Este protocolo descreve uma técnica de isolamento para a obtenção de células do estroma mesenquimal residentes primários de pulmão de ratos, através do uso de digestão enzimática, separação por gradiente de densidade, e aderência ao plástico CD146 + selecção esférulas magnéticas.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Neste artigo
Resumo
Resumo
células estromais mesenquimais (MSCs) são cada vez mais reconhecida pelo seu potencial terapêutico em uma ampla gama de doenças, incluindo doenças pulmonares. Além disso a utilização de medula óssea e as MSCs do cordão umbilical para a terapia com células exógenas, há também um interesse crescente na reparação e o potencial regenerador das MSCs de tecido residentes. Além disso, é provável que têm um papel no desenvolvimento normal do órgão, e foram papéis na doença, particularmente aqueles com uma natureza fibrótica atribuída. O principal obstáculo para o estudo destas MSCs residentes de tecido é a falta de um marcador claro para o isolamento e identificação destas células. A técnica de isolamento descritas aqui se aplica múltiplas características de MSCs residentes de pulmão (L-MSCs). No momento do sacrifício dos ratos, os pulmões são removidos e enxaguados várias vezes para remover o sangue. Após dissociação mecânica por bisturi, os pulmões são digeridos durante 2-3 hr usando uma mistura de colagenase de tipo I, tipo protease neutra e ADNase I. A obtainesuspensão de células única d é subsequentemente lavado e colocado em camadas sobre média densidade gradiente (densidade 1,073 g / ml). Após centrifugação, as células da interfase foram lavadas e plaqueadas em frascos tratados de cultura. As células são cultivadas durante 4-7 dias em fisiológico 5% de O2, 5% Condições de CO 2. Para esgotar fibroblastos (CD146 -) e para assegurar uma população de apenas, a selecção positiva de L-MSCs (CD146 +) para células CD146 + é realizado por meio de selecção esférulas magnéticas. Em resumo, este processo produz uma população de forma fiável primária G-MSC para posterior estudo e manipulação in vitro. Devido à natureza do protocolo, que pode facilmente ser convertidos a outros modelos animais experimentais.
Introdução
células estromais mesenquimais (MSCs) são cada vez mais reconhecida pelo seu potencial terapêutico em uma ampla gama de doenças, incluindo doenças pulmonares. Além disso a utilização de medula óssea e as MSCs do cordão umbilical para a terapia com células exógenas, há também um interesse crescente na reparação e o potencial regenerador das MSCs de tecido residentes. Durante o desenvolvimento, incluindo o pulmão, o mesênquima é uma importante fonte de sinais de desenvolvimento, e as MSCs residentes é um candidato provável para estar no centro desta. Além disso, estão surgindo evidências de que MSCs residentes são perturbados em doenças de adultos, incluindo o cancro <....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados com Animais da Universidade de Ottawa (animal ética protocolo Ohri-1696). cuidados com os animais foi realizada de acordo com as diretrizes institucionais.
1. Isolamento de células estromais mesenquimais do pulmão
- Preparar a mistura de enzima em um tubo de 50 ml: pesar 30 U protease neutra, 2.500 U de colagenase I e 500 U DNAse I. Estas quantidades suficientes para os pulmões de um rato adulto ou filhote de rato. Preparam-se no dia de isolamento e armazenar a 4 ° C até à sua utilização.
- Sacrifício filhotes de ratazana no dia 13 através de uma injecção intr....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Duas das características físicas mais fiáveis de MSC, densidade e aderência ao plástico, são usadas na primeira parte deste protocolo para obter a fracção de células mesenquimais do pulmão que contém L-MSCs. Embora a interfase em gradiente de densidade incluem monócitos e macrófagos, além de células mesenquimais do pulmão, a aderência ao plástico seguido de 3-5 dias de cultura garante que apenas as células mesenquimais do pulmão permanecem. Na verdade, esta população de células express.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
O isolamento e cultura de principal L-MSCs apresenta uma oportunidade para entender melhor a sua função ea sua interacção com outras populações de células em um nível celular, e seu papel no desenvolvimento do pulmão, a saúde ea doença. Isto é especialmente importante porque a falta de um marcador único específica destas células faz com que seja quase impossível para estudar estas células in situ. Tal como acontece com todas as populações de células primárias, deve-se ter em mente que estas células são mais pro.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
O JJPC é apoiado por uma bolsa de pós-doutorado do Canadian Institutes of Health Research (CIHR). O MAM recebe uma bolsa de mérito da Fundação Acadêmica Nacional Alemã - Studienstiftung des Deutschen Volkes e é apoiado por uma bolsa da EFCNI (Fundação Europeia para o Cuidado do Recém-Nascido). A BT é apoiada pelo CIHR, pela Canadian Lung Association, pela Stem Cell Network e pelo Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Protease Neutra | Worthington Biochemical Corporation | LS02104 | Prepare no dia do isolamento e armazene a 4 > C até o uso |
| Colagenase I | Worthington Biochemical Corporation | LS004196 | Prepare no dia do isolamento e armazene a 4 & C até o uso |
| DNAse I | Sigma-Aldrich | D5025 | Prepare no dia do isolamento e armazene a 4 ° C até o uso |
| Pentobarbital sódico (Euthanyl) | Bimeda-MTC Animal Health Inc, Dublin, | Irlanda-Use | 0,2 ml para filhotes de ratos entre 20-30 g; animais maiores podem precisar de mais. |
| Dulbecco' s PBS + piruvato de sódio + glicose | Life Technologies | 14287-072 | Muito importante usar este tipo de D-PBS, pois o cálcio e o magnésio presentes neste D-PBS facilitam a digestão enzimática |
| Ficoll-Paque PREMIUM (1.073 g/cm3) | GE Healthcare | 17-5446-52 | Mídia de gradiente de densidade. Para obter uma boa interfase, é crucial que a estratificação da suspensão unicelular ocorra a uma >45> ângulo em velocidade muito baixa, e que a centrifugação subsequente seja feita a 19 °C. |
| &alfa; MEM | Sigma-Aldrich | M8042 | Quente em 37 ° C banho-maria antes do uso |
| 200 mM L-Glutamina | Life Technologies | 25030-164 | |
| 100x Antibiótico-Antimicótico | Life Technologies | 15240-062 | Penicilina/Estreptomicina/Fungizone |
| M-280 Dynabeads | Life Technologies | 11205D | Grânulos magnéticos |
| biotinilados policlonais coelho-anti-rato IgG Dako | , Agilent Technologies | E0464 | Anticorpo secundário biotinilado que corresponde ao anticorpo anti-rato CD146 descrito abaixo |
| Ímã DynaMag5 | Life Technologies | 12303D | Ímã recomendado para uso com Dynabeads. NOTA: o ímã deve ser escolhido com base no fabricante' s instruções das contas magnéticas de sua escolha. |
| TrypLE express | Life Technologies | 12605-028 | Alternativa suave sem tripsina, use 1 ml de TrypLE express/25 cm2 de área de superfície. Após o descolamento, 10 ml de meio de cultura L-MSC são suficientes para inativar 3 ml |
| de anticorpo TrypLE anti-rat CD146 | Lifespan Biosciences Inc. | C35841 | 12.5 μ l por 0,5 x 106 |
| células Pentaspan (solução de pentaamido) | Bristol-Myers Squibb | Canadá-Pode | ser obtido através de serviços locais de doação de sangue ou departamentos de hematologia. Alternativamente, pode-se usar a solução de pentaamido PSI 20% (Preservation Solutions, PST001) diluída 1:1 com NaCl a 0,9%. |
| Recipiente de congelamento Mr. Frosty | ThermoFisher Scientific | 5100-0001 | Melhora a viabilidade ao congelar L-MSCs durante a noite a -80 ° O |
Referências
- Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432, 332-337 (2004).
- Wei, H. J., et al. FOXF1 mediates mesenchymal stem cell fusion-induced reprogramming of lung cancer cells. Oncotarget. 5....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
