proliferation and migration of bronchoalveolar lavage-derived lung mesenchymal stem cells in bronchiolitis obliterans syndrome. Transplantation. 92, 155-162 (2011).
  13. Hoffman, A. M., et al. Lung-derived mesenchymal stromal cell post-transplantation survival, persistence, paracrine expression, and repair of elastase-injured lung. Stem Cells Dev. 20, 1779-1792 (2011).
  14. Grisendi, G., et al. GMP-manufactured density gradient media for optimized mesenchymal stromal/stem cell isolation and expansion. Cytotherapy. 12, 466-477 (2010).
  15. Bardin, N., et al. S-Endo 1, a pan-endothelial monoclonal antibody recognizing a novel human endothelial antigen. Tissue antigens. 48, 531-539 (1996).
  16. Covas, D. T., et al. Multipotent mesenchymal stromal cells obtained from diverse human tissues share functional properties and gene-expression profile with CD146+ perivascular cells and fibroblasts. Exp Hematol. 36, 642-654 (2008).
  17. Russell, K. C., et al. In vitro high-capacity assay to quantify the clonal heterogeneity in trilineage potential of mesenchymal stem cells reveals a complex hierarchy of lineage commitment. Stem Cells. 28, 788-798 (2010).
  18. Sorrentino, A., et al. Isolation and characterization of CD146+ multipotent mesenchymal stromal cells. Exp Hematol. 36, 1035-1046 (2008).
  19. Halfon, S., Abramov, N., Grinblat, B., Ginis, I. Markers distinguishing mesenchymal stem cells from fibroblasts are downregulated with passaging. Stem Cells Dev. 20, 53-66 (2011).
  20. McGowan, S. E., Torday, J. S. The pulmonary lipofibroblast (lipid interstitial cell) and its contributions to alveolar development. Annu Rev Physiol. 59, 43-62 (1997).
  21. Dulbecco, R., Vogt, M. Plaque formation and isolation of pure lines with poliomyelitis viruses. The Journal of experimental medicine. 99, 167-182 (1954).
  22. Hayakawa, J., et al. 5% dimethyl sulfoxide (DMSO) and pentastarch improves cryopreservation of cord blood cells over 10% DMSO. Transfusion. 50, 2158-2166 (2010).
  23. Sarugaser, R., Hanoun, L., Keating, A., Stanford, W. L., Davies, J. E. Human mesenchymal stem cells self-renew and differentiate according to a deterministic hierarchy. PLoS One. 4, 6498(2009).
  24. Prockop, D. J. Repair of tissues by adult stem/progenitor cells (MSCs): controversies, myths, and changing paradigms. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17, 939-946 (2009).
  25. Respiratory Physiology. UCL. , Available from: https://www.ucl.ac.uk/anesthesia/people/RespPhysiolLong.pdf (2015).
  26. Boron, W. F., Boulpaep, E. L. Medical Physiology. 2nd edn. , Saunders Elsevier. (2009).
  27. Carreau, A., El Hafny-Rahbi, B., Matejuk, A., Grillon, C., Kieda, C. Why is the partial oxygen pressure of human tissues a crucial parameter? Small molecules and hypoxia. J Cell Mol Med. 15, 1239-1253 (2011).
  28. Heller, H., Brandt, S., Schuster, K. D. Determination of alveolar-capillary O2 partial pressure gradient by using 15NO. Nitric oxide : biology and chemistry / official journal of the Nitric Oxide Society. 12, 127-128 (2005).
  29. Mohyeldin, A., Garzon-Muvdi, T., Quinones-Hinojosa, A. Oxygen in stem cell biology: a critical component of the stem cell niche. Cell stem cell. 7, 150-161 (2010).
  30. Simon, M. C., Keith, B. The role of oxygen availability in embryonic development and stem cell function. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 285-296 (2008).
  31. Le, Q. T., et al. An evaluation of tumor oxygenation and gene expression in patients with early stage non-small cell lung cancers. Clin Cancer Res. 12, 1507-1514 (2006).
  32. Krampera, M., et al. Immunological characterization of multipotent mesenchymal stromal cells-The International Society for Cellular Therapy (ISCT) working proposal. Cytotherapy. , (2013).
  33. Corselli, M., et al. Identification of perivascular mesenchymal stromal/stem cells by flow cytometry. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 83, 714-720 (2013).
  34. Russell, K. C., et al. Cell-Surface Expression of Neuron-Glial Antigen 2 (NG2)and Melanoma Cell Adhesion Molecule (CD146) in Heterogeneous Cultures of Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells. Tissue engineering. Part A. , (2013).
  35. Lv, F. J., Tuan, R. S., Cheung, K. M., Leung, V. Y. Concise review: the surface markers and identity of human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 32, 1408-1419 (2014).
  36. Dagur, P. K., et al. Secretion of interleukin-17 by CD8+ T cells expressing CD146 (MCAM). Clinical immunology. 152, 36-47 (2014).
  37. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell stem cell. 3, 301-313 (2008).
  38. da Silva Meirelles, L., et al. Cultured human adipose tissue pericytes and mesenchymal stromal cells display a very similar gene expression profile. Stem Cells Dev. , (2015).
  39. Caplan, A. I. All MSCs are pericytes. Cell stem cell. 3, 229-230 (2008).
  40. Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. J Clin Invest. 123, 3025-3036 (2013).
  41. McGowan, S. E., McCoy, D. M. Regulation of fibroblast lipid storage and myofibroblast phenotypes during alveolar septation in mice. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 307, 618-631 (2014).
  42. Chen, L., Acciani, T., Le Cras, T., Lutzko, C., Perl, A. K. Dynamic regulation of platelet-derived growth factor receptor alpha expression in alveolar fibroblasts during realveolarization. Am J Respir Cell Mol Biol. 47, 517-527 (2012).
  43. Zhou, S., et al. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nat Med. 7, 1028-1034 (2001).
  44. Bonyadi, M., et al. Mesenchymal progenitor self-renewal deficiency leads to age-dependent osteoporosis in Sca-1/Ly-6A null mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 5840-5845 (2003).
  45. Ito, C. Y., Li, C. Y., Bernstein, A., Dick, J. E., Stanford, W. L. Hematopoietic stem cell and progenitor defects in Sca-1/Ly-6A-null mice. Blood. 101, 517-523 (2003).
  46. Chow, K., et al. Dysfunctional resident lung mesenchymal stem cells contribute to pulmonary microvascular remodeling. Pulmonary circulation. 3, 31-49 (2013).

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