Artigo de método

Extraindo Métricas para sistemas radiculares tridimensionais: Análise de volume e de superfície de In-solo X-ray tomografia computadorizada de dados

DOI:

10.3791/53788

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26 de abril de 2016

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1Environmental Molecular Sciences Laboratory

Neste artigo

Resumo

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Uma metodologia para a obtenção de informação sobre a estrutura de raiz visual e quantitativa a partir de dados de raios-X de tomografia computadorizada adquiridos em solo é apresentada.

Resumo

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As raízes das plantas desempenham um papel fundamental nas interações planta-solo-micróbio que ocorrem na rizosfera, bem como processos com implicações importantes para as alterações climáticas e manejo da cultura. informações de tamanho quantitativo em raízes em seu ambiente nativo é inestimável para estudar o crescimento das raízes e processos ambientais que envolvem plantas. De raios-X de tomografia computadorizada (XCT) foi demonstrado ser uma ferramenta eficaz para a verificação da raiz in situ e análise. Nosso objetivo foi desenvolver uma ferramenta sem custos e eficiente que se aproxima da superfície eo volume da raiz, independentemente da sua forma a partir de dados tridimensional tomografia (3D). A estrutura de raiz de um dropseed Prairie (heterolepis Sporobolus) espécime foi fotografada usando XCT. A raiz foi reconstruído, e a estrutura de raiz primária foi extraído a partir dos dados usando uma combinação de software licenciado e de código aberto. Uma malha poligonal isosurface foi então criado para facilitar a análise. Nós desenvolvemos tele autônomo aplicativo imeshJ, gerada em MATLAB 1, para calcular o volume de raiz e área de superfície da malha. As saídas de imeshJ são a área da superfície (em mm 2) e o volume (em mm 3). O processo, que utiliza uma combinação única de ferramentas de imagem para análise quantitativa da raiz, está descrito. Uma combinação de XCT e software de código aberto provou ser uma combinação poderosa de forma não invasiva amostras de raízes de plantas imagem, dados de raiz segmento, e extrair informação quantitativa a partir dos dados 3D. Esta metodologia de processamento de dados 3D devem ser aplicáveis ​​a outros sistemas de material / amostra onde há conectividade entre os componentes de atenuação de raios-X semelhantes e dificuldades surgem com a segmentação.

Introdução

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Roots, como parte da rizosfera 2-5, representam uma parte "invisível" da biologia da planta, desde o solo torna difícil para as raízes de imagem não-invasiva 6, 7. No entanto, estudar o crescimento das raízes e interação dentro do ambiente do solo é fundamental para a compreensão o crescimento das raízes / planta e ciclagem de nutrientes, o que por sua vez afetam arborização, segurança alimentar e climática. Raios-X a tomografia computadorizada (XCT) provou ser uma ferramenta valiosa para a imagiologia não invasivo de amostras de raízes de plantas em seus ambientes locais 8. A fim de medir o desenvolvimento de raiz e alterações dimensionais sob diferentes condições, e ser capaz de comparar dados de diferentes conjuntos de dados / espécimes, é preciso extrair informação quantitativa a partir dos dados de tomografia. A segmentação dos dados de raiz a partir do que o solo circundante, isto é, o isolamento da imagem de raiz de todo o resto em torno dele (incluindo, por exemplo, uma planta vizinha) é um passo crítico antes Accuanálise de tamanho de taxa pode ser feito. No entanto, uma abordagem limite simples é muitas vezes inviável para os dados de raiz. Os desafios associados com as raízes das plantas de imagem no solo incluem variações nas propriedades de atenuação de raios-X do material de raiz, ea sobreposição de valores de atenuação entre raízes e do solo causada pela água e matéria orgânica. Estas questões foram soberbamente abordada recentemente pelo Mairhofer et al. em seu visual ferramenta de acompanhamento RooTrak 7, 9. O próximo passo após uma segmentação de sucesso é a determinação precisa do volume de raiz e área de superfície. O volume pode ser estimado pela contagem do número de voxeis e multiplicando por tamanho em cubos dos voxels como mostrado anteriormente 7. Para uma determinação mais precisa da área de superfície da raiz e do volume, a iso-superficie do sistema radicular segmentado pode ser representado por uma malha de triângulos, usando um algoritmo conhecido como marcha cubos 10. O open-source ImageJ 11 pode ser empregado para aproximar thvolume de raiz e com base no algoritmo Marching Cubes. Para o melhor de nosso conhecimento, apenas um número limitado de software de código aberto dedicado a calcular os dados de volume / superfície à base de tomografia para espécimes de raiz no intervalo centímetro e acima está disponível 12. Um software de fonte aberta que olhou para 13 centra-se no crescimento radicular e destina-se a características celulares que permitem a análise do volume quantitativo em resolução de uma única célula. Alguns softwares de código aberto dedicado a sistemas de raiz toda a 14 é excelente para sistemas radiculares tubular de pequeno diâmetro com base na aproximação que a sua forma é realmente tubular. No entanto, alguns trabalhos com imagens em 2D e são incapazes de lidar com 3D pilhas 14. Além disso, a forma aproximação tubular pode não ser válida quando os sistemas radiculares com superfícies ásperas e formas não uniformes, tais como os de árvores, são estudadas. Outra abordagem 15 usa duas dimensões (2D) sequências de imagens de rotação inovadora contornando the precisa de um scanner CT caro. Ele mede, registros e exibe raiz comprimentos sistema. O software testámos daqueles só está disponível comercialmente 16-18; um não parece ser capaz de lidar com imagem 3D pilhas 16, o segundo é uma ferramenta de área foliar e medição do comprimento radicular 17, enquanto o terceiro é baseado na análise de cor 18. Com base nesse levantamento, sugerimos que uma opção sem custo que se aproxima da superfície eo volume da raiz, independentemente da sua forma a partir de dados de tomografia 3D é desejável.

Com base na RooTrak livremente disponível e ImageJ, temos desenvolvido um programa, chamado imeshJ (ver arquivo de código Suplementar), que processa uma malha isosurface (arquivo de estereolitografia superfície) gerado a partir de dados de raiz segmentados, e calcula a área de volume e superfície da raiz, fazendo cálculos geométricos simples sobre os dados de malha de índice triângulo. Aqui nós relatamos um método que combina o uso de imagens XCT,reconstrução dos dados e visualização (software CT Pro 3D e VG Studio), a segmentação da raiz da amostra do solo nos dados 3D (ImageJ software open-source e RooTrak), e extração das informações de superfície e volume a partir de uma malha triangular (ImageJ eo imeshJ código de computador).

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Protocolo

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Atenção: O funcionamento de um scanner de tomografia de raios-X requer tanto a formação de radiação em geral, e treinamento de segurança de radiação específica do instrumento. Todos os procedimentos correspondentes relevantes para o laboratório do experimentador deve ser seguido.

Imagem 1. Raiz

Nota: Esta etapa descreve a imagem de um espécime grama mantidos no seu solo original em um vaso de plástico tubular (um tubo de plástico com um diâmetro de 40 mm, uma altura de 210 mm e espessura de parede de cerca de 2 mm).

  1. Coloque plantas envasadas no manipulador de amostra do instrumento a uma distância desejada para ampliação alvo. Para obter uma planta de um suporte de um diâmetro de 2 polegadas, a amostra a distância fonte deve ser de cerca de 3 polegadas (7 cm).
  2. Ajuste as configurações de digitalização de raios-X para atingir a cor ideal (nível de cinza) o contraste da imagem detector in. Nota: Estas definições estão disponíveis no software de controle de instrumento utilizado.
    1. configurações de energia de raios-X Set; 85 kV e 190 uA foram utilizados neste exameple.
    2. Definir tempo de exposição. Aqui, utilizou-se um tempo de exposição relativamente longo de 1 seg para uma melhor relação sinal-ruído.
    3. Defina o número de projeções e quadros por projeção; 4 quadros por projecção para um total de 3.142 projeções é sugerido para boas estatísticas de dados.
    4. Executar uma correção de sombreamento usando as condições de medição indicados acima, selecionando a guia "correção Shading", e clicar em "Criar".
      Nota: A correcção de sombreado compensa a variação na resposta dos pixels do dispositivo de imagem quando iluminado com um conjunto de fluxo constante de raios-X. O processo leva imagens em branco (com a amostra removida do caminho do feixe) com o feixe de raios-X é ligado e com o feixe de desligado. Esta correção é aplicada a todas as imagens recolhidas.
    5. Selecione a opção "Minimizar artefactos anel" (também chamado "modo de vaivém"); a amostra será rodado em passos angulares, enquanto as imagens de projeção são adquiridos. Isto leva a DATa aquisição a uma taxa mais lenta, mas ajuda a eliminar artefactos anel.
    6. Inicie a digitalização, clicando no botão "Acquire" sob a guia Acquisition (com as configurações descritas acima, coleção de imagens levará cerca de 4 horas).

Reconstrução 2. Dados

Nota: Esta seção descreve a reconstrução de dados de volume 3D a partir de imagens RAW (radiografias da tomografia computadorizada).

  1. Carregar os dados em bruto para o programa.
  2. Compare primeira e última imagem (que deve ser quase idêntico ao da última imagem é tomada depois de uma rotação da amostra 360 o) para garantir que o espécime não se mexeu ou as configurações de digitalização não se alterou durante a aquisição de dados.
  3. Calcular o centro de rotação (COR), selecionando a guia "centro de rotação", e clicar em "Iniciar"; opções de uso "Automatic" COR encontrar com "alta qualidade" precisão, e "Dual" (superior e inferior) slice seleição para o cálculo COR.
  4. Selecione o volume da amostra a ser reconstruída: selecione a guia "Volume", e editar as janelas de seleção de volume usando as miniaturas.
  5. Execute reconstrução para criar o arquivo de volume contendo dados 3D, clicando em "Iniciar".

3. Data Processing / Segmentação

Nota: Esta seção descreve as medidas a serem tomadas para preparar os dados reconstruídos para processamento adicional na RooTrak programa para rastrear raízes como eles se ramificam através do solo, e isolar as raízes de qualquer material circundante para produzir uma pilha de imagens binárias de apenas o própria raiz.

  1. Processamento de dados de volume em ImageJ para preparar um RooTrak pilha de processável:
    1. Carregar o arquivo de volume em ImageJ.
    2. Otimizar o contraste de imagem entre raiz e solo, ajustando as configurações de brilho e contraste (Clique na imagem / Ajustar / Brilho / Contraste). Quando a região de interesse dentro da imagem é visível e Claramente distinguíveis, as configurações são consideradas otimizado.
    3. Salvar como uma pilha de imagens em JPEG, BMP ou PNG.
  2. Processamento na RooTrak para o segmento de raiz:
    1. Carregar a pilha de em RooTrak (vá em "Ferramentas", e pressione "Tracker").
    2. Definir pontos de semente dentro de root: clique vários pontos dentro de cada uma das secções de raiz pertinentes visíveis na vista superior fatia dos dados de volume.
    3. Defina os parâmetros Tracker "Suavidade" e "similaridade" para 0,3 e 0,8, respectivamente.
    4. Executar a função de rastreamento. Esta seguirá a raiz da fatia de imagem superior todo o caminho até a fatia inferior.
    5. Depois de ver os dados de volume, selecionar o número de fatias de acordo com o volume de dados utilizável; Neste caso, o acompanhamento foi parado em fatias 200, equivalente a uma profundidade de 6,2 mm, em que as fronteiras de raiz adoeceu-definido (a imagem da raiz rastreados começaram a misturar-se que do solo).
      Note opilha de imagens produzidas serão salvos automaticamente para onde quer que o diretório de saída foi criado.

4. Volume e Análise de Superfície

Nota: Esta etapa descreve a geração de malha isosurface da pilha imagem criada por RooTrak.

  1. Converter pilha de imagens de RooTrak em um formato de imagem binária em ImageJ. Selecione "Processo", então "Binário", depois "Make Binary".
  2. Use o plugin ImageJ open-source, BoneJ, para criar a malha triangular; em ImageJ selecione "Plugins", então "BoneJ", então "isosuperfície".
  3. Defina "Resampling" e "Threshold" a 6 e 120, respectivamente (as configurações padrão). Marque a opção "Mostrar superfície", e pressione o botão "OK".
  4. Sobre o "visualizador 3D", clique na guia Arquivo, em seguida, em "superfícies de Exportação", em seguida, salvar como "STL (binary)".
  5. Abrir imeshJ, selecione o arquivo STL e digite o tamanho voxel em microns. Clique em "CÁrea de Superfície alculate "para adquirir área de superfície total de raízes amostra em mm 2. Da mesma forma, clique em" Calcular Volume "para obter volume total raiz amostra em mm3.

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Resultados

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A amostra que consiste em duas hastes de relva nativa Prairie dropseed (Sporobolus heterolepis) e o solo original em torno dele foi feita a partir de uma área residencial e colocado num pequeno suporte em forma de tubo visto na Figura 1. O tamanho reconstruída do voxel de dados foi de aproximadamente 31 um x 31 um x 31 um. O arquivo de volume reconstruído foi usada para criar uma pilha de imagens a partir de uma orientação selecionada (vista superior) utilizando...

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Discussão

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Uma combinação de tomografia computadorizada por raios X e vários programas de código aberto provou ser uma combinação poderosa de forma não invasiva amostras de raízes de plantas imagem, dados de raiz segmento, e extrair informação quantitativa (área de superfície e volume) a partir dos dados 3D. A nossa capacidade para visualizar e medir características está sempre limitada pela resolução da digitalização, bem como por limitações do software RooTrak. No entanto, resolução de digitalização foi suficiente para capturar ...

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Divulgações

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Não temos nada a divulgar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi realizado no Laboratório de Ciências Moleculares Ambientais, uma instalação científica nacional patrocinada pelo Escritório de Pesquisa Biológica e Ambiental do Departamento de Energia e localizada no Laboratório Nacional do Noroeste do Pacífico.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
X-Tek/Metris XTH 320/225 kV Scanner de tomografia de raios Xde metrologia
Inspect XNikon MetrologySoftware de controle de instrumentos
CT Pro 3DNikon Softwareversão XT 2.2
VG Studio MAXVisual Graphics GmbHSoftware de visualização para volumes 3D, versão 2.1.5
ImageJCódigo abertoSoftware de processamento e análise de imagem, versão 1.6
RooTrakde código, versão 0.3.1-b1 beta
imeshJEMSLMATLAB script desenvolvido pelos autores
grama de semente de pradariaAmostra obtida do solo em área residencial
Nikon de reconstrução de metrologia, Software de segmentação de raiz abertoAmostra de

Referências

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