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Artigo de método

Cultivar células primárias Nasal epiteliais de Crianças e reprogramar em células-tronco pluripotentes induzidas

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DOI:

10.3791/53814

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10 de março de 2016

 ,  ,  ,  , 
1Pyrosequencing Core, Cincinnati Children's Hospital, 2Division of Developmental Biology, Cincinnati Children's Hospital, 3Division of Pulmonary Medicine, Seattle Children's Hospital, 4Division of Asthma Research, Cincinnati Children's Hospital

Neste artigo

Resumo

Esta publicação demonstra métodos para amostragem e cultura bem-sucedidas da mucosa epitelial nasal de crianças e reprogramação dessas células para células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs).

Resumo

As células epiteliais nasais (ECNs) são a parte das vias aéreas que responde aos poluentes atmosféricos e são as primeiras células infectadas com vírus respiratórios. Eles também estão envolvidos em muitas doenças das vias aéreas por meio de sua resposta imune inata e interação com células imunológicas e estromais das vias aéreas. Os NECs são de particular interesse para estudos em crianças devido à sua acessibilidade durante as visitas clínicas. As células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs) foram geradas a partir de vários tipos de células e são uma ferramenta poderosa para modelar o desenvolvimento humano e a doença, bem como para suas aplicações potenciais na medicina regenerativa. Este é o primeiro protocolo a estabelecer métodos para a geração bem-sucedida de iPSCs a partir de NECs derivadas de participantes pediátricos para fins de pesquisa. Ele descreve como obter células epiteliais nasais de crianças, como gerar culturas primárias de NEC a partir dessas amostras e como reprogramar NECs primárias em iPSCs bem caracterizadas. Amostras de mucosa nasal são úteis em estudos epidemiológicos relacionados aos efeitos da poluição do ar em crianças e fornecem uma ferramenta importante para o estudo de doenças das vias aéreas. As células nasais primárias e as iPSCs derivadas delas podem ser uma ferramenta para fornecer material ilimitado para pesquisas específicas do paciente em diversas áreas da biologia epitelial das vias aéreas, incluindo pesquisa de asma e DPOC.

Introdução

Induzidas células-tronco pluripotentes a partir de amostras humanas (hiPSCs) são uma tecnologia em rápido desenvolvimento da investigação sobre células estaminais. Eles oferecem uma alternativa à investigação em células estaminais embrionárias (hESC) com muito menos inconvenientes éticos e morais 1,2. Embora eles não são idênticos epigeneticamente para hESCs 3-5, hiPSCs oferecer uma forma única para o modelo de desenvolvimento de doença e fenótipos, e eles podem ser derivados a partir de tecidos relevantes para o estado de doença 5-8. Novos métodos de hiPSCs geradoras estão constantemente a ser explorado para identificar tipos de células ideais para começar, como uma maneira de se preparar iPSCs GMP-qualidade adequados para transplante, e também para aumentar a prontidão ea eficiência do processo de reprogramação 6,9-11.

As células epiteliais das vias respiratórias são críticos no desenvolvimento de inflamação alérgica 12, e o epitélio é um importante factor de respostas alérgicas das vias aéreas e a remodelação através da interacção com Immune estromais e células. O epitélio das vias aéreas desempenha um papel essencial na origem e persistência de doenças pulmonares como a asma. No entanto, as células epiteliais das vias aéreas inferiores são difíceis de obter em um ambiente clínico, especialmente a partir de pacientes de controle saudáveis ​​e crianças. Dados de vários estudos apoiam a premissa de que as células epiteliais da mucosa nasal são uma procuração válida e prático para as vias aéreas inferiores células epiteliais 13-20, especialmente quando se estuda as respostas a poluentes do ar e alérgenos. A mucosa nasal é composto de células epiteliais das vias aéreas ciliada mais de 90% e amostragem dessas células epiteliais nasais (CNE) podem ser facilmente realizados em crianças a partir dos quatro anos de idade ou cinco, como é menos invasivo do que outras técnicas de amostragem de células / tecidos e é associado com um risco mínimo de efeitos adversos, como infecção 20-23. Ele oferece uma maneira rápida e simples para provar as crianças saudáveis ​​e doentes sem tempo, desnecessário e muitas vezes dolorosa procedu broncoscopiares que necessitem de sedação. Estudos anteriores mostraram que os subtipos de doença relacionados com a gravidade da asma podem ser distinguidos em ambos da mucosa nasal, bem como amostras de células bronquiais tomadas a partir de crianças asmáticas, e a expressão do gene entre os dois tipos de tecidos foi semelhante em cerca de 90% dos genes não ubíquos 22 , 24. Como fonte para iPSCs, CNE oferecer vantagens sobre outros tipos de células frequentemente utilizados. Os fibroblastos são muitas vezes utilizados para a geração de CIPS, mas apesar dessas células pode facilmente ser cultivada a partir de uma biópsia da pele, este processo normalmente requer anestesia local, uma incisão, e suturas, e está associada a um certo risco de infecção. Portanto, a obtenção de consentimento informado dos pacientes para este tipo de biópsia pode ser difícil 25. Uma alternativa para os fibroblastos são as células mononucleares do sangue periférico (PBMCs). No entanto, pode ser difícil de obter sangue suficiente para geração iPSC de pacientes pediátricos. Além disso, há limitações de AP jusanteplicações para fibroblastos e iPSCs de glóbulos derivados, especialmente sua capacidade de diferenciação de certos tipos de células 5,26. Portanto, dada a acessibilidade relativa e o baixo risco de efeitos colaterais após a colheita, NECs representam uma fonte de células ideal para a geração de iPSC de populações pediátricas.

iPSCs têm recebido muita atenção recentemente como uma plataforma para o estudo do desenvolvimento humano, gerando novos modelos de doenças, e como uma fonte potencial de células para terapias personalizadas. Antes de todo o potencial desta tecnologia pode ser realizado, as bases moleculares do processo de reprogramação precisam ser elucidadas, mas por agora este protocolo e os procedimentos descritos no prazo irá elucidar os estudos de pesquisa voltadas para as exposições das vias aéreas, bem como fornecer uma plataforma para estudar os efeitos da medicina personalizada envolvendo iPSCs.

O trabalho colaborativo de vários laboratórios levou à generatioN de uma técnica bem sucedida, não só para a amostragem da mucosa nasal, mas também a cultura CNE, e reprogramar essas células para iPSCs 23. Este artigo fornece um esboço de um protocolo de amostragem ideal, cultura e condições de reprogramação.

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Protocolo

O protocolo a seguir segue as diretrizes do comitê de ética em pesquisa humana instituições.

1. A amostragem da mucosa nasal

NOTA: obter amostras de indivíduos que estão livres de sinais de infecção viral respiratória.

  1. Prepare um 15 ml fresco cónica antes da visita participante e adicionar 2 ml BEGM (brônquica epitelial Médio celular Crescimento) mais 20 ul estéril Penn / Strep / Fungizone (P / S / F) (0,01%).
  2. Abrir escova de citologia pouco antes de tomar a amostra, e não se esqueça de manter a escova estéril e não tocá-lo para qualquer superfície, além das superfícies nasais.
  3. Peça ao participante para ficar parado e incline a cabeça para cima em direção teto. Têm menor ou mais crianças inquietas se sentar em suas mãos e / ou deitado para evitar golpear escova de distância.
  4. Aponte escova na parte de trás do nariz, onde a passagem estreita (Parece que um pequeno buraco negro). Deslize a escova para baixo e torcer pulsos enquanto o pincel é removido nostrieu.
  5. Coloque a escova no cônica e submergir em BEGM. Corte o excesso de escova e recoloque a tampa no tubo. NÃO VORTEX.
    NOTA: Se o participante está disposto, obter uma segunda escova da mesma maneira, mas no segundo narina. A obtenção de uma escova de ambas as narinas vai resultar em uma maior probabilidade de que a amostragem será bem sucedida. Amostragem do mesmo narina pode resultar em sangramento e não irá provavelmente aumentar a amostra.
  6. Manter as amostras como perto de 37 ° C quanto possível durante o transporte usando um copo com água morna.

2. Contagem de Células e Cytospin

  1. Agite suavemente o pincel na BEGM e tomar 10 ml da amostra para uma contagem de células usando um hemocitômetro. Adicionar 10 ml de uma mancha ao vivo / morto e contar apenas células vivem sob um microscópio.
  2. Tomar 50 ul de amostra e dilui-se para 200 mL com PBS 1x. Adicionar ao funil cytospin ligado a lâmina de vidro e girar a 300 rpm durante 2 min. Vamos deslizar O N e mancha de slides / dry following instruções do fabricante. Deixar secar S / N, de preferência no escuro.
  3. Deslize mancha com Hema 3 Stain
    1. Transfira cada solução (Hema fixador, azul claro; Solution Hema 3 I, rosa, e Hema 3 Solução II, azul profundo) em uma placa de coloração; Manter coberto quando não estiver em uso. Inserir slides em slides barco coloração
    2. Dip slides continuamente em fixador durante 30 segundos, em seguida, permitir que o excesso escorra para. Dip desliza continuamente em Solução I durante 30 segundos, em seguida, permitir que o excesso escorra para. Dip desliza continuamente na solução II durante 30 segundos, em seguida, permitir que o excesso de drenar
    3. Enxágüe com água deionizada até que a água corre claro. Deixar secar S / N, de preferência no escuro
  4. Olhe para a corrediça sob o microscópio células e contagem, determinar porcentagem de células epiteliais. Deve ser de 90% ou mais se a amostragem é boa.

3. Células Sementeira

NOTA: Realizar todos os procedimentos de cultura de células em uma cultura de tecidos adequada e certificadaexaustor com técnica estéril.

  1. placas de revestimento com Bovine Collagen dérmica (BDC), tipo 1. Adicione 0,5 ml de 3 mg / ml BDC diluído em 49,5 ml de 1x PBS. Prepare menos se será utilizado apenas algumas placas. Revestimento um frasco T25 com 2 ml BDC e incubar em estéril capa O / N ou a 37 ° C durante 2 horas, se necessário.
  2. Após a incubação, aspirar o líquido restante. Expor frascos à luz UV durante 30 minutos na capa estéril. frascos para armazenar até um mês a 4 ° C, mas trazê-los à temperatura ambiente ou 37 ° C antes de semear as células.
  3. Mantenha a escova e em células BEGM a 37 ° C até estar pronto para semear. Escove suavemente swish dentro cônica, mas não vórtice.
    1. Placa de 7 x 10 5 células em um frasco T25. Se houver menos, utilizar um recipiente mais pequeno, tal como um poço de uma placa de 6 poços. Esta placa de tamanho requer cerca de 3 x 10 5 células.
      NOTA: Se não houver esta quantidade de células, não é aconselhável para continuar.
  4. Sob um capuz estéril, leve escova fora do tubo e gently girar escova na superfície do frasco revestido, tomando cuidado para não riscar o revestimento. Descarte pincel em um recipiente de risco biológico apropriado.
  5. Lentamente pipetar as células restantes em BEGM fora da cónica e para o balão T25. Observar as células ao microscópio. Um número de células flutuantes serão observados e pode haver alguns detritos a partir do nariz, o que é aceitável nesta fase (Figura 3A).

Cultura 4. celular

  1. Depois de células semear, deixá-los se contentar com 48 horas sem interrupção (Figura 3). Após 48 horas, lenta e suavemente adicionar 2 ml quente BEGM e 20 mL estéril penicilina / estreptomicina / Fungizone (P / S / F).
    NOTA: NÃO aspirar os originais 2 ml de mídia.
  2. No 4º dia após a sementeira, aspirar cuidadosamente todo o líquido, e substituir com 4 ml fresco, aquecida BEGM mais 1x Pen / Strep (fungizona não é mais necessário). Mudança de mídia a cada dois dias e avaliar células para anexarmento, crescimento e confluência. Quando as células atingem ~ 80% de confluência, geralmente em 2-3 semanas, eles estão prontos para ser passado.
  3. Um balão T25 (cerca de 2,5 X 10 6 células quando confluentes) podem ser passadas para frascos T25 três ou um frasco T75. Após a primeira passagem, as células devem ser robusto e saudável, atingindo confluência a cada três dias.

5. As células Passaging

  1. Aspirar cuidadosamente a mídia a partir da placa. Adicionar 1 ml de solução de 0,05% de tripsina por frasco T25 a placa e lugar na incubadora durante cerca de 4 min, ou até que as células separar da placa. Verifique o nível de desprendimento de células a cada 2 min e não deixe de tripsina em mais de 10 min.
  2. Adicionar 5 ml de tripsina Neutralizante Solution (TNS), ou a mídia contendo soro para neutralizar a enzima. Retire todo o líquido e as células do frasco e coloque em um tubo de 15 ml.
  3. Centrifuga-se a 200 x g (aceleração desaceleração 0 0) durante 5 min para obter um pellet de células. Aspirar supernatant células e ressuspender em BEGM + P / S no volume necessário para os novos frascos (4 ml para um frasco T25, 10 ml para um frasco T75)
  4. Efectuar a contagem de células com um corante vivo / morto, tal como descrito acima (2,1). Adicionar uma quantidade adequada de células BEGM e para os frascos revestidos e retornar para a incubadora. Manter como detalhado acima ou criopreservar em meio de congelação (70% BEGM, 20% de FBS e 10% de DMSO) a uma concentração de 0,5-2 x 10 6 culas por ml.

6. A reprogramação para iPSCs

NOTA: Antes de gerar iPSCs, garantir a adesão a todas as normas institucionais que regem a produção ea utilização de iPSCs humanos. técnica estéril é especialmente importante para as culturas IPSC, como meio de cultura não rotineiramente contêm antibióticos. É fundamental que NECs parecem saudáveis ​​e são robustamente proliferativa para a reprogramação de sucesso.

  1. Placa de 5 x 10 5 CNE por poço de uma placa de cultura de tecidos de 6 poços. Após 24 horas, adicionar polibrenopara BEGM a uma concentração final de 8 mg / ml e transdução NECs adicionando partículas lentivirais expressando Oct4, Sox2, KLF4, c-Myc para a mídia. Destinam-se a conseguir uma multiplicidade de infecção (MOI) de 5 ~ 27.
    1. Para a determinação do MOI, preparar diluições em série do stock concentradas-lentiviral e transduzir células HT1080 com estas diluições. Após a primeira inequivocamente a detecção de expressão dTomato nas células HT1080, calcular o número de "unidades de transdução / mL", marcando o número de células positivas / dTomato pequenos aglomerados de células em cada diluição.
      NOTA: Normalmente, haverá diluições que são demasiado elevados (tudo é dTomato positivo) e muito baixa (nenhum ou apenas um par de células positivas).
    2. Execute pontuação das diluições em que as células positivas discretas / pequenos aglomerados de células é identificada. Determinar o título corrigindo o número de transduzir unidades / ml com o factor de diluição apropriado. MOI é, em seguida, a relação entre o númerode células transduzidas com o número de partículas de vírus 27.
      NOTA: Cada dTomato celular positiva / pequeno grupo é assumido a surgir a partir de uma única partícula de vírus.
  2. Cerca de 3 horas após a transdução, remova a mídia e substituir com BEGM fresco. Descarte de mídia contendo Lentivírus usando procedimentos institucionalmente aprovados. Retorno CNE transduzidas para a incubadora durante 3 dias.
  3. No dia 3, substituir a mídia com BEGM frescos, e, em seguida, incubar por mais 3 dias. Aspirar gasto meios, lavar as células com PBS 1x e adicionar 1 ml de 0,05% de solução de tripsina para o poço. células de passagem com tripsina como escrito acima (seção 5). Aspirar cuidadosamente as células sobrenadante e ressuspender em 4 ml BEGM + P / S. As células podem ser passadas para um novo poço de uma placa de 6 poços revestidas com BDC, ou adicionados a culturas MEF, se pronto (ver próximo passo).
  4. Prepare placas revestidas MEF. No dia 4 adicionar solução de gelatina a 0,1% (1 ml / poço) para 2 poços de uma 6 bem (para realizar +/- Thiazovivin (SPT) veja o passo 6.6). Na próximadia, descongelar um frasco de MEFs inativadas 28.
  5. Coloque MEFs em 10 ml de meio DMEM + MEF (1x NEAA + 10% de dFCS). Centrifugação a 200 xg durante 5 min para sedimentar. Ressuspender em media MEF. Gelatina aspirado a partir da placa de 6 poços e adicionar 1,87 x 10 5 MEFs por poço da placa de 6 poços revestidos com gelatina. Incubar O / N a 37 ° C, ou para um mínimo de 24 hr.
  6. Transferir 2 ml de BEGM contendo células transduzidas por poço em 2 poços de uma placa de 6 poços previamente revestidas e incubar O / N. No dia seguinte, substituir BEGM com 2,5 ml por poço de meio de células estaminais embrionárias humanas normais que contêm o factor de 4 ng / mL de crescimento de fibroblastos básico. Alimentar as células com a mídia CTEh fresco +/- SPT dia durante 10 dias
    NOTA: É possível adicionar um cocktail de pequenas moléculas (SB431542, PD0325901 e Thiazovivin () cocktail SPT) para melhorar a eficiência e cinética de reprogramação para NECs 23.
  7. Depois de dez dias, continuar a alimentar diária usando a mídia hESC sem SPT. Alimente culturas diariamente até colónias hESC-likeaparecer (Figura 5A, P0 colónia). Identificar colônias que abrigam iPSCs putativos por sua alta núcleo: relação citoplasmática e nucléolos proeminentes.
  8. Manualmente especiais de consumo e de transferência de colónias com morfologia hESC-like para separar poços para a cultura e expansão como linhas separadas em um sistema de livre-alimentador. colónias excisadas deve adaptar-se rapidamente a estas condições.
    1. Depois de colônias chapeamento excisadas estas linhas IPSC putativos discretos são agora considerados passagem 1 (P1). culturas diário de ração com mTeSR1. Passagem e expandir linhas de IPSC, utilizando procedimentos padrão. Pode demorar vários dias a uma semana para as colónias p1 para alcançar o tamanho em que eles devem ser passadas.

7. Manutenção iPSCs em Cultura

  1. Alimentar e avaliar culturas diariamente. Manualmente áreas especiais de consumo exibindo diferenciação ostensiva raspando com uma pipeta de vidro esterilizada ou ponteira micro. Mudança de mídia após a colheita diária.
  2. células de passagem após approximamadamente, de quatro em quatro dias: meios delicadamente aspirado, adicionar 1 ml de dispase quente (1 mg / ml) por poço de uma placa de 6 poços (metade do volume de alimentação), em seguida, incuba-se a 37 ° C durante cerca de 4 min. As bordas das colônias vai começar a levantar, que se parece com um esboço branco ao redor da colônia. Suavemente aspirar o Dispase e lavar 3x com aquecida DMEM / F12.
  3. Adicionar 2 ml mTeSR1 e utilizar um elevador de célula para levantar as colónias da placa. Use uma pipeta de 5 ml serológicos ou micropipeta P1000 para triturar suavemente as células até que as colônias são divididos em grupos menores.
    1. Evite produzindo muito pequenos grupos ou células individuais, como a sobrevivência e proliferação subsequente será sub-óptima. Quando re-plaqueamento colónias, uma mistura 1: 4 a 1: 6 de divisão vai manter a densidade óptima de colónias. Remova cuidadosamente colônias e mídia da placa e adicione aos poços novos, revestidos com Matrigel.

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Resultados

A parte inicial do nariz, chamado de vestíbulo nasal, é a área cercada por cartilagem 29. A escova tem de ir suavemente passado esta área do nariz, para além da válvula nasal (ostium internum, ou o "buraco negro" visto na parte de trás da narina), e a amostra é obtida a partir da concha inferior (Figura 1). As conchas nasais são estruturas ósseas que aumentam a área da superfície do nariz 29, o que os torna um local ideal para a amostragem...

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Discussão

Células epiteliais nasais (CNE) são uma plataforma acessível para o estudo de doenças das vias respiratórias, e NEC-iPSCs oferecer uma avenida emocionante para explorar o desenvolvimento da doença, tratamento e terapia 1,31,32. CNE pode ser facilmente obtida sem procedimentos prejudiciais estressantes ou potencialmente 6,23. Em nossa experiência, a amostragem da mucosa nasal, como descrito neste protocolo parece ser menos estressante e melhor percepção do que a coleta de sangue para as crianças. Po...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer a Facilidade Stem Cell pluripotentes ea Imagem Confocal Núcleo do Hospital Infantil de Cincinnati. Este trabalho foi apoiado por R21AI119236 (HJ), R21AI101375 (HJ), NIH / NCATS 8UL1TR000077-04 (HJ), U19 AI070412 (HJ) e 2U19AI70235 (GKKH).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Protocolo cônicoFisher Scientific14-959-49DEtapa 1.1.
Protocolo BEGMLonzaCC-3170Etapa 1.1.
Penn / Strep / FungicideLife Technologies15240-062Protocolo Etapa 1.1.
Penn/StrepLife Technologies15140-122Protocolo Etapa 4.a.
escova de citologia cytosoftFisher Scientific22-263-357Protocolo Etapa 1.2.
azul de tripanoFisher ScientificMT-25-900-CIProtocolo Etapa 2.1.
hemacitômetroFisher Scientific02-671-54Protocolo Etapa 2.1.
Protocolo PBSFisher ScientificBP2438-4Etapa 2.2.
Clipes de funil de citologiaFisher Scientific10-357Protocolo Etapa 2.2.
funil de cytospinFisher Scientific23-640-320Protocolo Etapa 2.2.
de A78300003Científica FisherCytospin 4Etapa 2.2.
slide em brancoFisher ScientificS95933Protocolo Etapa 2.2.
kit de coloração hema 3Fisher Scientific22-122-911Protocolo Etapa 2.2.
Colagen dérmico bovino, tipo 1tecnologias da vidaA1064401Protocolo Etapa 3.2.
Frasco T25Fisher Scientific08-772-45Protocolo Etapa 3.3.
5.2 do protocolode TrypsinLonzaCC-5012
Solução Neutralizante de TripsinaLonzaCC-5002Protocolo Etapa 5.2.
Soro fetal bovino (FBS), esterilizado por calor a 65 graus; C por 30 minProtocolo Sigma-AldrichF2442Etapa 5.5.
Dimetilsulfóxido Hybri-Max™, filtrado estéril, BioReagent, adequado para hibridoma, ≥ 99,7%Sigma-AldrichD2650Protocolo Etapa 5.5.
lentivírus policistônico*e.g. MilliporeSCR511Etapa 6.4. 
Uma fonte comercial de vetor de reprogramação é listada. Usamos rotineiramente o plasmídeo 4 em 1 relatado por Voelkel et al (PMID: 20385817) para gerar lentivírus de reprogramação policistrônica pseudotipado VSV-G internamente. Este plasmídeo pode ser obtido por contato 
polybreneSanta Cruz Biotechnologysc-134220Protocolo Etapa 6.4.
MEFs CF1 irradiadosGlobalStem Protocolo GSC-6301GEtapa 6.4.
Mídia hESCVeja a receita incluída no protocoloEtapa 6.11 do protocolo.
SB431542Stemgent04-0010Etapa 6.11 do protocolo.
PD0325901Stemgent04-0006Etapa 6.11 do protocolo.
Thiazovivin Stemgent04-0017Protocolo Etapa 6.11.
354277Matrigel BD Biosciences qualificado para hESCEtapa 6.13.
Placa de Corning, 6 poçosFisher Scientific08-772-1BProtocolo Etapa 6.13.
mTeSR1StemCell5850Protocolo Etapa 6.13.
Balão filtrante descartável de 250 ml (0,22 µ m)FisherSCGP-U02-RE 
dispaseStemCell7923Protocolo Etapa 7.3.
DMEM/F12Life Technologies11320-033Protocolo Etapa 7.3.
levantador de célulasFisher Scientific08-100-240Protocolo Etapa 7.4.
hESC Media**Etapa 6.11.
componentes devem ser misturados e, em seguida, esterilizados por filtro. A mídia pode ser mantida em 4 ° C por até duas semanas. Ao aquecer o meio, não deixe a 37 &graus; C mais de 15 min
DMEM-F12 50/50 mídiaInvitrogen  11330-032Concentração Final KO
sérum de reposição (KO-SR)Invitrogen10828-0280,2
200 mM L-glutaminaInvitrogen25030-0811 mM
55 mM ß-mercaptoetanolInvitrogen21985-0230,1 mM
100x aminoácidos não essenciaisInvitrogen11140-0501x
2 µ g/ml Fator de crescimento básico de fibroblastos (b-FGF)Invitrogen13256-0294 ng/ml
de 15 ml Protocolo Etapa .Protocolo de

Referências

  1. Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell stem cell. 10 (6), 678-684 (2012).
  2. Boulting, G. L., et al. A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells. Nature biotechnology. 29 (3), 279-286 (2011).
  3. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  4. Guenther, M. G., et al. Chromatin structure and gene expression programs of human embryonic and induced pluripotent stem cells. Cell stem cell. 7 (2), 249-257 (2010).
  5. Polo, J. M., et al. Cell type of origin influences the molecular and functional properties of mouse induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 28 (8), 848-855 (2010).
  6. Ono, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human nasal epithelial cells using a Sendai virus vector. PloS one. 7 (8), e42855(2012).
  7. Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).
  8. Brennand, K. J., et al. Modelling schizophrenia using human induced pluripotent stem cells. Nature. 473 (7346), 221-225 (2011).
  9. Mou, H., et al. Generation of multipotent lung and airway progenitors from mouse ESCs and patient-specific cystic fibrosis iPSCs. Cell stem cell. 10 (4), 385-397 (2012).
  10. Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K. Induced pluripotent stem cells generated without viral integration. Science. 322 (5903), 945-949 (2008).
  11. Huangfu, D., et al. Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by small-molecule compounds. Nat Biotechnol. 26 (7), 795-797 (2008).
  12. Kuperman, D. A., et al. Direct effects of interleukin-13 on epithelial cells cause airway hyperreactivity and mucus overproduction in asthma. Nat Med. 8 (8), 885-889 (2002).
  13. Braunstahl, G. J., et al. Segmental bronchoprovocation in allergic rhinitis patients affects mast cell and basophil numbers in nasal and bronchial mucosa. American journal of respiratory and critical care medicine. 164 (5), 858-865 (2001).
  14. Compalati, E., et al. The link between allergic rhinitis and asthma: the united airways disease. Expert review of clinical immunology. 6 (3), 413-423 (2010).
  15. Crimi, E., et al. Inflammatory and mechanical factors of allergen-induced bronchoconstriction in mild asthma and rhinitis. Journal of applied physiology. 91 (3), 1029-1034 (2001).
  16. Djukanovic, R., et al. Bronchial mucosal manifestations of atopy: a comparison of markers of inflammation between atopic asthmatics, atopic nonasthmatics and healthy controls. The European respiratory journal : official journal of the European Society for Clinical Respiratory Physiology. 5 (5), 538-544 (1992).
  17. Gaga, M., et al. Eosinophils are a feature of upper and lower airway pathology in non-atopic asthma, irrespective of the presence of rhinitis. Clinical and experimental allergy : journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. 30 (5), 663-669 (2000).
  18. Hurst, J. R., Wilkinson, T. M., Perera, W. R., Donaldson, G. C., Wedzicha, J. A. Relationships among bacteria, upper airway, lower airway, and systemic inflammation in COPD. Chest. 127 (4), 1219-1226 (2005).
  19. Gaga, M., V, A. M., Chanez, P. Upper and lower airways: similarities and differences. European respiratory monograph. 18, 1-15 (2001).
  20. Lopez-Guisa, J. M., et al. Airway epithelial cells from asthmatic children differentially express proremodeling factors. J Allergy Clin Immunol. 129 (4), 990-997 (2012).
  21. Doi, A., et al. Differential methylation of tissue- and cancer-specific CpG island shores distinguishes human induced pluripotent stem cells, embryonic stem cells and fibroblasts. Nature genetics. 41 (12), 1350-1353 (2009).
  22. Poole, A., et al. Dissecting childhood asthma with nasal transcriptomics distinguishes subphenotypes of disease. J Allergy Clin Immunol. , (2014).
  23. Ji, H., et al. Dynamic transcriptional and epigenomic reprogramming from pediatric nasal epithelial cells to induced pluripotent stem cells. J Allergy Clin Immunol. 135 (1), 236-244 (2015).
  24. Guajardo, J. R., et al. Altered gene expression profiles in nasal respiratory epithelium reflect stable versus acute childhood asthma. The Journal of allergy and clinical immunology. 115 (2), 243-251 (2005).
  25. Yamanaka, S. Patient-specific pluripotent stem cells become even more accessible. Cell Stem Cell. 7 (1), 1-2 (2010).
  26. Kim, K., et al. Donor cell type can influence the epigenome and differentiation potential of human induced pluripotent stem cells. Nature. 29 (12), 1117-1119 (2011).
  27. Warlich, E., et al. Lentiviral vector design and imaging approaches to visualize the early stages of cellular reprogramming. Mol Ther. 19 (4), 782-789 (2011).
  28. Wicell. Wicell Feeder Based (MEF) Pluripotent Stem Cell Protocols. , (2003).
  29. Harkema, J. R., Carey, S. A., Wagner, J. G. The nose revisited: a brief review of the comparative structure, function, and toxicologic pathology of the nasal epithelium. Toxicol Pathol. 34 (3), 252-269 (2006).
  30. Allegrucci, C., Young, L. E. Differences between human embryonic stem cell lines. Hum Reprod Update. 13 (2), 103-120 (2007).
  31. Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).
  32. Pasca, S. P., et al. Using iPSC-derived neurons to uncover cellular phenotypes associated with Timothy syndrome. Nature medicine. 17 (12), 1657-1662 (2011).
  33. Lai, P. S., et al. Alternate methods of nasal epithelial cell sampling for airway genomic studies. J Allergy Clin Immunol. , (2015).
  34. Shi, Y., et al. A combined chemical and genetic approach for the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 2 (6), 525-528 (2008).
  35. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature. 8 (5), 409-412 (2011).
  36. Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. Elife. 4, (2015).
  37. Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 32 (1), 84-91 (2014).
  38. Wong, A. P., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein. Nature biotechnology. 30 (9), 876-882 (2012).
  39. Marchetto, M. C., et al. Transcriptional signature and memory retention of human-induced pluripotent stem cells. PloS one. 4 (9), e7076(2009).
  40. Nukaya, D., Minami, K., Hoshikawa, R., Yokoi, N., Seino, S. Preferential gene expression and epigenetic memory of induced pluripotent stem cells derived from mouse pancreas. Genes Cells. 20 (5), 367-381 (2015).
  41. Vaskova, E. A., Stekleneva, A. E., Medvedev, S. P., Zakian, S. M. 'Epigenetic memory' phenomenon in induced pluripotent stem cells. Acta Naturae. 5 (4), 15-21 (2013).
  42. Bar-Nur, O., Russ, H. A., Efrat, S., Benvenisty, N. Epigenetic memory and preferential lineage-specific differentiation in induced pluripotent stem cells derived from human pancreatic islet beta cells. Cell Stem Cell. 9 (1), 17-23 (2011).
  43. Jandial, R., Levy, M. L. Cellular alchemy: induced pluripotent stem cells retain epigenetic memory. World Neurosurg. 75 (1), 5-6 (2011).
  44. Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
  45. Ohi, Y., et al. Incomplete DNA methylation underlies a transcriptional memory of somatic cells in human iPS cells. Nat Cell Biol. 13 (5), 541-549 (2011).

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