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Artigo de método

Derivação sem alimentador de melanócitos a partir de células-tronco pluripotentes humanas

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⸱

DOI:

10.3791/53806

⸱

3 de março de 2016

 ,  , 
1The Center for Stem Cell Biology, Developmental Biology Program, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, 2Cancer Biology and Genetics Program, Gerstner Sloan-Kettering Graduate School, Sloan-Kettering Institute for Cancer Research, 3Thermo Fisher Scientific

Neste artigo

Resumo

Este trabalho descreve um protocolo in vitro de diferenciação para produzir pigmentadas, melanócitos maduros a partir de células-tronco pluripotentes humanas através de uma crista neural e melanoblasto estágio intermediário usando um protocolo sem alimentador de 25 dias.

Resumo

As células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) representam uma plataforma para estudar o desenvolvimento humano in vitro em condições normais e de doença. Os pesquisadores podem direcionar a diferenciação de hPSCs no tipo de célula de interesse, manipulando as condições de cultura para recapitular os sinais observados durante o desenvolvimento. Um desses tipos de células é o melanócito, uma célula produtora de pigmento de origem na crista neural (NC) responsável por proteger a pele contra a irradiação UV. Este protocolo apresenta uma extensão de um protocolo de diferenciação de crista neural in vitro atualmente disponível de hPSCs para diferenciar ainda mais NC em melanócitos totalmente pigmentados. Os precursores de melanócitos podem ser enriquecidos a partir do protocolo Neural Crest por meio de uma exposição cronometrada a ativadores de sinalização WNT, BMP e EDN3 sob condições de inibição dupla de SMAD. Os precursores de melanócitos resultantes são então purificados e amadurecidos em melanócitos totalmente pigmentados por cultura em meio seletivo. Os melanócitos resultantes são totalmente pigmentados e coram adequadamente para proteínas características de melanócitos maduros.

Introdução

Células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) fornecer uma plataforma para imitar diferenciação normal em uma forma escalável para modelagem de doença, o rastreio de drogas e terapias de substituição celular 1-6. De particular interesse, hPSCs abrir caminhos para o estudo difícil isolar ou tipos de células raras / transitórios, onde amostras de pacientes são escassos. Células-tronco pluripotentes Além disso, induzidas (iPSCs) permitir aos investigadores estudar o desenvolvimento e modelagem de doença de uma maneira específica paciente para desvendar os mecanismos exclusivos 1,2,7-11. O protocolo previamente publicado para a diferenciação dos melanócitos a partir hPSCs requer até 6 semanas de diferenciações e envolve a cultura de células com meio condicionado de células L-12 Wnt3a. O protocolo apresentado pela primeira vez por Mica et al. E descrito aqui produz células pigmentadas em três semanas e remove a ambiguidade e inconsistências associados com meio condicionado.

ar melanócitose derivados da crista neural, uma população de células migratórias únicas para os vertebrados. A crista neural é definido durante a gastrulação e representa uma população de células na borda da placa neural, na fronteira entre a ectoderme neural e não neurais. Durante neurulação, o tecido nervoso se desenvolve a partir de uma placa neural para formar dobras neurais, que convergem na linha média dorsal, resultando no tubo neural 13,14.

As células da crista neural emergir da placa de tecto do tubo neural, em frente da notocorda, e submetido a uma epitelial para mesenquimal antes de migrar para longe para dar origem a uma população diversa de células diferenciadas. O destino das células da crista são definidas em parte por a localização anatómica da placa para telhado, ao longo do eixo do corpo do embrião. derivados de células da crista neural incluem linhagens característicos de ambos mesoderme (células do músculo liso, os osteoblastos, os adipócitos, condrócitos e células da ectoderme) (melanócitos, C Schwannells, neurônios) 14. células estaminais da crista neural regulam positivamente o factor de transcrição SOX10 e pode ser isolado por meio de células activada por fluorescência, com anticorpos para p75 e HNK1.

As células da crista neural fadado a tornar-se melanócitos passar por uma fase melanoblasto e upregulate KIT e MITF (fator de transcrição associada à microftalmia) 6,21 MITF é um regulador mestre do desenvolvimento de melanócitos e é um fator de transcrição responsável por controlar grande parte do desenvolvimento de melanócitos 22- 24. melanoblastos humanos migram para a camada basal da epiderme, onde residem quer no bojo cabelo ou rodeado pelos queratinócitos na epiderme (unidades de formação de pigmentação) para servir como precursores para os melanócitos maduros, pigmentadas. A diferenciação e maturação de melanoblastos em melanócitos pigmentados ocorre concomitante com a colonização do bulbo capilar e expressão da via de produção de melanina (TYRP1, Tyr, e OCA2PMEL) 25,26.

Isolamento de melanócitos humanos e melanoblastos de pacientes é cara, difícil e limitando a quantidade. Este protocolo permite aos pesquisadores para diferenciar hPSCs (induzido ou embrionária) em melanócitos ou precursores de melanócitos em um método bem definido, rápida, reprodutível, escalável e de baixo custo, sem separação de células. O protocolo foi usado anteriormente para identificar defeitos de doenças específicas ao diferenciar iPSCs de pacientes com distúrbios de pigmentação.

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Protocolo

NOTA: O protocolo de melanócitos descrito aqui foi demonstrada pela primeira vez por Mica et al.

1. Preparação de meio de cultura, revestido Pratos e manutenção de hPSCs

  1. médio Preparação
    Nota: Armazenar todas meio a 4 ° C no escuro, durante até 2 semanas. Filtrar todo o meio para esterilização.
    1. Prepare DMEM / FBS a 10%. Misturar 885 mL de DMEM, 100 ml de FBS, 10 ml de Pen / Strep e 5 ml de L-Glutamina. Filtro para esterilização.
    2. Prepare hESC-médio. Misturar 800 mL de DMEM / F12, KSR 200 mL, 5 mL de L-Glutamina, 10 ml de solução de MEM mínimo essencial aminoácidos, 1 ml de p-mercaptoetanol, e 5 mL de Pen / Strep. Após filtração adicionam-se 10 ng / ml de FGF-2.
    3. Prepare forma KSR-diferenciação: Misturar 820 mL de DMEM KO, KSR 150 ml, 10 ml de L-Glutamina, 10 ml de Pen / Strep, 10 ml de solução de MEM mínimo essencial aminoácidos e 1 ml β-mercaptoetanol. Filtro para esterilização.
    4. Prepare meio N2-diferenciação. Dissolve-se 12 g de DMEM / F12 de pó in 980 ml ​​de dH 2 O. Adicionar 1,55 g de glucose, 2 g de bicarbonato de sódio e 100 mg de transferrina humana Apo. Misturar 2 ml de dH2O com 25 mg de insulina humana e 40 ul de NaOH 1 N; uma vez dissolvido, adicione a mistura para o meio. Adicionam-se 100 ul de di-hidrocloreto de putrescina, 60 ul de selenito, 100 ul de progesterona. Levar o volume final a 1 litro com dH2O antes da filtragem.
    5. Prepare médio de melanócitos completa. Combinar 50% de meio Neurobasal, 30% de DMEM de baixa glucose, e 20% MCDB201. Para este complemento: 0,8% ITS +, 250 nM de L-glutamina, 100 ^ M do ácido ascórbico (L-AA), 50 ng / ml de toxina da cólera, 50 ng / mL de SCF, 0,05 uM de dexametasona, 100 nM EDN3, 4 ng / FGF2 ml . Filtrar em condições estéreis, em seguida, adicionar os restantes reagentes: 2% de suplemento B27, 25 ng / ml de BMP4, CHIR99021 3 uM, 500 uM de cAMP.
  2. Revestimento de placas de cultura
    1. Realizar o revestimento utilizando proteína gelatinosa, como Matrigel. Após a abertura, alíquota e congelar Matrigel em 1 ml partes para evitar congelamento repetitivo degelo cycles. Descongelar e re-suspender-se uma alíquota congelada de 1 ml com 19 ml de DMEM / F12. Placa de 5 ml para uma placa de 10 cm. Incubar os pratos durante 1 h à TA. Aspirar a proteína gelatinosa imediatamente antes do plaqueamento das células e lavagem com meio DMEM / F12.
    2. Realizar revestimento utilizando Poly-L ornithin bromidrato / rato laminina-I / fibronectina (PO / Lam / FN). Revestimento prato com PBS contendo 15 ug / ml de poli-L ornithin bromidrato. Incubar O / N a 37 ° C numa incubadora humidif içada. Aspirar a solução e lava-se as placas três vezes com PBS antes do revestimento com PBS contendo 1 ug / ml de laminina de rato-I e 2 ug / ml de fibronectina. Incubar os pratos de O / N a 37 ° C numa incubadora humidif içada.
      1. Antes do plaqueamento de células, aspirar a solução e deixar secar completamente as placas sem a tampa na capa de cultura de tecido. Permitir que as placas a secar durante cerca de 10-15 min.
        Nota: Os pratos são secos e prontos para revestimento célula quando as estruturas cristalinas aparecem na superfície, por olho. o platES pode ser mantido com PBS contendo LAM / FN no incubador durante duas semanas, desde que o líquido se evapore. As placas podem ser mantidas secas à temperatura ambiente durante algumas horas.
  3. Manutenção de hPSCs
    Nota: hPSCs são mantidas em 0,1% de gelatina e mouse mitoticamente inativada fibroblastos embrionários (MEFs) em hESC-médio. As células devem ser divididas a cada 6-8 dias.
    1. Bata de um prato de 10 centímetros, com 0,1% de gelatina em PBS à temperatura ambiente durante 5 min.
    2. Descongelar MEFs congeladas rapidamente num banho de água a 37 ° C.
    3. Aspirar a gelatina e a chapa células. MEFs em placas a uma densidade de ~ 50.000 células / cm2 em DMEM / 10% de FBS. Incubar a 37 ° MEFs CO / N antes da adição hPSCs.
    4. Aspirar o% FBS DMEM / 10 da placa MEF preparado, lavar placa com PBS e adicionar 10 ml hESC-médio com hPSCs. A passagem hPSCs na proporção de 1: 5/10 dependendo da densidade antes da passagem em.
      Nota: Se as hPSCs estão sendo descongeladas ou passadas como células individuais, supmentação com 10 mM dicloridrato de Y-27632 (Rocki) até a primeira passagem.
    5. Alimentar as células diariamente com hESC-meio fresco 10 ml.
    6. Antes de iniciar uma diferenciação remover quaisquer colónias pluripotentes que aparecem para conter células diferenciadas, bordas irregulares, ou centros transparentes 28. Mecanicamente desalojar e aspirar as colônias irregulares com uma pipeta sob uma capela de fluxo laminar com um microscópio de dissecação.

2. chapeamento de hPSCs para Diferenciação

Nota: As condições de diferenciação são descritos para placas de 10 cm.

  1. Preparar 10 cm pratos de Matrigel antes de iniciar a diferenciação, tal como descrito no passo 1.3.1.
  2. Quando chapeamento hPSCs para uma diferenciação começar com uma chapa de hPSCs a uma densidade pronto para a passagem (~ 80% confluentes) aspirar o CTEh-forma, lava-se com PBS e adicionar 3 ml de 0,05% de tripsina-EDTA para as células.
  3. Agitar vigorosamente o horizontall pratoy por 2 min enquanto visualiza sob o microscópio até que as MEFs levante como células individuais. As colônias HPSC deve permanecer solidários como colônias.
  4. Aspirar o tripsina após os MEFs ter levantado mas antes das colônias hPSCs desanexar.
  5. Adiciona-se 10 ml de células estaminais embrionárias humanas, meio contendo 10 uM Y-27632 dicloridrato à placa e separar as células por pipetagem para cima e para baixo sobre as colónias.
  6. Aspirar a solução de Matrigel do prato de 10 centímetros, preparado no passo 2.1 e lava-se com meio DMEM / F12 para remover aglomerados. A chapa hPSCs a uma proporção de 1: 2 para a placa de Matrigel. Adicionar hESC-meio contendo 10 mM Y-27632 dicloridrato de até 10ml. Incubar a 37 ° CO / N.
    Nota: O chapeamento deve resultar em cerca de 100.000 células / cm2.

3. Indução da diferenciação neural

Nota: A diferenciação deve ser iniciado (dia 0), quando as hPSCs estão 80% confluentes. As células podem ser alimentados diariamente com células estaminais embrionárias humanas de médiocontendo 10 uM Y-27632 dicloridrato até começando a diferenciação.

  1. No dia 0 e no dia 1, alimentar as células com 10 ml de meio KSR-diferenciação contendo 100 nM e 10 uM LDN193189 SB431542.
  2. No dia 2, alimentar as células com 10 ml de meio KSR-diferenciação contendo 100 nM LDN193189, SB431542 10 mM e 3 uM CHIR99021.
  3. No dia 3, alimentar as células com 10 ml de meio KSR-diferenciação contendo 10 uM e 3 | iM SB431542 CHIR99021.
  4. Nos dias 4 e 5 alimentar as células com 15 ml de meio KSR-diferenciação de 75% e meio N2-diferenciação 25% contendo 3 uM CHIR99021.
    Nota: Não se assuste para ver uma grande quantidade de morte celular em termos de células flutuantes. Isso é normal e esperado.
  5. Nos dias 6 e 7 alimentar as células com 15 ml de meio KSR-diferenciação de 50% e meio N2-diferenciação de 50%, tanto contendo 3 uM CHIR99021, 25 ng / ml BMP4, e 100 nM EDN3.
  6. No dia 89 e alimentar as células com 20 ml de meio KSR-diferenciação de 25% e meio N2-diferenciação de 75%, tanto contendo 3 uM CHIR99021, 25 ng / ml BMP4, e 100 nM EDN3.
  7. Nos dias 9 e 10 preparam pratos PO / Lam / FN, conforme indicado no ponto 1.2.2 para o re-plaqueamento das células no dia 11.
  8. No dia 10 as células de alimentação com 20 ml de meio N2-diferenciação contendo 3 uM CHIR99021, 25 ng / ml BMP4, e 100 nM EDN3.

4. repique em gotas para especificação NC

  1. No dia 11 aspirado Lam / FN dos PO / LAM / placas FN preparados e secar completamente.
  2. Remova o meio a partir das células Dia 11, lava-se com PBS e adicione a solução de separação celular tal como 4 ml Accutase por placa de 10 cm. Incubar durante 25 min a 37 ° C.
  3. Adicionar 5 ml de meio completo melanócito para o prato e ressuspender as células por pipetagem manualmente cima e para baixo com uma pipeta de 10 mL, até todas as células terem levantado do prato. Transferir a suspensão para um tubo de 15 ml.
  4. girar acélulas para baixo durante 5 min a 200 x g e ressuspender as células a 2 x 10 6 culas por ml em meio completo de melanócitos. Contar as células utilizando a exclusão de azul de tripano num hemocitómetro ou técnica equivalente.
  5. gotas de 10 ul placa próximos entre si (sem lhes tocar) sobre as secas PO / Lam / FN placas de 10 cm. Se a placa foi suficientemente seca, as gotículas deveria ter bem bordas definidas e não correr.
    Nota: Isto cria um ambiente de local de alta densidade para as células, o que é importante quando replating as células, enquanto se mantém dentro do quarto prato de expansão.
  6. Permitir que as gotas em repouso à temperatura ambiente durante 10-20 minutos, para permitir que as células a aderir, em seguida, lentamente (para não perturbar as células ligadas) adicionar 10 mL de meio completo de melanócitos. Mover prato para a incubadora.

5. Expansão de Melanócitos Progenitores

  1. Continuar alimentando com meio de melanócitos completa a cada 2 a 3 dias.
    Nota: A pigmentação deve começar a ser visível within cachos de células no final da primeira semana e tornar-se muito evidente na segunda semana. Ver a placa sobre um fundo branco, como uma folha de papel para discernir esses aglomerados pequenos e escuros adiantados. As células irão tornar-se progressivamente mais pigmentada ao longo do tempo, até que toda a placa é uniformemente pigmentada (Ver Figura 2B).
  2. células de passagem uma vez por semana a uma razão de aproximadamente 1: 6 (revestimento de gotículas como já não é necessário nesta fase). Use Accutase dissociar as células e lavar duas vezes com meio Neurobasal comum antes de re-plaqueamento em meio completa de melanócitos. Manter as células no PO LAM placas / / FN.
    Nota: Nós descobrimos que o meio completa de melanócitos é mais adequada para manter e expandir células estaminais embrionárias humanas e melanócitos iPSC derivados. No entanto, as células podem ser brevemente cultivadas em meio M254 disponíveis comercialmente, mas os meios de comunicação simplificada aumenta o risco de células que morrem e de elevação ao lado da placa.

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Resultados

Este protocolo fornece um método para derivar melanócitos maduros, totalmente pigmentadas de hPSCs em um livre-alimentador, eficiente, e reprodutível modo in vitro. Em contraste com o fang et ai. Protocolo previamente estabelecido para os melanócitos HPSC-derivados, o protocolo descrito não requer meio condicionado e reduz a exigência de tempo. O protocolo fang et al. Utilizaram meio condicionado de uma linha celular murino de produção de Wnt3a e levou até 6 se...

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Discussão

Para a diferenciação de melanócitos bem sucedida de hPSCs as seguintes sugestões deve ser tomado em consideração. Em primeiro lugar, é essencial para trabalhar sob condições de cultura estéreis em todos os momentos. Além disso, é importante para iniciar com pluripotentes, hPSCs totalmente indiferenciadas; se a população começando contém células diferenciadas o rendimento será invariavelmente cair como os contaminantes não pode ser dirigida para melanócitos e pode mesmo perturbar ainda mais as células adequadamente difer...

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Divulgações

Os autores não têm interesses conflitantes para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por uma bolsa para pesquisadores de melanoma do M. Nicolay Fundação Joanna e pelos Institutos Nacionais de Saúde sob Ruth Service Award L. Kirschstein National Research F31. Este trabalho foi ainda apoiada por meio de doações de NYSTEM ea iniciativa de células estaminais Tri-institucional (Starr Foundation).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104
apo transferrina humanaSigmaT1147
Ácido Ascórbico (L-AA)SigmaA4034100 mM
B27 (Suplemento B27)Invitrogen17504044
β-MercaptoetanolGibco-Life Technologies21985-02310 mg/ml
BMP4R& D Systems314-bp
CHIR99021Tocris-R& D Systems44236 mM
Toxina da cóleraSigmaC805250 mg/ml
cAMP (cyclicAMP)SigmaD0627100 mM
DexametasonaSigmaD2915-100MG50 μ M
DMEM - Meio Eagle Modificado Dulbecco'sGibco-Life Technologies11985-092
DMEM/F12 - Meio Eagle Modificado Dulbecco: Mistura de Nutrientes F-12Gibco-Life Technologies1133--032
DMEM/F12 póInvitrogen12500-096
EDN3 (Endotelina-3, humano)American Peptide Company88-5-10B100 μ
M FibronectinaBD Biosciences356008200 μ g/ml
gelatina (PBS sem Mg/Ca)internamente0,1% em PBS
GlicoseSigmaG7021
Insulina humanaSigmaI2643
ITS+ Suplemento de Cultura Universal Premix BD Biosciences354352
KSR (Knockout Serum Replacement)Gibco-Life Technologies10828-028
Knockout DMEMGibco-Life Technologies10829-018
L-GlutaminaGibco-Life Technologies25030-081
LDN193189Stemgent04-0074100 mM
Baixa glicose DMEMInvitrogen11885-084
Matriz matrigelBD Biosciences354234Dissolver 1:20 em DMEM/F12
MCDB201 MediumSigmaM6770
MEM solução de aminoácidos essenciais mínimosGibco-Life Technologies11140-080
Fibroblastos embrionários de camundongo (7 milhões de células/frasco)GlobalStemGSC-8105M
Laminina de camundongo-IR& D Systems3400-010-011 mg/ml
Meio neurobasalInvitrogen21103049
Penicilina/EstreptomicinaGibco-Life Technologies15140-12210.000 U/ml
Poly-L Omithin hydrobromideSigmaP365515 mg/ml 
ProgesteronaSigmaP87830,032 g em 100 ml 100% etanol
Cloridrato de putrescinaSigmaP5780
FGF2 (FGF humano recombinante básico)R & D Systems233-FB-001MG/CF10 mg/ml
SB431542Tocris-R& D Systems181410 mM
SeleniteSigmaS5261
Bicarbonato de SódioSigmaS5761
SCF (Fator de Célula-Tronco, humano recombinante) Peprotech Inc.300-0750 μ g/ml
TYRP1 (G-17) AnticorpoSanta Cruz104431:200
TYRP2 AnticorpoAbcam740731:200
Tripsina-EDTA (0,05%)Gibco-Life Technologies25300-054
Y-27632 dicloridratoTocris-R& D Systems125410 mM
de

Referências

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Diferenciação de MelanócitosDiferenciação da Crista NeuralSinalização WNT BMP EDN3Inibição Dual de SMADCultura em Meio SeletivoEnriquecimento de Precursores de MelanócitosMelanócitos Totalmente PigmentadosSolução de Destacamento CelularRevestimento de Laminina e Fibronectina PO
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