A técnica eletrofisiológica da gravação intracelular é demonstrado e usado para determinar sensibilidades espectrais de células fotorreceptoras único no olho composto de uma borboleta.
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Artigo de método
Determinação dos fotorreceptores celular Sensibilidade espectral em um inseto modelo de
Neste artigo
Resumo
Resumo
gravação intracelular é uma técnica poderosa usada para determinar a forma como uma única célula podem responder a um dado estímulo. Na pesquisa visão, a gravação intracelular tem sido historicamente uma técnica comum usada para estudar as sensibilidades de células fotorreceptoras individuais a diferentes estímulos luminosos que ainda está sendo usado hoje. No entanto, continua a existir uma carência de metodologia detalhada na literatura para os investigadores que desejam replicar experiências de gravação intracelulares no olho. Aqui nós apresentamos o inseto como um modelo para examinar a fisiologia do olho em geral. células fotorreceptoras de insectos estão localizados perto da superfície do olho e são, portanto, fácil de alcançar, e muitos dos mecanismos envolvidos na visão são conservadas entre filos animais. Nós descrevemos o procedimento básico para in vivo de gravação intracelular de células fotorreceptoras no olho de uma borboleta, com o objetivo de tornar esta técnica mais acessível a pesquisadores com pouca experiência anterior em electrophysiology. Introduzimos o equipamento básico necessário, como preparar uma borboleta vivo para o registo, o modo de inserir um microeléctrodo de vidro em uma única célula, e, finalmente, o processo de gravação em si. Nós também explicar a análise básica de dados de resposta matérias para determinar sensibilidade espectral de tipos de células individuais. Embora o protocolo centra-se na determinação da sensibilidade espectral, outros estímulos (por exemplo, luz polarizada) e variações do método são aplicáveis a esta configuração.
Introdução
As propriedades eléctricas de células tais como neurónios são observadas através da medição do fluxo de iões através das membranas celulares, como uma mudança na tensão ou corrente. Uma variedade de técnicas electrofisiológicas foram desenvolvidos para medir bioeléctico eventos em células. Os neurónios encontrados nos olhos dos animais são acessíveis e os seus circuitos muitas vezes é menos complexa do que no cérebro, fazendo com que estas células bons candidatos para estudo electrofisiológico. As aplicações comuns de eletrofisiologia no olho incluem eletrorretinografia (ERG) 1,2 e microeletrodos de gravação intracelular. ERG envolve a colocação de um eléc....
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Protocolo
Todos os animais foram tratados o mais humanamente possível. Os insetos foram enviados como pupas de Costa Rica Entomological Supply, Costa Rica.
1. Heliconius Pupae Cuidados
- Pendure todos pupas espaçadas 2-3 cm de distância em câmara úmida usando os pinos de insetos.
- Após a eclosão, permitir asas para secar em seguida, manter borboletas vivo por pelo menos 1 dia em câmara úmida e alimentar uma solução diluída de mel por dia antes da gravação.
- Diluir o mel com água a cerca de uma solução de mel a 20% em volume, e despeje em um prato raso Petri.
- Traga borboletas individuais para a placa de Petri, um por um. Ao t....
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Resultados
Para muitos elementos da configuração de gravação, uma descrição escrita não fornece detalhes suficientes. A Figura 1 é um esquema dos componentes envolvidos na configuração completa de gravação. Na Figura 2, os espectros são traçados para a luz branca e cada um filtro de interferência para dar um sentido de por que é necessário um factor de correcção eo que é necessário para calcular essa correção. A Figura 3 mostra fotos e um diagrama do braço Cardan que é us.......
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Discussão
gravação intracelular pode ser uma técnica difícil de dominar, devido aos muitos passos técnicos envolvidos. Para experiências com sucesso vários pontos importantes devem ser considerados. Em primeiro lugar, é importante ter uma tabela adequadamente vibratoriamente-isolado no qual é realizada a experiência. Muitos pesquisadores usam tabelas de ar, que separam completamente a mesa a partir da base, dando isolamento de vibração superior. Nossa configuração envolve uma mesa de mármore de espessura com uma caixa de areia no.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Agradecemos ao final de Rudy Limburg para fabricar as perímetro de braço cardan, Kimberly Jamison, Matthew McHenry, e Raju Metherate para nos emprestar equipamentos e Almut Kelber e Kentaro Arikawa, para o incentivo. Este trabalho foi apoiado por uma National Science Foundation (NSF) Graduate Research Fellowship para KJM e concessão NSF IOS-1257627 para ADB
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Pupas | Várias espécies locais disponíveis precisam de licenças do USDA para envio. Carolina Bio Supply tem várias espécies de insetos que podem ser encomendadas dentro dos EUA sem a necessidade de licenças adicionais Grande | ||
| cilindro | Qualquer câmara que permaneça umidificada funcionará | ||
| Alfinetes de insetos, tamanho 2 | BioQuip | 1208B2 | |
| 100% Mel de Algaroba do Deserto Trader | Joe's | Qualquer solução de mel ou sacarose funcionará | |
| Lâmpada de Arco Xenon | Oriel Instruments | 66003 | Oriel agora faz parte da Newport Corporation |
| Universal Power Supply | Oriel Instruments | 68805 | Oriel agora faz parte da Newport Corporation |
| Optical Track | Oriel Instruments | 11190 | Oriel agora faz parte da Newport |
| Corporation Rail Carrier, Large (2x) | Oriel Instruments | 11641 | Oriel agora faz parte da Newport Corporation |
| Transportador Ferroviário, Pequeno (4x) | Oriel Instruments | 11647 | Oriel agora faz parte da Newport |
| Corporation Adaptador de Rosca, 8-32 Macho para 1/4-20 Macho, pacote de 10 | Poste | Newport Corporation TA-8Q20-10 | |
| , 1.0 pol., 0.5 pol. Dia. Aço Inoxidável, 8-32 & 1/4-20 (5x) | Newport Corporation | SP-1 | |
| Suporte de Poste Óptico Antiderrapante, 2 pol., 0.5 pol. Postes de diâmetro, 1/4-20 (5x) | Newport Corporation | VPH-2 | |
| Montagem de lente fixa, 50,8 mm | Newport Corporation | LH-2 | |
| Montagem de lente fixa, 25,4 mm | Newport Corporation | LH-1 | |
| Conjunto de lente condensadora | Newport Corporation | 60006 | |
| Lente de sílica convexa, 50,8 mm | Newport Corporation | SPX055 | |
| Roda de filtro de seis posições, x2 | Newport Corporation | FW1X6 | |
| Cubo de montagem de roda de filtro | Newport Corporation | FWM | |
| Lente de sílica côncava, 25,4 mm | Newport Corporation | SPC034 | |
| Suporte de colimador | Newport Corporation | 77612 | |
| Sonda de feixe colimador | Newport Corporation | 77644 | |
| Conversor de Virola, Terminação SMA para 11 mm Ferrola Padrão | Newport Corporation | 77670 | Este adaptador permite que a fibra óptica se encaixe no suporte do colimador |
| 600 μ m de diâmetro UV-vis fibra obtic cabo | Oriel Instruments | 78367 | Oriel é agora uma parte da Newport Corporation |
| Obturador com unidade de acionamento | Uniblitz | 100-2B | |
| UV Sílica Fundida Metálica ND Filtro, 0.1 OD | Newport | FRQ-ND01 | |
| UV Sílica Fundida Metálica ND Filtro, 0.3 OD | Newport | FRQ-ND03 | |
| UV Sílica Fundida Metálica ND Filtro, 0.5 OD | Newport | FRQ-ND05 | |
| Filtro ND de sílica fundida UV, 1.0 OD | Newport | FRQ-ND10 | |
| Filtro ND metálico de sílica fundida UV, 2.0 OD | Newport | FRQ-ND30 | |
| Filtro ND metálico de sílica fundida UV, lâmpada 3.0 OD | Newport | FRQ-ND50 | |
| LS-1-Cal Ocean | Optics | LS-1-Cal | |
| Espectrômetro | Ocean Optics | Software USB-2000 | |
| SpectraSuite | Ocean Optics | ||
| Filtro passa-banda de interferência, 300 nm | Edmund Optics | 67749 | |
| , 310 nm | Edmund Optics | 67752 | |
| , 320 nm | Edmund Optics | 67754 | |
| , 330 nm | Edmund Optics | 67756 | |
| , 340 nm | Edmund Optics | 65614 | |
| , 350 nm | Edmund Optics | 67757 | |
| , 360 nm | Edmund Optics | 67760 | |
| 370 nm | Edmund Optics | 67761 | |
| , 380 nm | Edmund Optics | 67762 | |
| , 390 nm | Edmund Optics | 67763 | |
| , 400 nm | Edmund Optics | 65732 | |
| , 410 nm | Edmund Optics | 65619 | |
| , 420 nm | Edmund Optics | 65621 | |
| , 430 nm | Edmund Optics | 65622 | |
| , 440 nm | Edmund Optics | 67764 | |
| , 450 nm | Edmund Optics | 65625 | |
| , 460 nm | Edmund Optics | 67765 | |
| , 470 nm | Edmund Optics | 65629 | |
| , 480 nm | Edmund Optics | 65630 | |
| , 492 nm | Edmund Optics | 65633 | |
| , 500 nm | Edmund Optics | 65634 | |
| , 510 nm | Edmund Optics | 65637 | |
| , 520 nm | Edmund Optics | 65639 | |
| , 532 nm | Edmund Optics | 65640 | |
| 540 nm | Edmund Optics | 65642 | |
| , 550 nm | Edmund Optics | 65644 | |
| , 560 nm | Edmund Optics | 67766 | |
| , 570 nm | Edmund Optics | 67767 | |
| , 580 nm | Edmund Optics | 65646 | |
| , 589 nm | Edmund Optics | 65647 | |
| , 600 nm | Edmund Optics | 65648 | |
| , 610 nm | Edmund Optics | 65649 | |
| , 620 nm | Edmund Optics | 65650 | |
| , 632 nm | Edmund Optics | 65651 | |
| , 640 nm | Edmund Optics | 65653 | |
| , 650 nm | Edmund Optics | 65655 | |
| , 660 nm | Edmund Optics | 67769 | |
| , 671 nm | Edmund Optics | 65657 | |
| , 680 nm | Edmund Optics | 67770 | |
| , 690 nm | Edmund Optics | 65659 | |
| , 700 nm | Edmund Optics | 67771 | |
| de Faraday | Qualquer estrutura metálica que possa ser aterrada e que se encaixe na configuração experimental funcionará. | ||
| Estereomicroscópio, 6X, 12X, 25X, 50X ampliação | Wild Heerbrugg | Wild M5 | Qualquer estereomicroscópio servirá |
| Suporte de microscópio com braço oscilante e base pesada | Instrumentos | Qualquer base pesada com braço servirá | |
| Braço | Construído sob medida, Veja Figura 4 | ||
| Iluminador de alta intensidade Fiber-lite | Dolan-Jenner | MI-150 | Para espécime de iluminação |
| Guia de luz de pescoço de ganso Fiber-lite | Dolan-Jenner | EEG 2823 | Qualquer guia de luz de pescoço de ganso servirá |
| Mesa | |||
| Mesa | O furo deve ser cortado através desta mesa para que a caixa de areia possa descansar na mesa de mármore embaixo | ||
| Caixa de madeira cheia de areia | personalizada, qualquer caixa com areia | ||
| Manipulador | Carl Zeiss - Jena | ||
| Suporte de eletrodo | |||
| Estágio de amostra Fios | |||
| de clipe jacaré para aterramento | |||
| Fio | |||
| Fio de prata, 0,125 mm de diâmetro | World Precision Instruments | AGW0510 | |
| cabos | BNC | ||
| Pré-amplificador com cabeçote | Dagan Corporation | IX2-700 | |
| Humbug Redutor de ruído | Quest Scientific | Humbug | |
| Osciloscópio, 30 MHz, 2 CH, Dual Trace, Alt-triggering, sem sonda | EZ Digital | os-5030 | |
| BNC T-adapter | |||
| Powerlab hardware 2/20 | ADI instruments | ML820 | |
| Software Labchart | Instrumentos ADI | Gráfico 5 | |
| Gerador de pulsos de 10 MHz | BK Precision | 4030 | |
| Extrator de pipetas de vidro | Sutter Instruments | P-87 | |
| Capilares de vidro borosilicados com filamento | World Precision Instruments | 1B120F-4 | |
| Cloreto de potássio, 3 M | |||
| de plástico com fenda | |||
| Cera | |||
| Solda Ferro | Plataforma Weller | ||
| com base magnética de bola e soquete | Hama foto e vídeo | ||
| Aço carbono de borda dupla, lâmina de barbear quebrável | Microscopia Eletrônica Ciências | 72004 | |
| Vaselina | |||
| Microsoft Excel | Microsoft |
Referências
- Beckmann, H., et al. Spectral sensitivity in Onychophora (velvet worms) revealed by electroretinograms, phototactic behaviour and opsin gene expression. J. Exp. Biol. 218, 915-922 (2015).
- Leboulle, G., et al.
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Reimpressões e permissões
