Este trabalho descreve um protocolo in vitro de diferenciação para produzir pigmentadas, melanócitos maduros a partir de células-tronco pluripotentes humanas através de uma crista neural e melanoblasto estágio intermediário usando um protocolo sem alimentador de 25 dias.
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Artigo de método
Derivação sem alimentador de melanócitos a partir de células-tronco pluripotentes humanas
Neste artigo
Resumo
Resumo
As células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) representam uma plataforma para estudar o desenvolvimento humano in vitro em condições normais e de doença. Os pesquisadores podem direcionar a diferenciação de hPSCs no tipo de célula de interesse, manipulando as condições de cultura para recapitular os sinais observados durante o desenvolvimento. Um desses tipos de células é o melanócito, uma célula produtora de pigmento de origem na crista neural (NC) responsável por proteger a pele contra a irradiação UV. Este protocolo apresenta uma extensão de um protocolo de diferenciação de crista neural in vitro atualmente disponível de hPSCs para diferenciar ainda mais NC em melanócitos totalmente pigmentados. Os precursores de melanócitos podem ser enriquecidos a partir do protocolo Neural Crest por meio de uma exposição cronometrada a ativadores de sinalização WNT, BMP e EDN3 sob condições de inibição dupla de SMAD. Os precursores de melanócitos resultantes são então purificados e amadurecidos em melanócitos totalmente pigmentados por cultura em meio seletivo. Os melanócitos resultantes são totalmente pigmentados e coram adequadamente para proteínas características de melanócitos maduros.
Introdução
Células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) fornecer uma plataforma para imitar diferenciação normal em uma forma escalável para modelagem de doença, o rastreio de drogas e terapias de substituição celular 1-6. De particular interesse, hPSCs abrir caminhos para o estudo difícil isolar ou tipos de células raras / transitórios, onde amostras de pacientes são escassos. Células-tronco pluripotentes Além disso, induzidas (iPSCs) permitir aos investigadores estudar o desenvolvimento e modelagem de doença de uma maneira específica paciente para desvendar os mecanismos exclusivos 1,2,7-11. O protocolo previamente publicado para a diferenciação dos mela....
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Protocolo
NOTA: O protocolo de melanócitos descrito aqui foi demonstrada pela primeira vez por Mica et al.
1. Preparação de meio de cultura, revestido Pratos e manutenção de hPSCs
- médio Preparação
Nota: Armazenar todas meio a 4 ° C no escuro, durante até 2 semanas. Filtrar todo o meio para esterilização.- Prepare DMEM / FBS a 10%. Misturar 885 mL de DMEM, 100 ml de FBS, 10 ml de Pen / Strep e 5 ml de L-Glutamina. Filtro para esterilização.
- Prepare hESC-médio. Misturar 800 mL de DMEM / F12, KSR 200 mL, 5 mL de L-Glutamina, 10 ml de solução de MEM mínimo essencial aminoácidos, 1 ml de p-mercaptoetanol, e 5 mL de Pe....
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Resultados
Este protocolo fornece um método para derivar melanócitos maduros, totalmente pigmentadas de hPSCs em um livre-alimentador, eficiente, e reprodutível modo in vitro. Em contraste com o fang et ai. Protocolo previamente estabelecido para os melanócitos HPSC-derivados, o protocolo descrito não requer meio condicionado e reduz a exigência de tempo. O protocolo fang et al. Utilizaram meio condicionado de uma linha celular murino de produção de Wnt3a e levou até 6 se.......
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Discussão
Para a diferenciação de melanócitos bem sucedida de hPSCs as seguintes sugestões deve ser tomado em consideração. Em primeiro lugar, é essencial para trabalhar sob condições de cultura estéreis em todos os momentos. Além disso, é importante para iniciar com pluripotentes, hPSCs totalmente indiferenciadas; se a população começando contém células diferenciadas o rendimento será invariavelmente cair como os contaminantes não pode ser dirigida para melanócitos e pode mesmo perturbar ainda mais as células adequadamente difer.......
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Divulgações
Os autores não têm interesses conflitantes para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa para pesquisadores de melanoma do M. Nicolay Fundação Joanna e pelos Institutos Nacionais de Saúde sob Ruth Service Award L. Kirschstein National Research F31. Este trabalho foi ainda apoiada por meio de doações de NYSTEM ea iniciativa de células estaminais Tri-institucional (Starr Foundation).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| apo transferrina humana | Sigma | T1147 | |
| Ácido Ascórbico (L-AA) | Sigma | A4034 | 100 mM |
| B27 (Suplemento B27) | Invitrogen | 17504044 | |
| β-Mercaptoetanol | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | 10 mg/ml |
| BMP4 | R& D Systems | 314-bp | |
| CHIR99021 | Tocris-R& D Systems | 4423 | 6 mM |
| Toxina da cólera | Sigma | C8052 | 50 mg/ml |
| cAMP (cyclicAMP) | Sigma | D0627 | 100 mM |
| Dexametasona | Sigma | D2915-100MG | 50 μ M |
| DMEM - Meio Eagle Modificado Dulbecco's | Gibco-Life Technologies | 11985-092 | |
| DMEM/F12 - Meio Eagle Modificado Dulbecco: Mistura de Nutrientes F-12 | Gibco-Life Technologies | 1133--032 | |
| DMEM/F12 pó | Invitrogen | 12500-096 | |
| EDN3 (Endotelina-3, humano) | American Peptide Company | 88-5-10B | 100 μ |
| M Fibronectina | BD Biosciences | 356008 | 200 μ g/ml |
| gelatina (PBS sem Mg/Ca) | internamente | 0,1% em PBS | |
| Glicose | Sigma | G7021 | |
| Insulina humana | Sigma | I2643 | |
| ITS+ Suplemento de Cultura Universal Premix | BD Biosciences | 354352 | |
| KSR (Knockout Serum Replacement) | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | |
| Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
| L-Glutamina | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | 100 mM |
| Baixa glicose DMEM | Invitrogen | 11885-084 | |
| Matriz matrigel | BD Biosciences | 354234 | Dissolver 1:20 em DMEM/F12 |
| MCDB201 Medium | Sigma | M6770 | |
| MEM solução de aminoácidos essenciais mínimos | Gibco-Life Technologies | 11140-080 | |
| Fibroblastos embrionários de camundongo (7 milhões de células/frasco) | GlobalStem | GSC-8105M | |
| Laminina de camundongo-I | R& D Systems | 3400-010-01 | 1 mg/ml |
| Meio neurobasal | Invitrogen | 21103049 | |
| Penicilina/Estreptomicina | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | 10.000 U/ml |
| Poly-L Omithin hydrobromide | Sigma | P3655 | 15 mg/ml |
| Progesterona | Sigma | P8783 | 0,032 g em 100 ml 100% etanol |
| Cloridrato de putrescina | Sigma | P5780 | |
| FGF2 (FGF humano recombinante básico) | R & D Systems | 233-FB-001MG/CF | 10 mg/ml |
| SB431542 | Tocris-R& D Systems | 1814 | 10 mM |
| Selenite | Sigma | S5261 | |
| Bicarbonato de Sódio | Sigma | S5761 | |
| SCF (Fator de Célula-Tronco, humano recombinante) | Peprotech Inc. | 300-07 | 50 μ g/ml |
| TYRP1 (G-17) Anticorpo | Santa Cruz | 10443 | 1:200 |
| TYRP2 Anticorpo | Abcam | 74073 | 1:200 |
| Tripsina-EDTA (0,05%) | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
| Y-27632 dicloridrato | Tocris-R& D Systems | 1254 | 10 mM |
Referências
- Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature.
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Reimpressões e permissões
