Cultivar células primárias Nasal epiteliais de Crianças e reprogramar em células-tronco pluripotentes induzidas

Resumo

Esta publicação demonstra métodos para amostragem e cultura bem-sucedidas da mucosa epitelial nasal de crianças e reprogramação dessas células para células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs).

Resumo

As células epiteliais nasais (ECNs) são a parte das vias aéreas que responde aos poluentes atmosféricos e são as primeiras células infectadas com vírus respiratórios. Eles também estão envolvidos em muitas doenças das vias aéreas por meio de sua resposta imune inata e interação com células imunológicas e estromais das vias aéreas. Os NECs são de particular interesse para estudos em crianças devido à sua acessibilidade durante as visitas clínicas. As células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs) foram geradas a partir de vários tipos de células e são uma ferramenta poderosa para modelar o desenvolvimento humano e a doença, bem como para suas aplicações potenciais na medicina regenerativa. Este é o primeiro protocolo a estabelecer métodos para a geração bem-sucedida de iPSCs a partir de NECs derivadas de participantes pediátricos para fins de pesquisa. Ele descreve como obter células epiteliais nasais de crianças, como gerar culturas primárias de NEC a partir dessas amostras e como reprogramar NECs primárias em iPSCs bem caracterizadas. Amostras de mucosa nasal são úteis em estudos epidemiológicos relacionados aos efeitos da poluição do ar em crianças e fornecem uma ferramenta importante para o estudo de doenças das vias aéreas. As células nasais primárias e as iPSCs derivadas delas podem ser uma ferramenta para fornecer material ilimitado para pesquisas específicas do paciente em diversas áreas da biologia epitelial das vias aéreas, incluindo pesquisa de asma e DPOC.

Introdução

Induzidas células-tronco pluripotentes a partir de amostras humanas (hiPSCs) são uma tecnologia em rápido desenvolvimento da investigação sobre células estaminais. Eles oferecem uma alternativa à investigação em células estaminais embrionárias (hESC) com muito menos inconvenientes éticos e morais ^1,2. Embora eles não são idênticos epigeneticamente para hESCs ^3-5, hiPSCs oferecer uma forma única para o modelo de desenvolvimento de doença e fenótipos, e eles podem ser derivados a partir de tecidos relevantes para o estado de doença ^5-8. Novos métodos de hiPSCs geradoras estão constantemente a ser explorado para identificar tipos de célu....

Protocolo

O protocolo a seguir segue as diretrizes do comitê de ética em pesquisa humana instituições.

1. A amostragem da mucosa nasal

NOTA: obter amostras de indivíduos que estão livres de sinais de infecção viral respiratória.

1. Prepare um 15 ml fresco cónica antes da visita participante e adicionar 2 ml BEGM (brônquica epitelial Médio celular Crescimento) mais 20 ul estéril Penn / Strep / Fungizone (P / S / F) (0,01%).
2. Abrir escova de citologia pouco antes de tomar a amostra, e não se esqueça de manter a escova estéril e não tocá-lo para qualquer superfície, além das superfícies nasais.
3. P....

Resultados

A parte inicial do nariz, chamado de vestíbulo nasal, é a área cercada por cartilagem ^29. A escova tem de ir suavemente passado esta área do nariz, para além da válvula nasal (ostium internum, ou o "buraco negro" visto na parte de trás da narina), e a amostra é obtida a partir da concha inferior (Figura 1). As conchas nasais são estruturas ósseas que aumentam a área da superfície do nariz ^29, o que os torna um local ideal para a amostragem.......

Discussão

Células epiteliais nasais (CNE) são uma plataforma acessível para o estudo de doenças das vias respiratórias, e NEC-iPSCs oferecer uma avenida emocionante para explorar o desenvolvimento da doença, tratamento e terapia ^1,31,32. CNE pode ser facilmente obtida sem procedimentos prejudiciais estressantes ou potencialmente ^6,23. Em nossa experiência, a amostragem da mucosa nasal, como descrito neste protocolo parece ser menos estressante e melhor percepção do que a coleta de sangue para as crianças. Po.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Protocolo cônico	Fisher Scientific	14-959-49D	Etapa 1.1.
Protocolo BEGM	Lonza	CC-3170	Etapa 1.1.
Penn / Strep / Fungicide	Life Technologies	15240-062	Protocolo Etapa 1.1.
Penn/Strep	Life Technologies	15140-122	Protocolo Etapa 4.a.
escova de citologia cytosoft	Fisher Scientific	22-263-357	Protocolo Etapa 1.2.
azul de tripano	Fisher Scientific	MT-25-900-CI	Protocolo Etapa 2.1.
hemacitômetro	Fisher Scientific	02-671-54	Protocolo Etapa 2.1.
Protocolo PBS	Fisher Scientific	BP2438-4	Etapa 2.2.
Clipes de funil de citologia	Fisher Scientific	10-357	Protocolo Etapa 2.2.
funil de cytospin	Fisher Scientific	23-640-320	Protocolo Etapa 2.2.
de A78300003	Científica Fisher	Cytospin 4	Etapa 2.2.
slide em branco	Fisher Scientific	S95933	Protocolo Etapa 2.2.
kit de coloração hema 3	Fisher Scientific	22-122-911	Protocolo Etapa 2.2.
Colagen dérmico bovino, tipo 1	tecnologias da vida	A1064401	Protocolo Etapa 3.2.
Frasco T25	Fisher Scientific	08-772-45	Protocolo Etapa 3.3.
5.2 do protocolo	de Trypsin	Lonza	CC-5012
Solução Neutralizante de Tripsina	Lonza	CC-5002	Protocolo Etapa 5.2.
Soro fetal bovino (FBS), esterilizado por calor a 65 graus; C por 30 min	Protocolo Sigma-Aldrich	F2442	Etapa 5.5.
Dimetilsulfóxido Hybri-Max™, filtrado estéril, BioReagent, adequado para hibridoma, ≥ 99,7%	Sigma-Aldrich	D2650	Protocolo Etapa 5.5.
lentivírus policistônico*	e.g. Millipore	SCR511	Etapa 6.4.  Uma fonte comercial de vetor de reprogramação é listada. Usamos rotineiramente o plasmídeo 4 em 1 relatado por Voelkel et al (PMID: 20385817) para gerar lentivírus de reprogramação policistrônica pseudotipado VSV-G internamente. Este plasmídeo pode ser obtido por contato
polybrene	Santa Cruz Biotechnology	sc-134220	Protocolo Etapa 6.4.
MEFs CF1 irradiados	GlobalStem	Protocolo GSC-6301G	Etapa 6.4.
Mídia hESC	Veja a receita incluída no protocolo		Etapa 6.11 do protocolo.
SB431542	Stemgent	04-0010	Etapa 6.11 do protocolo.
PD0325901	Stemgent	04-0006	Etapa 6.11 do protocolo.
Thiazovivin	Stemgent	04-0017	Protocolo Etapa 6.11.
354277	Matrigel BD Biosciences qualificado para hESC		Etapa 6.13.
Placa de Corning, 6 poços	Fisher Scientific	08-772-1B	Protocolo Etapa 6.13.
mTeSR1	StemCell	5850	Protocolo Etapa 6.13.
Balão filtrante descartável de 250 ml (0,22 µ m)	Fisher	SCGP-U02-RE
dispase	StemCell	7923	Protocolo Etapa 7.3.
DMEM/F12	Life Technologies	11320-033	Protocolo Etapa 7.3.
levantador de células	Fisher Scientific	08-100-240	Protocolo Etapa 7.4.
hESC Media**			Etapa 6.11. componentes devem ser misturados e, em seguida, esterilizados por filtro. A mídia pode ser mantida em 4 ° C por até duas semanas. Ao aquecer o meio, não deixe a 37 &graus; C mais de 15 min
DMEM-F12 50/50 mídia	Invitrogen	11330-032	Concentração Final KO
sérum de reposição (KO-SR)	Invitrogen	10828-028	0,2
200 mM L-glutamina	Invitrogen	25030-081	1 mM
55 mM ß-mercaptoetanol	Invitrogen	21985-023	0,1 mM
100x aminoácidos não essenciais	Invitrogen	11140-050	1x
2 µ g/ml Fator de crescimento básico de fibroblastos (b-FGF)	Invitrogen	13256-029	4 ng/ml

de 15 ml Protocolo Etapa .Protocolo de