Artigo de método

Microfluídico Fluxo Chambers utilizando sangue reconstituído ao Modelo Hemostasia e transfusão de plaquetas In Vitro

DOI:

10.3791/53823

⸱

19 de março de 2016

 ,  ,  ,  , 
1Transfusion Research Center, Belgium Red Cross-Flanders, 2Blood Service, Belgium Red Cross-Flanders, 3Department of Public Health and Primary Care, Catholic University of Leuven, 4Faculty of Medicine and Health Sciences, University of Ghent

Neste artigo

Resumo

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A transfusão de plaquetas e hemostasia foi modelada usando reconstituição sanguínea e câmaras de fluxo microfluídico para investigar a função dos bancos de plaquetas de sangue. Os dados demonstram as consequências da lesão de armazenamento plaquetário na hemostasia, in vitro.

Resumo

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As plaquetas sanguíneas preparadas para transfusão perdem gradualmente a função hemostática durante o armazenamento. A função plaquetária pode ser investigada usando uma variedade de experimentos in vitro (indiretos), mas nenhum deles é tão abrangente quanto as câmaras de fluxo microfluídico. Nesse protocolo, a reconstituição do sangue fresco trombocitopênico com plaquetas armazenadas no banco de sangue é utilizada para simular a transfusão de plaquetas. Em seguida, a amostra reconstituída é perfundida em câmaras de fluxo microfluídico que mimetizam a hemostasia em proteínas expostas da matriz subendotelial. Os efeitos da doação de sangue, transporte, separação de componentes, armazenamento e inativação de patógenos podem ser medidos em projetos experimentais pareados. Isso permite uma comparação confiável do impacto que cada manipulação na preparação de componentes sanguíneos tem na hemostasia. Nossos resultados demonstram o impacto do ciclo de temperatura, taxas de cisalhamento, concentração de plaquetas e duração de armazenamento na função plaquetária. Em conclusão, este protocolo analisa a função das plaquetas do banco de sangue e isso ajuda na otimização da cadeia de processamento, incluindo flebotomia, transporte, preparação de componentes, armazenamento e transfusão.

Introdução

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Hemostasia requer a atividade combinada e regulado de células, proteínas, íons e tecidos em um contexto espaço-temporal restrito 1. actividade não controlada pode conduzir a hemorragia ou trombose e morbidade ou mortalidade num espectro de distúrbios relacionados com a coagulação do sangue. Um experimento de câmara de fluxo microfluídico é uma técnica desafiadora que imita hemostasia in vitro. Esta abordagem permite a investigação da interação complexa de processos que fazem parte de hemostasia com um papel de liderança para as plaquetas do sangue.

A seguir a lesão vascular, as plaquetas aderem às proteínas de matriz subendotelial exposta (glico) para evitar a perda de sangue. Após a adesão, activação e agregação de plaquetas em resposta a auto- e paracrino sinalização que, finalmente, conduz à formação de uma rede de plaquetas, estabilizado por fibrina e resultando num firme, ferida trombo 2 de vedação. Diferentemente da maioria dos outros testes de função plaquetária, experimentos com câmaras de fluxo tomar em consideração o parâmetro físico do fluxo sanguíneo e, portanto, a influência de reologia nas células que participam biomoléculas e 3,4.

experimentos câmara de fluxo geraram conhecimentos marco na hemostasia e trombose variando parâmetros-chave que influenciam hemostático (sub) processos, incluindo os perfis de matriz adesiva, reologia e fluxo, composição celular, presença de toxinas ou drogas, força iônica e muitos mais. Nas últimas duas décadas, o baixo rendimento experimentos câmara de fluxo que exigem grandes volumes de amostras (10-100 ml) evoluíram para câmaras microfluídicos, muitas vezes consistem em câmaras de placas paralelas pequenas e incluindo a tecnologia moderna para perfusão de sangue total em condições de cisalhamento controladas 5. Microscaling aumentou significativamente ensaio de rendimento principalmente porque a configuração de hardware tem simplificado e menos volume (sangue) é necessário, tornando a experiência mais acessível e Versatile. Por exemplo, o sangue a partir de pequenos animais de laboratório pode agora ser utilizado sem a necessidade de sacrificar os animais. As amostras de sangue de ratos geneticamente modificados têm, portanto, auxiliado na identificação de moléculas-chave promover ou inibir a hemostasia e em novos conhecimentos básicos 6.

Laboratórios de pesquisa especializados, muitas vezes ainda usam câmaras de fluxo personalizado feito por exemplo, de polidimetilsiloxano (PDMS) 7, que polimeriza em moldes litografadas que pode ser blueprinted por software. A câmara resultante é barato e descartável e pode ser facilmente desmontado para análise post hoc. Além disso, basicamente, qualquer construção de embarcações, incluindo bifurcações ou curvas fechadas podem ser construídas no comando. Esta vantagem é também a sua desvantagem desde normalização já era o principal problema com experimentos câmara de fluxo, e PDMS personalizado feito câmaras não têm ajudado isso. No topo desta questão em particular, revestimento (condições), sondas fluorescentes, anticoagulante, temperaturaratura e tempo entre a amostragem e análise são todos mal padronizado 8. Padronização dessas variáveis ​​é um desafio, mas, no entanto, necessário para permitir a comparação de resultados entre laboratórios. Este tópico é o assunto principal da Sociedade Internacional sobre Trombose e Hemostasia na subcomissão Científico e Normalização em Biorheology 9,10.

Os concentrados de plaquetas (PC) são transfundidas em pacientes que sofrem de várias doenças que provocam trombocitopenia e / ou sangramento. Mas plaquetas no PC são conhecidos para dessensibilizar, especialmente em função do tempo de armazenamento 11, um processo de deterioração associada ao envelhecimento e vulgarmente referidos como lesão de armazenagem de plaquetas. Às vezes é alegado que essas plaquetas restaurar em circulação, uma vez transfundido 12, mas as evidências para isso é escasso. Além disso, a funcionalidade de plaquetas que formam um PC não é rotineiramente testadas porque a relação entre tais ensaios eeficácia terapêutica ou profilática não está claro 13. câmaras de fluxo microfluídicos oferecem um meio para investigar a função plaquetária no PC para otimizar a cadeia de manipulações entre a recolha ea emissora. É uma ferramenta de pesquisa poderosa para (pareados) comparações diretas de PC como já anteriormente publicados 14,15 e é descrito aqui.

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Protocolo

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Este protocolo segue as diretrizes éticas institucionais para a pesquisa em amostras humanas e o consentimento informado foi obtido de todos os doadores envolvidos. Aprovação para as experiências descritas aqui foi obtido do conselho de revisão institucional do Hospital Universitário de Antuérpia.

Nota: as indicações de temperatura são sempre temperatura ambiente, a menos que especificado.

Configuração 1. Preparação Fluxo Câmara

  1. Lanes preparando, Tubing and Pins
    1. Vortex a suspensão de colagénio vigorosamente e diluir 20/01 na solução de glucose isotónica fornecido pelo fornecedor para uma concentração final de 50 ug / ml.
      Nota: Nós usamos colágeno de tendão equino, composta principalmente de tipo fibrilas I. O tipo I de colagénio equino é muitas vezes referida como "Horm" colagénio e é o padrão de ouro para este tipo de ensaio 9, tanto por razões históricas, bem como biológicos. Tipo de colagénio III humano também pode ser utilizado, mas the fibrilas revestimento e menos bem a resposta de plaquetas não é tão forte. Outras superfícies de revestimento também pode ser utilizado, por exemplo Factor de von Willebrand (vWF), fibrinogénio, fibronectina, laminina, vitronectina, trombospondina-1 ou combinações destes 16.
    2. Tome um novo biochip descartável de recipiente do provedor. As dimensões dos biochips utilizados aqui são 0.4W x 0,1H x 20L em mm 3.
    3. Pipeta de 0,8 ul para a pista (s) do biochip microfluídico em uma extremidade do chip e marcar como saída. Certifique-se que a pista está cheia 5 / 6º com o colágeno contendo solução de revestimento preparada no ponto 1.1.1. Certifique-se de que não existem bolhas de ar.
      NOTA: Os canais são parcialmente revestido para evitar a acumulação de fibras de colagénio na entrada do canal (ver discussão).
    4. Incubar a 4 ° C durante 4 horas ou durante a noite num recipiente fechado e humidificada.
    5. Bloquear os canais revestidos por pipetagem de tampão de bloqueio (1,0% (w v) de soro / albumina bovina umd 0,1% (w / v) de glucose em 10 mM de 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanossulfónico (HEPES) solução salina tamponada (HBS; 0,9% (w / v) de NaCl, pH 7,4) na outra extremidade e Mark como entrada. Certifique-se de que a faixa está completamente cheia com o tampão de bloqueio evitando bolhas de ar.
    6. Cortar tubos em igual comprimento (12 cm). Use um por pista e se conectar cada tubo com um alfinete. Por exemplo, um experimento comparando duas condições, realizados em duplicado exigirá quatro trechos de tubulação e quatro pinos para ser preparado.
    7. Lavar a tubagem com água destilada, utilizando uma seringa e uma agulha G 26 ou os conectores de acompanhamento.
    8. Saturar o tubo com tampão de bloqueio. Armazenar em um recipiente fechado e humidif içado, durante um mínimo de 1 hora.
  2. Preparando Bomba e Manifold
    1. Lavar a bomba e manifold com água destilada, remover bolhas de ar.
    2. Aspirar o tampão de bloqueio para fora da pista (s) biochip usando a ponta 10 ul fixo na saída. Limpe a superfície doo biochip com um pó de precisão livre limpeza e álcool desnaturado para remover impressões e poeira.
    3. Fixar o biochip em um estágio do microscópio automatizado. Se mais de uma faixa é usada simultaneamente em uma corrida, conectar o divisor colector de oito pistas para a saída biochip.
      Nota: O divisor colector de oito pistas é uma peça de hardware (Figura S1) ligado à bomba e ao biochip. Ele permite a operação de todas as pistas (oito) disponíveis no biochip um ou uma combinação de pistas que podem ser no software que acompanha definidos pelo operador.
    4. Use os pinos na tubulação para corrigi-los na entrada biochip. Colocar a outra extremidade da tubagem (sem pinos) num tubo de ensaio cónico de 1,5 ml cheio com HBS. Lavar todos os tubos e as suas faixas ligadas com 1 ml de HBS de usar a bomba, de modo a remover o restante tampão de bloqueio e fracamente aderente colagénio.

2. Preparação de amostras de sangue

  1. Coleta e separação desangue total fresco de um voluntário saudável. 17
    1. Recolher os primeiros mililitros de sangue em tubos evacuados contendo ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) como anticoagulante e exclusivamente utilizar esta amostra para contagem de sangue completo (CBC) com um analisador hematológico automático.
    2. Recolher um volume de sangue de um anticoagulante adequado, utilizando tubos de vácuo. anticoagulantes padrão para experimentos câmara de fluxo são heparina ou hirudina quando fibrina formação não faz parte do protocolo de estudo e citrato de sódio quando é.
      Nota: a heparina foi utilizada como anticoagulante para todas as experiências descritas nos resultados.
      Nota: A quantidade de sangue depende do número de experiências para ser executado. Cerca de um tubo (7 ml) por 3 vias.
    3. Colocar os tubos num rotor pendente reconstituição sangue.
      Nota: O ensaio deve ser concluído no prazo de 3 horas de flebotomia.
    4. Centrifuga-se durante 15 min a 250 g para preparar plasma rico em plaquetas (PRP). Não use a pausa centrífuga para não perturbar o pellet ligeiramente comprimido.
      1. Quando mais do que um tubo foi recolhida, reunir o sangue num tubo de centrifugação cónico.
        Nota: A centrifugação pode ser feito mais lentamente ou menos longo, dependendo do rendimento de PRP e "contaminação" diferencial de células preferidos.
    5. Retirar e descartar o PRP e creme leucocitário produzindo concentrado de hemácias com poucas plaquetas.
      Nota: A contagem das plaquetas na fracção de glóbulos vermelhos embalados é de 13 ± 5 x 10 3 por ul (média ± DP, n = 12) em média nas nossas mãos.
  2. Reconstituição de sangue
    1. Descongelar grupo sanguíneo AB (Rhesus D negativo) o plasma a 37 ° C durante 5 min e 20 seg por 4 ml.
    2. Determinar o hematócrito dos glóbulos vermelhos empacotados em 2.1.5 preparados usando um analisador hematológico automático.
    3. Determinar a concentração de plaquetas no banco de sangue preparadas plaquetas concentrado thaT vai ser utilizado para reconstituir a fracção de glóbulos vermelhos acima.
    4. Calcule o volume de concentrado de hemácias e concentrado de plaquetas que irão produzir 40% de hematócrito e 250 x 10³ plaquetas / ul em uma amostra de 1 ml.
      Nota: Outros títulos de células alvo pode ser definido arbitrariamente, dependendo do protocolo do estudo.
    5. Transferência embalado células vermelhas do sangue e de plasma para um tubo fresco, utilizando uma ponta de pipeta cortada e adicionar concentrado de plaquetas até um volume de amostra de 1 ml é atingida.
      Nota: Dependendo das variáveis ​​estudadas, a fração de plasma deve ser igual em todas as amostras reconstituídas porque plasma tem uma influência significativa sobre a taxa de formação de trombos. Por exemplo, repetido de congelação-descongelação ou plasma retirado de doadores diferentes ou em diferentes anticoagulantes podem influenciar o resultado.
    6. Misture o sangue reconstituído suavemente por inversão e realizar um CBC.
    7. Prepara-se uma amostra de controlo "em branco", na qual o volume da fracção de plaquetas é substituídopelo mesmo volume de 0,9% (m / v) de cloreto de sódio em água para determinar a concentração de plaquetas endógenas (isto é, não-bancárias de sangue plaquetas) no sangue reconstituído usando um CBC.
  3. Marcação
    1. Pipeta de 1 ml reconstituído sangue num tubo de ensaio contendo 1 ul de 5 mM de calceína AM (5 uM de concentração final).
      Nota: Outros corantes celulares podem ser usados ​​14.
    2. Misture delicadamente por inversão.
    3. Incubar durante 5 min a 37 ° C antes de usar.

3. Perfusão Assay

  1. Concentre o objectivo de as fibras de colagénio aderiram ao fundo das pistas. O ideal é usar as configurações de contraste de interferência diferencial (DIC) de contraste de fase ou para esta estratégia de focalização. Selecione 'Z atual definido para as regiões telha selecionados' no software experimento para corrigir digitalmente os Z-posições selecionadas.
  2. Seleccionar uma região de interesse (ROI) na pista (XY) no software do experimento microscope que será gravado durante o experimento.
    Nota: O ROI pode ser de qualquer área de superfície escolhido arbitrariamente dentro de uma pista de perfusão. É aconselhável não para analisar a formação de trombos perto da entrada e saída de uma pista de modo a evitar efeitos laterais do perfil de fluxo variável nessa região, mesmo que esta seja relativamente pequena. A área de superfície ROI deve conter um número significativo de plaquetas ou de trombos para permitir o nivelamento do sinal. Neste protocolo do ROI é um agregado digitalmente costurado de três tamanhos iguais imagens lado-a-lado, resultando em 0,62 milímetros 2 no meio da pista de 2 cm de comprimento.
  3. Misturar suavemente as amostras por inversão e posicionar estes junto ao biochip na fase automatizado.
  4. Colocar o tubo que está ligado com a entrada do biochip nos tubos de ensaio contendo as amostras de sangue reconstituído.
  5. Lançar a bomba a 50 dyne / cm 2 (ou outras tensões de cisalhamento como desejado) para esses canais ligados a tubos de ensaiocontendo as amostras de sangue reconstituídos utilizando o software da bomba.
    Nota: Outros tensões de corte pode ser utilizado.
  6. gravar imagens a cada 15 segundos durante 5 minutos em tempo real usando o software de aquisição e experiência do microscópio.
    Nota: Outra série temporal pode ser utilizado, dependendo do set-up experimental.
    Nota: Em geral, utilizar uma ampliação de 100X (objectiva 10X e 10X lentes), mas superior (ou inferior) de ampliação pode ser facilmente utilizado como uma alternativa.

4. Lave Fora

  1. Lavar todos os tubos ligados à tomada e ligado ao colector ou multicanal bomba usando água destilada, seguido de hipoclorito de sódio (lixívia) 0,5% (v / v) e, finalmente, NaOH a 0,1 M em água. Descartar o tubo preso à entrada biochip como resíduos perigosos.

Análise 5. Os dados

  1. Determinar a cinética de crescimento do trombo com o software de análise de imagem. Os comandos a seguir são específicos para ZEN2012.
    1. Abra a Análise plugin de imagem para determinar a cobertura da superfície das plaquetas.
    2. Defina o limite de fluorescência na guia Analisar interactivo para definir a intensidade dos pixels que se correlaciona com um sinal positivo, ou seja, uma das plaquetas aderiram ou plaquetas aderentes.
    3. Use Criar tabelas para gerar automaticamente uma planilha que conterá as áreas de superfície separadas (em mm 2) desses "objetos" que contêm pixels com um sinal entre os limiares selecionados. Isto é realizado para cada ponto de tempo.
      Nota: Uma vez que os limiares de fluorescência ter sido escolhido, o software de análise detecta automaticamente 'objetos' no campo de visão que preenchem os critérios. Esses objetos são trombos, pequenos agregados de plaquetas ou plaquetas individuais e abranger uma série de pixels. Cada objeto é listado na planilha separadamente.
    4. Guarde estas planilhas no formato XML e abri-los em um programa de planilhapara outros cálculos.
    5. Total de áreas da superfície dos objectos seleccionados por soma e dividir o resultado pela área total do campo de medição (uM 2). Isto vai produzir a cobertura de superfície relativa (%). Fazê-lo para cada ponto de tempo.
    6. Traçar estas coberturas de superfície em função do tempo de perfusão e calcular a inclinação por regressão linear, obtendo-se a cinética de crescimento de trombos que condição particular.

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Resultados

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Para demonstrar a variação intra-ensaio, três amostras de sangue total reconstituído idênticos foram perfundidos simultaneamente sobre as superfícies de colagénio revestido (Figura 1). Isto resultou em um coeficiente de variação de 8,7%. Esta estatística sugere intra-ensaio aceitável e variação intralaboratorial permitindo comparação fiável entre amostras relacionadas.

A entrada da câmara de fluxo comercial de...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Experimentos câmara de fluxo microfluidicos são uma excelente ferramenta para investigar a função das plaquetas no fluxo sanguíneo e são usados ​​para avaliar a hemostasia in vitro em vários contextos experimentais. Apesar de pobre normalização interlaboratory 9, demonstra-se que dentro do nosso laboratório a variação experimental é aceitável. Isto permite comparar de forma confiável amostras (pareados) dentro de um determinado estudo. Este foi validado utilizando o fenômeno bem documentado de lesão ...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

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Os autores não têm agradecimentos.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubo de vácuo BD com EDTA Becton, Dickinson and Company368856
tubo de vacutainer BD com heparinaBecton, Dickinson and Company368480
Tubo de vacutainer BD com citrato de sódioBecton, Dickinson and Company366575
Hirudin Tubo de sangueRoche6675751 001
Vacutainer BD EclipseBecton, Dickinson and Company368650Agulha de coleta de sangue com suporte pré-acoplado
Ponteiras de pipeta 100-1.000Greiner bio-one740290
Ponteiras de pipeta 2-200Greiner bio-one739280
Ponteiras de pipeta 1-10EppendorfA08928
Tubo 5 mlSimport11691380
Tubo cônico 15 mlGreiner bio-one1888271
Tubo cônico 50 mlGreiner bio-one227261
Seringa de 10 mlBD309604
Toalhetes de precisãoKimtech5511
Vena8 Fluoro+ BiochipsCellix188V8CF-400-100-02P10Nomeado em Figura S1 A como 'Biochip'Vena8
TubingCellix TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100FNomeado em Figura S1 B como 'Tubo descartável'Vena8
AgulhasCellixSS-P-B1IC-B1OC-PACK200Nomeado em Figura S1 B como 'Pin'Conectores
para cabos de entrada simples de biochipsCellixCONNECTORS-B1IC-PACK100
Multiflow8 connectCellixMF8-CONNECT-BIC3-N-THROMBOSISNomeado em Figura S1 B como 'Tubo reutilizável' e 'Divisor'Caixa
umidificadaCellixHUMID-BOX
Software bomba microfluídicaCellixN/AVenaflux Ensaio
Horm Colágeno Takeda/Nycomed1130630Colágeno nativo do tendão equino (tipo I)
Solução isotônica de glicose para diluir o colágeno é suplementada
HEPES tamponado com solução salina (HBS)em casa preparaçãoem casa 10mM 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico (HEPES) solução salina tamponada (0,9% (p/v) NaCl, pH 7,4)
Tampão de bloqueioem casa preparaçãoem casa1,0% (p/v) de albumina de soro bovino e 0,1% (p/v) de glicose em HBS
Calceína AMSondas molecularesC1430
Alvejante 10%em casa preparaçãoem casa preparação
0,1 M NaOHem casa preparaçãoem casa
Álcool desnaturadoFiersT0011.5
Mirus Evo NanopumpCellix188-MIRUS-PUMP-EVOcom Multiflow8. Nomeado em Figura S1 A como 'Bomba' e 'Manifold'Microscópio
ZeissAxio Observer Z1equipado com um colibri-LED e câmera CCD de alta resolução
Microscópio de software ZeissN / AZEN 2012
Analisador de hematologiaSysmexN / A
Centrífuga de mesaEppendorf521-0095
Plaquetas incubaterHelmerPF-48i
Incubação banho-mariaGFL1013
PipetaMarcaA03429
TuboRoller RatekBTR5-12V
Dispositivo de acoplamento estérilTerumo BCTTSCD
Selador de tubosTerumo BCTAC-155
VortexVWR58816-121
preparação em casa

Referências

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