Summary
Den elektrotekniken av intracellulära inspelning demonstreras och används för att bestämma spektrala känslighet av enstaka fotoreceptorceller i föreningen ögat av en fjäril.
Abstract
Intracellulära inspelning är en kraftfull teknik som används för att avgöra hur en enda cell kan svara på en viss stimulans. I Vision Research, har intracellulära inspelning historiskt varit en vanlig teknik som används för att studera känsligheten hos individuella ljusmätare celler till olika ljus stimuli som fortfarande används idag. Det finns dock fortfarande en brist på detaljerad metod i litteraturen för forskare som vill replikera intracellulära inspelning experiment i ögat. Här presenterar vi insekten som en modell för att undersöka ögat fysiologi mer generellt. Insektsljusmätare celler ligger nära ytan av ögat och är därför lätt att nå, och många av de mekanismer som är involverade i en syn bevaras över djur phyla. Vi beskriver den grundläggande proceduren för in vivo intracellulära inspelning av fotoreceptorceller i ögat av en fjäril, med målet att göra den här tekniken mer tillgänglig för forskare med liten tidigare erfarenhet av electrophysiology. Vi introducerar den grundläggande utrustning som behövs, hur man förbereder en levande fjäril för inspelning, hur man sätter en glasmikro till en enda cell, och slutligen förfarandet inspelningen själv. Vi förklarar också den grundläggande analysen av råsvarsdata för att bestämma spektrala känsligheten hos enskilda celltyper. Även om våra protokoll fokuserar på att bestämma spektrala känslighet, andra stimuli (t.ex. polariserat ljus) och variationer av metoden kan tillämpas på denna inställning.
Introduction
De elektriska egenskaperna hos celler såsom neuroner observeras genom mätning av jonflöde över cellmembran som en förändring i spänning eller ström. En mängd olika elektrofysiologiska tekniker har utvecklats för att mäta bioelektriska händelser i celler. Nervceller som finns i ögonen hos djur är tillgängliga och deras kretsar är ofta mindre komplicerad än i hjärnan, vilket gör dessa celler goda kandidater för elektro studie. Vanliga tillämpningar av elektrofysiologi i ögat innefattar elektroretinografi (ERG) 1,2 och mikro intracellulära inspelning. ERG innebär att placera en elektrod i eller på ögat hos ett djur, med ett lätt stimulus och mätning av förändringen i spänning som en summa av svaren från alla närliggande celler 3-6. Om man är särskilt intresserad av att karakterisera spektrala känslighet enskilda ljusmätare celler, ofta flera celltyper samtidigt svara på olika styrkor till en viss stimulans, sålunda detkan vara svårt att avgöra känsligheten hos specifika celltyper från ERG uppgifter särskilt om det finns flera olika typer av spektralt liknande fotoreceptorceller i ögat. En möjlig lösning är att skapa transgena Drosophila med ljusmätare (opsin) gen av intresse uttrycks i majoriteten R1-6 cellerna i ögat och sedan utföra ERG 7. Potentiella nackdelar med denna metod inkluderar nej till låg expression av fotoreceptor-protein 8 och den långa tidsramen för generering och screening av transgena djur. För ögonen med färre typer av spektralt distinkta fotoreceptorer, kan anpassning av ögat med färgade filter hjälpa till med att sänka bidraget från vissa celltyper till ERG, varigenom uppskattning av spektral känslighet maxima 9.
Intracellulära inspelning är en annan teknik där en fin elektrod spetsar en cell och en stimulans tillämpas. Elektrod poster endast att individual cellens svar så att inspelning från och analysera flera enskilda celler kan ge specifika känsligheter fysiologiskt olika celltyper 10-14. Även om våra protokoll fokuserar på analys av spektrala känslighet, de grundläggande principerna för intracellulär inspelning med skarpa elektroder är modifierbara för andra tillämpningar. Med hjälp av en annan beredning av ett prov, till exempel, och med vassa kvarts elektroder, kan en spela in från djupare i synnerven lob eller andra regioner i hjärnan, beroende på den fråga som ställdes. Exempelvis svarstider av individuella fotoreceptorceller 15, cellaktivitet i optiken loberna 16 (lamina, medulla eller lobula 17), hjärna 18 eller annan ganglier 19 kan också spelas in med liknande tekniker, eller färg stimuli kunde ersättas med polarisation 20 -22 eller rörelse stimuli 23,24.
Ljusöverledningen, den process genom vilken ljusenergi absorberas och omvandlas till en elektrokemisk signal, är en gammal egenskap gemensam för nästan alla dagens djur phyla 25. Den visuella pigment som finns i ljusmätare celler och ansvarig för att initiera visuell ljusöverledningen är rhodopsin. Rodopsin i alla djur är uppbyggda av en opsin protein, en medlem av den 7 transmembran G-proteinkopplade receptorfamiljen, och en tillhörande kromofor som är härledd från retinal eller en liknande molekyl 26,27. Opsin aminosyrasekvens och kromofor struktur påverkar absorbansen av rhodopsin till olika ljusvåglängder. När en foton absorberas av kromoforen den rodopsin blir aktiverad, initiera en G-protein kaskad i cellen som i slutändan leder till öppnandet av membranbundna jonkanaler 28. Till skillnad från de flesta neuroner, ljusmätare celler genomgå graderade eventuella förändringar som kan mätas som en relativ förändring som svar amplitud med skiftande ljus stimulans. Typiskt en givenfotoreceptor typ uttrycker endast en opsin gen (även om undantag finns 8,10,29-31). Sofistikerad färgseende, av det slag som finns i många ryggradsdjur och leddjur, uppnås med ett komplext öga av hundratals eller tusentals ljusmätare celler vardera uttrycker en eller ibland flera rhodopsin typer. Visuell information fångas genom att jämföra svaren över fotoreceptorn mosaik via komplexa nedströms neurala signaleringen i ögat och hjärnan, vilket resulterar i uppfattningen av en bild komplett med färg och rörelse.
Efter mätning av den råa svar av en ljusmätare cell till olika våglängder av ljus via intracellulära inspelning, är det möjligt att beräkna dess spektrala känslighet. Denna beräkning bygger på principen om Univariance, där det sägs att en ljusmätare cell svar är beroende av antalet fotoner det absorberar, men inte på de särskilda egenskaperna hos de fotoner absorberar 32. Någon fotonen som är absorbed av rhodopsin kommer att framkalla samma typ av svar. I praktiken innebär detta att en cell rå responsamplitud kommer att öka på grund av antingen en ökning av ljusintensitet (fler fotoner att absorbera), eller en förskjutning i våglängd mot sin topp känslighet (högre sannolikhet för rhodopsin absorbera den våglängden). Vi utnyttjar denna princip i rör cellulära svar på kända intensitet och samma våglängd till svar på olika våglängder och samma intensitet men okända relativa känsligheten. Celltyper identifieras ofta av den våglängd vid vilken deras känslighetstoppar.
Här visar vi en metod för intracellulär registrering och analys av spektrala känslighet fotoreceptorer i ögat av en fjäril, med fokus på att göra den här metoden mer tillgänglig för en bredare forskarsamhället. Även intracellulära inspelning fortfarande vanligt i litteraturen, i synnerhet med avseende på färgseendet hos insekter, har vi funnit that beskrivningar av material och metoder är oftast alltför kort för att medge reproduktion av tekniken. Vi presenterar denna metod i videoformat med syfte att tillåta dess lättare replikering. Vi beskriver också den teknik med hjälp av lätt erhållas och prisvärd utrustning. Vi vänder oss till vanliga varningar som ofta inte redovisas, vilket bromsar forskning när man optimerar en ny och komplicerad teknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Samtliga djur behandlades så mänskligt som möjligt. Insekter sändes som puppor från Costa Rica Entomological Supply, Costa Rica.
1. Heliconius Puppor Care
- Hang alla puppor avstånd 2-3 cm från varandra i en fuktig kammare med hjälp av insekter stift.
- Efter eclosion Låt vingar torka sedan hålla fjärilar vid liv åtminstone en dag i en fuktig kammare och mata en utspädd honung lösning dagligen före inspelning.
- Späd honung med vatten till ca 20% honung lösning i volym, och häll i en grund petriskål.
- Föra enskilda fjärilar till petriskål, en efter en. Vid röra lösningen med sin främre tarsi kommer fjärilarna automatiskt förlänga sina proboscides och dricka ur petriskål. Om deras snabel inte automatiskt förlänga använder pincett för att dra snabel ut och presentera det till honung lösning.
2. Optisk Track, kalibrering, och Measurement av experimentella ljusförhållanden
- Placera en 150 W Xenon båglampa med bostäder och universell strömförsörjning och en bifogad samlingslinsen montering i ena änden av ett bord minst en meter lång tid att leverera starkt vitt ljus.
VARNING: xenonlampa producerar extremt starkt ljus med starka UV-intensiteter. Skyddsglasögon skall bäras hela tiden och lampan bör användas enligt anvisningar från tillverkaren för att förhindra ackumulering av ozon som orsakas av interaktion av UV-ljus med luftens syre. - Inrätta ett optiskt spår en meter i längd för ljus som lämnar husenheten för att passera genom (Figur 1).
- Plats i följande ordning på den optiska banan med ungefärliga avstånd från varandra: 1) en konvex kiseldioxid eller kvarts lins 40 cm från kondensorn montering, 2) ett neutralt densitetsfilterhjul (utan filter för närvarande i ljusbanan) 22 cm längre längs spåret, 3) en slutare med drivenhet 14 cm från ND-filtrets, 4) en konkav kiseldioxid eller kvarts lins omedelbart intill efter slutaren, och 5) en kollimerande balk sond 6 cm längre längs den bortre änden av spåret.
- Fäst en 600 pm diameter fiberoptisk kabel till kollimerande trålen sond.
Obs! Beroende på ljusintensitet, kan en 5-10 mm diameter fiberoptisk kabel att krävas för att leverera tillräckligt med ljus till andra preps och kan ersätta detta. - Justera avståndet, höjd och vinkel för varje optiskt element så att ljusstrålen som lämnar aggregatet är vid den högsta intensiteten möjligt.
- Som optiska spårelement kan skilja sig något med olika applikationer, se till att alla delar sända ljus i UVA och synliga området (315-700 nm).
- När den optiska banan är monterad, mäta det ljus som passerar genom konfigurationen med en spektrometer. Kalibrera spektrometern först med hjälp av en kalibreringslampa med en känd spektrum och tillverkarens programvara.
NoteraVi beskriver följande konfigureras med Ocean Optics produkter för klarhet, men andra tillverkare (t.ex. Avantes) säljer jämförbara produkter.- Slå på volframkalibreringslampa åtminstone 45 minuter innan mätningar.
- För att kalibrera, fästa spektrometern via USB till en dator med tillhörande programvara installerad. Anslut sedan spektrometern till volframkalibreringslampa via en UV-synlig sändnings cosinus corrector.
- Välj "New Absolute irradians Measurement" från "File" -fliken och välj spektrometern som "Source".
- Följ anvisningarna för att skapa en ny kalibrering "cal" fil. När du uppmanas ladda det medföljande datafilen för den kända spektrum av volframkalibrerings lampan i det synliga ljusområdet (300-800 nm) i mjukvaran, som automatiskt beräknar den korrigerade spektrumet från spektrometern utgång.
- Spara kalibreringsfilen. Ladda den här filen när initializing programvaran för alla framtida mätningar av ljusspektra med användning av spektrometer.
- När spektrometern kalibreras, använda detta för att registrera ljusspektra från experimentuppställning. Härefter när programmet öppnas, välj "Ny Absolute irradians Measurement" och ladda tidigare sparade kalibreringsfilen. Nästa ta en mörk spektrum genom att blockera allt ljus till spektrometern.
- Med spektrometern närvarande mäta önskade experimentella ljusförhållanden, justera integrationstiden (4 ms), till skannar genomsnitt (5), och boxcar bredd (5), så spektrumet korrekt skalas och jämnas ut. Håll inställningarna densamma för alla spektrala mätningar så att ljusintensitet från olika mätningar kan jämföras.
- Mät spektra för odämpade vitt ljus för alla neutrala täthetsfilter som används under experimenten, och för varje bandpassinterferensfilter (Figur 2).
- Measure det vita ljuset spektrum utan några filter i strålgången genom att fästa den fria änden av den fiberoptiska kabeln från steg 2.2.2 till spektrometern. Med kalibreringsfilen laddas från steg 2,3, spara den vita ljusspektrat med hjälp av spektrometern programvara som en textfil.
Obs: Spectra sparas som textfiler lista våglängden (X-koordinater) i en kolumn och ljusintensiteten (y-koordinater) i den andra kolumnen, så att data kan laddas in i ett kalkylprogram för steg 2,6. - Genom att använda samma inställningar som steg 2.5.1, spela spektrumet från varje optisk densitet (OD) (0-3,5 OD) som används under experiment genom att rotera neutral densitet (ND) filterhjul i den optiska banan, och spara textfilen för varje OD.
- Genom att använda samma inställningar som steg 2.5.1, placera 10 nm halv bandbredd interferensfilter en efter en in i ljusbanan och spela in det spektrum som observerats för varje filter. Upprepa denna procedur för varje 41 olika interferensfilter wte topptransmittans avstånd var 10 nm 300-700 nm. Filter placerade längre från varandra (20 nm) är acceptabla för de flesta applikationer (för spektra, se figur 2).
- Measure det vita ljuset spektrum utan några filter i strålgången genom att fästa den fria änden av den fiberoptiska kabeln från steg 2.2.2 till spektrometern. Med kalibreringsfilen laddas från steg 2,3, spara den vita ljusspektrat med hjälp av spektrometern programvara som en textfil.
- Korrekt för skillnader i ljusintensitet när interferensfilter placeras i ljusbanan. Varje interferensfilter tillåter en annan totala antalet fotoner att passera, och den låga överföringen av vissa filter gör det svårt att ytterligare dämpa intensiteten så att alla filter kan lika antal fotoner.
- För att beräkna den relativa intensiteten (I) för varje 10 nm bandbredd interferensfilter, lösa jag i uttrycket I = T / sekund, där T är arean under den spektrala kurvan för varje 10 nm interferensfilter (från 2.5.3) och s är det högsta absoluta irradians (y-värdet av sparade textfil från 2.5.1) av vitt ljus på toppvåglängd av varje filter (se figur 2 för ett exempel på 520 nm).
- Dela alla beräknade intensittalet av max intensitetsvärdet beräknas i 2.6.1 för att relatera till en, och ta det reciproka värdet av de relativa normaliserade värden för användning som en korrektionsfaktor tillämpas på råvaran känsligheten vid varje våglängd (se steg 6.4).
- Utför steg 2,1 genom 2,6 endast en gång innan en serie experiment. Under ett experiment med jämna mellanrum registrera absoluta irradians av xenonbåglampan i starkt ljus och neutrala täthetsfilter, för att säkerställa att intensiteten hos ljuset stimulans ändras inte.
- Under loppet av ett experiment, om någon cellulärt svar på ljus som transmitteras genom de interferensfilter närmar sig den maximalt svar amplitud, använd ND-filter för att dämpa signalen. Om ND-filter används under ett experiment, svarar för motsvarande minskning i intensitet under beräkningen av spektrala känslighet.
- Inrätta optisk spår, kalibrering och filter dagar eller veckor innan experiment börjar. hålla filtertäckas för att förhindra dammansamling.
3. inspelningsutrustning Setup
- Mata samma fiberoptiska kabel som används för kalibrering genom en Faradays bur och montera på en goniometrisk anordning såsom en Cardan arm omkrets (se figur 3 för diagrammet). Kabeln kommer att vara cirka 10 cm från ögat av provet.
- Placera en metallstadiet på en vibrationsmässigt isolerad bord med en elektrodhållare monterad direkt ovanför scenen under kontroll av en mikromanipulator (Figur 4). Placera Cardan armen så att provet huvud är i centrum av sfären som skapats av armens vridrörelse.
- Använda en intracellulär förförstärkare system, som innefattar en förstärkare (utanför Faradays bur) och förförstärkaren (huvudsteg, nära prep inuti Faradays bur) montera huvudsteg ovanför metall stadium där provet kommer att placeras.
- Anslut en koaxialkabel till huvudsteg via enBNC-anslutning. Split öppen bara toppen på den andra änden av koaxialkabeln, och separera yttre metallhölje av kabeln från den inre tråden.
- Löda den yttre manteln (hålls vid jordpotential) till en ände av en isolerad koppartråd med en krokodilklämma i den andra änden. Detta krokodilklämman fäster till metallreferenselektrod på provplattformen (steg 5.1.4).
- Löda inre viran hos koaxialkabeln till en tunn silvertråd, för att tjäna som inspelningen elektroden. Denna tråd bör vara tillräckligt tunn för att matas in i lösningen fyllda glaselektrod i steg 5.2.3.
- Placera ett stereomikroskop fäst vid en svängande arm och bas på träbänk utanför Faradays bur, så att den kan svängas in för att sänka elektroden in i ögat, och svängde tillbaka ut igen när elektroden är i ögat.
- Se till att allt metall inuti Faradays bur är ordentligt jordad.
- Utanför Faradays bur, fäst preamplifer till ingången på en 50-60 Hz brusreducerare (tillval), och ansluta utgången till en kanal av ett oscilloskop med hjälp av en BNC T-adapter.
- Med användning av den andra änden av den T-adaptern, ansluta signalen passerar genom oscilloskopet till en kanal av hårdvaran. Bifoga hårdvara till en dator via en USB-kabel, vilket gör att svaren som spelats in med förförstärkaren för att läsas av mjukvara på datorn.
- Montera avstängnings föraren från den optiska banan till den andra kanalen av oscilloskopet med en annan T-adapter och anslut den till en pulsgenerator som kommer att styra frekvensen och varaktigheten av ljusblixtar som levereras till ögat (steg 5,5).
Obs: Inställning av riggen själv endast behöver göras en gång. Bryt här tills redo att börja inspelningarna.
4. Prep på dagen av inspelning
- Slå på Xenon-lampa åtminstone 45 minuter före försöket och slå på glasmikroelektrod avdragare åtminstone 30 minuter före pulLing glaselektroder.
- Slå på alla färdskrivare (slutare, förstärkare, buller eliminator, pulsgenerator, oscilloskop, och datainsamling hårdvara) och se till att slutaren är stängd som standard så att inget ljus passerar genom den fiberoptiska kabeln.
- Dra fin borosilikat (eller aluminiumsilikat) glasmikroelektroder (100-250 Mohm motstånd är perfekt) med hjälp av en glasmikroelektrod avdragare. Använd glaselektroder inom bara några timmar att dras.
- Återfyllning elektroderna med 3 M kaliumklorid (KCl). Observera att denna lösning kan ändras beroende på forskarens behov, t ex färgämne injektion.
5. Prov Prep och inspelningsordningen
- Förbered Specimen
- Anbringa en individuell fjäril inuti ett litet plaströr med varmt vax så att huvudet är orörliga och som skjuter ut från en ände av röret. Vaxa ner snabel, antenner och vingar (Figur 5).
- Håll ned than buken med en torr bit av vax och hålla röret fuktas genom att placera en våt vävnad inuti röret bakom buken. Se till att provet är helt orörlig.
- Montera röret med hjälp av en liten bit av vax på en liten plattform med en boll-och hylsled som är ansluten till en magnetisk bas.
- Under ett dissektionsmikroskop, infoga en silvertråd av 0,125 mm diameter in i huvudet via mouthparts som skall användas som referenselektrod. Innan försöket permanent fixera kabeln till plattformen på ett sådant sätt att koppartråden i steg 3.3.2 kan klämma på den när plattformen är placerad på scenen för inspelning.
- När referenselektroden är i ett lämpligt läge den kan hållas på plats genom att snabbt smälta och därefter kylning vax runt tråden.
- Med hjälp av en brytbar kolstål rakblad, grepp del av bladet med en bladhållare och bryta av en liten bit för att använda för att skära hornhinnan.
- Skär ett litet hål (~ 10 ommatidien i diameter) i den vänstra hornhinnan med hjälp av rakblad och täta hålet med vaselin för att förhindra uttorkning.
- När väl hornhinnan skärs, sätt inspelningen elektroden in i ögat så snabbt som möjligt eftersom hemolymfa i ögat kommer snabbt härda och göra det omöjligt att föra in en elektrod. Om det är möjligt utföra dissektion i riggen där inspelningen kommer att äga rum.
Notera: vaselin bör inte smetas på resten av ögat eftersom detta kommer defocus optiken.- Om den inte redan på scenen, placera den monterade provet och plattform på scenen i inspelningen riggen. Anslut huvudsteg jordledningen från steg 3.3.2 till referenselektrod på provet plattformen med krokodilklämmor.
Obs: Om det är möjligt att använda ett rött filter för att belysa djuret. - Använd en ljuskälla med sugkopp bilagor kort tända provet under ett stereoskop samtidigt sänka inspelningen elektroden i ögat.
- ISERT silvertråd som är ansluten till huvudsteg från steg 3.3.3 i KCl-lösning i baksidan av en glasmikroelektrod. Montera glaselektrod på elektrodhållaren.
- Justera elektrodhållaren så mikroelektroden är direkt över hålet som tidigare skär i hornhinnan, om en millimeter ovanför hornhinnan. Sänka mikroelektroden in i ögat med hjälp av mikromanipulator tills en krets är fullbordad, såsom visas med en stor förändring i potential (mV) på oscilloskopet.
- Om den inte redan på scenen, placera den monterade provet och plattform på scenen i inspelningen riggen. Anslut huvudsteg jordledningen från steg 3.3.2 till referenselektrod på provet plattformen med krokodilklämmor.
- Väl inne i ögat, svinga stereoskop utanför Faradays bur, och stänga av ljuskälla som belyser provet. Rummet bör hållas mörkt så ögat blir mörkt anpassas.
- Kontrollera resistansen i elektroden genom att applicera en 1 nA ström från förstärkaren och notera förändringen i spänning. Motstånd bör normalt ligga i intervallet mellan 100-250 Mohm. Högre resistanser är indikativa för blockering eller böjning av elektroden, och låga resistanser elektrode brott.
- Aktivera pulsgeneratorn så att slutaren öppnas tillåter en blixt av ljus med en ms varaktighet 50 varje 0,5 sek, och göra det möjligt att fortsätta att blinka under hela experimentet.
- Justera pulsgeneratorn så att den tillåter blixtar av upp till 50 ms varaktighet. Denna varaktighet och 0,5 sek paus mellan blinkar håller provet så nära till mörkt anpassad som möjligt under experimentet. Femtio ms ligger nära den kortaste blixtvaraktigheten som kommer att framkalla samma amplitud som svar som längre flash löptider.
- Re-åtgärd svar på både början och slutet av försöket (steg 5,16). Under loppet av ungefär en tjugo minuters experiment dessa blixtinställningar inte försämra svar över tiden. Olika preps kan kräva justeringar av dessa blixtinställningar.
- Positionera Cardan armen, så att den fiberoptiska kabeln är riktad mot ögat.
- Kontrollera oscilloskop för spänningsförändringar med varje ljusblixt.En negativ förändring i spänning innebär att elektroden ännu inte har gått in i en cell.
- Flytta Cardan armen runt provet tills den är placerad i en vinkel mot ögat vid vilken det finns en maximal spänning svar.
- Rotera mikromanipulator fram och tillbaka, vilket orsakar mycket små vertikala rörelser hos elektroden i båda riktningarna medan knacka lätt på botten av elektrodhållaren eller med hjälp av Buzz funktionen på förförstärkaren. Fortsätt att göra små justeringar tills en depolariserande ljus svar visas på oscilloskopet (Figur 6).
- Justera Cardan armen igen för att hitta infallsvinkeln där en ljusblixt ger den största depolariserande signalen. Gör små justeringar med mikromanipulator och använda Buzz funktionen på förstärkaren som behövs för att se till att elektroden stabilt inspelning cellen och att den kommer att stanna i cellen för hela experimentet (se steg 5,11).
- När installationen är stabil, börjar recording. En stabil inspelning bör ha liten eller ingen förändring i vilopotential, låg bakgrundsljud, och en genomgående stor depolariserande svar (åtminstone 10: 1 signal-brusförhållande).
- Köra programmet på datorn, och börja ett "nytt experiment", som kommer att öppna ett fönster med fyra kanaler.
- Justera spänningen skala det övre högra hörnet av fönstret programvara till 500 mV. Den första kanalen kommer att visa de svar som spelats in från elektroden i realtid, medan den andra kanalen kommer att registrera den fyrkantsvåg som alstras av funktionsgeneratorn, om signalen matas till datainsamling hårdvara via oscilloskopet, som visar när slutaren är öppen . De två andra kanalerna är onödiga.
- Klicka på "Start" i det nedre högra hörnet för att börja spela in, och att programvaran för att köra under hela experimentet. Justera zoom av x (tid) och y (spänning) axlar så att svaren är tydliga.
- Först, med vitt ljus, spela in upp till 10 individuella svar med ND-filter hjul vid 3,5 OD (ca 5-10 sekunder).
- Nästa post samma antal svar på 3,3 OD, då 3,1, 3,0, 2,5, 2,3, 2,1, etc. i varje kombination fram 0,0 OD. Dessa svar amplituder till ND-filter serien kommer att ge svar-log intensitetskurva i avsnitt 6. Om blekning inträffar, använda färre blinkningar ljusa stimuli under försöket.
- Registrera svaret hos cellen till alla våglängder, med användning av de interferensfilter.
- Först hitta toppvåglängden. Utan ND-filter i ljusbanan (0,0 OD), placera en UV-sändande filter i ljusbanan och kort observera responsamplitud. Upprepa med en blå sändande filter, en grön sändarfilter och ett rött sändningsfilter, vilket bör ge en uppfattning om var topp svar kommer att vara.
- Använd filter på cirka 350, 450, 550, 650 nm för att hitta den allmänna regionen topp känslighet isteg 5.14.1. Den exakta våglängd spelar ingen roll i denna första sökning fas eftersom alla våglängder kommer att registreras i nästa steg. Om beräkningarna finns i toppkänsligheter, eller de har tidigare noterats, att använda kända våglängder snabbt identifiera den maximala känsligheten.
- När väl maximal känslighet eller nära det identifieras, spela in vid denna våglängd för 10 svar (ca 5 sek).
- Efter inspelningen vid våglängden för maximal känslighet, spela med de andra interferensfilter, 300-700 nm vid 10 nm steg. Starta från toppen och steg ut mot både kortare och längre våglängder genom att byta filtren ur ljusstrålen en i taget (t.ex. om maximal känslighet är 520 nm, spela in svar på denna våglängd först, därefter 510 nm, följt av 530 nm, 500 nm, 540 nm, 490 nm, 550 nm, och så vidare till dess att inget inget svar).
- Möjliggöra för upp till 10 responser per filter (5 sek vardera). När byta interferensfilter, tillåta att cellen respOND till 1-2 blixtar av vitt ljus utan något filter i ljusbanan, vilket är användbart för att kontrollera om den maximala känsligheten är förnedrande över tiden. Minska antalet svar eller öka OD om blekningen sker.
- Om svaret under någon interferensfilter är för nära maximal respons under vitt ljus vid 0 OD, sedan dämpa med ND-filter. Interferensfilter och storleken av den fiberoptiska kabel som används i detta experiment dämpa kraftigt intensiteten av ljus och så ND-filter är typiskt inte behövs.
- Om inspelningen förblir stabila, åter rekord våglängder kring maximal känslighet, som fungerar som en pseudoreplicate för att bekräfta tidigare svar amplituder och bidrar till att säkerställa responsen har inte degraderas över tiden. När alla våglängder registreras, åter rekord svaren under ND-serien, som i steg 5,12.
- När inspelningen är klar klickar du på "Stop" på programmet, och spara inspelningen för analys.
- Efter ett experiment, offra individen genom frysning eller kylning under flera minuter, följt av snabbt avskärning av huvudet och krossning bröstkorgen.
- Stäng av all utrustning. Bryt här om det behövs innan du gör analysen.
6. Spectral Känslighetsanalys
- Med den programvara som används för att spela in rå svar beräkna den genomsnittliga reaktionen amplitud 10 individuella svar för varje filter i ND-serien och för varje interferensfilter.
- Skapa ett svar-log intensitet (VlogI) funktion från ND-filter serien spelas in i steg från 5,12 till 5,13 (Figur 7). Gör detta genom att avsätta log enheter intensitet (OD) på X-axeln, och svar på varje intensitet på y-axeln.
- För att härleda spektrala känsligheten hos cellen vid olika våglängder, passar vanligtvis Naka-Rushton ekvation till data från steg 6,2 och använda denna ekvation att relatera experimentellt erhållna spektrala svar av olika våglängder to relativa fotoner som krävs för att framkalla detta svar under en konstant våglängd (i det här fallet vitt ljus).
Obs: Naka-Rushton Ekvationen är: V / V max = I n / (I n + K n), där I är stimulusintensitet, V är responsamplitud, är Vmax det maximala svaret amplitud, K är den stimulans intensitet ger ½ V max, och n är den exponentiella lutningen. Olika metoder kan användas för att passa denna ekvation till de VlogI data, inklusive dataprogram för kurvanpassning, eller kod-baserade statistiska paket. - För att montera Naka-Rushton ekvationen med hjälp av enkla beräkningar och ett kalkylprogram, omvandla svarsdata VlogI för varje stimulusintensitet: log [(V max / V) - 1]. utför sedan linjär regression på de transformerade data för att få ekvationen för linjen för bästa passform.
Obs: V max måste vara större än någon uppmätta svar; att hålla detta konsekvent uppskattar denna metod V max 1% greater än den högsta uppmätta svaret. - Från ekvationen för regressionslinjen, uppskatta exponenten (n) genom att ta den negativa lutningen och log (K) = y-skärnings / n.
- För att härleda spektrala känsligheten hos cellen vid olika våglängder, passar vanligtvis Naka-Rushton ekvation till data från steg 6,2 och använda denna ekvation att relatera experimentellt erhållna spektrala svar av olika våglängder to relativa fotoner som krävs för att framkalla detta svar under en konstant våglängd (i det här fallet vitt ljus).
- Förrän parametrarna för Vmax, n, och K har uppskattats, fastställa det relativa antalet fotoner som krävs för att framkalla den spektrala responsen av cellen vid varje våglängd genom att koppla in den uppmätta spektrala svaret vid en given våglängd som (V) och lösa för I.
- Multiplicera det beräknade stimulusintensitet (I) från steg 6,3 av korrektionsfaktorn för varje interferensfilter (från steg 2.4.3) vid varje våglängd.
- Att få känsligheten måste alla intensiteter vara relaterade till V log I-kurvan, så att de kan jämföras. Gör detta genom att relatera varje våglängd intensitet till ½ Vmax eller K, beräknas i steg 6.2.3.
- Subtrahera varje korrigerade våglängd intensitet (steg 6,4) från K.
- Sedan för varje våglängd intensitet, lägga till "avstånd från K-värdet "K, och multiplicera med (-1).
- Nästa bringa alla datapunkter positiva genom att lägga till det absoluta värdet av den lägsta datapunkt i serien för varje våglängd.
- Hitta känsligheten vid varje våglängd genom att ta det reciproka värdet av alla nya beräknade intensiteter från steg 6.5.1. Omvandla informationen så att känsligheten spektrumet faller mellan 0 och 1.
- Efter inspelning från mer än en cell av den typ som genomsnittet samma slut svar och tomt med barer standardavvikelse eller 95% konfidensintervall (Figur 8).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För många delar av inspelningen setup, gör en skriftlig beskrivning inte tillräckligt detaljerat. Figur 1 är en schematisk bild av de komponenter som hela inspelningen setup. I figur 2, är spektra ritas upp för vitt ljus och varje interferensfilter för att ge en känsla av varför en korrektionsfaktor som behövs och vad som krävs för att beräkna denna korrektion. Figur 3 visar bilder och ett diagram över Cardan arm som används för dessa experiment. Figur 4 är en sammansatt bild som visar inspelningssteget och mikromanipulator. Figur 5 visar flera steg i framställningen av en fjäril för experimentet.
När en inspelning börjar, en negativ förändring i spänning som svar på en ljusblixt betyder att elektroden är utsidan av en cell, som i figur 6a. Styrkan av svaret beror på närheten av elektrodentippa till en ljusmätare cell, och infallsvinkeln för ljusblixt. Svaret bör vara stor (> 30 mV) innan tips är nära nog till en cell för att spetsa. Figur 6b visar en tydlig depolariserande svar på ett ljus, vilket innebär inträde i en ljusmätare cellen. Den vilopotential bör vara stabil och svaret amplitud ska vara stora (åtminstone 40 mV), även om den absoluta amplituden kan variera avsevärt. Vi mäter relativa responsen, så det är mer viktigt att signalbrusförhållandet är högt. Om vilande potentiella förändringar kraftigt, ser svarsvågformen ovanligt, eller det maximala svaret är för låg, sedan jämföra relativa svaren för alla interferensfilter blir omöjlig. Exempel på oanvändbara inspelningar visas i figur 6c, 6d.
Efter att ha avslutat en lyckad inspelning, måste ND svar plottas och Naka-Rushton ekvationen ska monteras till data 33, shown i figur 7. Denna figur plottas med användning av ND-filtret serie utan några interferensfilter. Om inspelningen är stabil, bör data från ND-filter serien likna före och efter försöket. Spektrala känsligheten bestäms genom att montera den Naka-Rushton ekvation till VlogI plotten i Figur 7, då lösa ut (I) för varje svar (V) vid en given våglängd, som förklaras i beräkningarna i avsnitt 6 i protokollet.
Ett representativt exempel på spektral känslighet som härrör från en enda inspelning är avsatt i figur 8a (observera detta exempel visar verkliga beräknade data, men toppen har flyttats eftersom detta resultat är opublicerad). Celltyper kan klassificeras genom topp känslighet vid en liknande våglängd och totala formen av känsligheten spektrumet. Liknande celltyper då i genomsnitt och den genomsnittliga känsligheten plottas med barer standardavvikelsen på varje våglängd i Figure 8b. Spektrala känslighet av tre typiska celltyper som finns i en insekt visas i figur 8c (magnitud och felstaplar beräknas från verkliga data, men topparna skiftas).
Figur 1:. Schematisk bild av inspelnings Komponenter Komponenter i ljusbanan, prov installationen och inspelning hårdvara anges. Optisk spår sitter på träbänk utanför Faradays bur. Xe, xenonlampa, Cd, kondensor montering, Lx, konvex lins, ND, neutral densitet filterhjul, Cf, interferensfilter, S, slutare, Lc, konkav lins, Co , kollimerande balk sond, Fo, fiberoptisk kabel. Faradays bur sitter påträbänk runt provet. Den träbänk sitter ovan men inte vidrör vibrations isolerade marmorbord under. Inspelning (Rc) och referens (Rf) elektroder är fästa vid huvudsteg (Hs). Rc införes i ögat (E) och Rf införes i en annan del av kroppen. Det huvudsteg är en del av förförstärkaren (Pa) inställning utanför Faradays bur. Leds signalen från förförstärkaren via Humbug brusreduceraren (Hb), och in i oscilloskopet (Os). Av oscilloskopet signalen ledes genom PowerLab hårdvara (PLB) och in i bärbar dator (CPU), där den läses av LabChart programvara. Slutaren styrs av en funktionsgenerator (Fg) som är förd genom en andra kanal på oscilloskopet, och kan också passera genom en andra kanal på PowerLab maskinvara om denna signal kommer att registreras också.
Figur 2:. White Light och störningsfilter Spectra används för att beräkna korrektionsfaktorer Spektra mättes i steg 2.5 i protokollet visas 300-700 nm, för vitt ljus samt var och en av de 41 interferensfilter. Varje interferensfilter spektrum mäts med bara det filter i ljusbanan. T 520 motsvarar området under spektrum för filtret med toppen 520 nm, och s 520 motsvarar intensiteten av vitt ljus på toppvåglängd av filtret, 520 nm. Dessa värden används för att beräkna korrektionsfaktorer för varje filter (i det här fallet 520 nm) som beskrivs i steg 2,6 i protokollet.
Figur 3:. Beskrivning av Cardan Arm Perimeter Används i experiment Cardan armen håller fiberoptiska kabeln och ger full sfärisk rotation och vinkeljustering så att ljus kan levereras i rätt infallsvinkel till cellen som spelas in. (A) Top down view. (B) Sedd från sidan i en vinkel. Nummer motsvarar samma del i alla paneler. (1) Bottenplattan tillåter full cirkulär rotation i det horisontella planet. (2) Den vertikala plattan tillåter full cirkulär rotation av armen i ett vertikalplan. (3) Denna cylinder håller metall arm med den fiberoptiska kabeln på slutet, och det gör att ett andra vertikalt plan av runda rotationsvinkelrätt mot (2). (4) Den fiberoptiska kabeln hålls in i slutet av armen, och ljuset riktas mot placeringen av provet i experimentuppställning.
Figur 4:. Komponenter i Inställning inspelning (A) Plaströr används för att hålla provet. (B) utgift beskådar av den plattform på vilken provet och röret är monterade. (C) Sidovy av kul- och gemensam plattform med magnetisk bas (1). Referenselektroden hålls orörligt med lim och vax på sidan av plattformen (2). Referenselektrod lindad runt krokodilklämma och löds på plats, vilket ger en fäst område där huvudsteg referenselektroden kan fästa (3). (D) Elektrod spetsen under 20X förstoring. Skalstock, 25 | j, m. (E) Scen, elektrodhållare, och mikromanipulator setup. Den huvudsteg (1) är fäst ovanför apparaten medsilverinspelningstråden (2), och referenselektroden med krokodilklämma (3) som är fäst. Elektrodhållaren (4) är fäst vid en manuell mikromanipulator (5) med ett inlägg nedan som kan justeras med ett vred för vertikal rörelse eller kan skjutas eller dras för horisontell förflyttning av elektrodhållaren. Den magnetiska plattform med provet sitter på scenen (6) strax under elektrodhållaren. (F) Den Faradays bur omger inspelnings installation med en skärm som kan dras upp eller ner i fronten. Aluminiumfolie placeras under all utrustning med gummidynor på toppen. Den fiberoptiska kabeln (1) leder in i buren från den optiska banan utanför, och styrs av Cardan armen (2) mot scenen (3). Inspelningssteget och manipulatoranordningen är placerad i en sandlåda (4) vilar på en marmorbord under installationen. All annan utrustning vilar på trä bänk som inte vidrör marmorbord. Rutan sand sitter på toppen av marmorbordet i ett hålskärs ut ur träbord, så att provet är helt vibrations isolerad från utrustningen på trä bordet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5:. Fjärils Prep (A) Fjärilen är insatt i röret och huvudet, vingar och antenner är immobiliserade med varmt vax. Den neutrala elektroden sätts in i mundelar (1) är en bit torrt vax som används för att hålla ned buken (2), och en våt vävnad placeras bakom provet. (B) Närbild av huvudet vaxad ner. Ögat som skall spelas in från (1) går fri från vax eller skräp, och referenselektroden (2) är införd i de mouthparts och varmt vax snabbt smälts över den för att hålla den på plats.(C) Ett hål skärs i ögat där den rosa-vita fotoreceptor cellskiktet kan ses. Svart pigment och gula hemolymfa är frånvarande. (D) Lateral bild av provet med en glas inspelning elektrod (1) placeras i ögat, och den indifferenta elektroden (2) fäst på huvudet scenen, som ska fylla en krets som kan ses på oscilloskopet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6:. Raw Svar från Sample Recordings Varje svar motsvarar en enda ljusblixt av 50 ms längd (svarta staplar). (A) Ett exempel på den stora negativa spänningsändringen som bör ses barainnan en cell. (B) En ren inspelning bör ha liten bakgrundsbrus och en stor depolariserande respons, typiskt av åtminstone 40 mV. (C) Ett exempel på en dålig inspelning på grund av den negativa potentialen förändring efter huvudtoppen (pilhuvuden). (D) Ett annat exempel på en dålig inspelning. Den vilopotential genomgår stora variationer (röd stapel) och den stora mängden bakgrundsbrus kan skymma amplitud svar (pilspets).
Figur 7:. Response-Intensity Log-linjär funktion Fyllda cirklar visar de uppmätta svaren från en cell 3,5-0 OD för denna experimentuppställning. Ljusintensiteten är på en logaritmisk skala. Vid mycket höga intensiteter svaret är mättad, och vid mycket låga intensiteter en liten svar kvarstår i stället för att släppa till noll längs linjen. Than Naka-Rushton ekvation 33 är monterad på denna icke-linjär form (prickad linje).
Figur 8:. Spektrala känslighet Exempel (A) En enda representativ cell svar registrerades och relativ spektral känslighet beräknades. Toppen av denna cell är på 440 nm, vilket betyder att den svarar bäst för blått ljus. Enstaka celldata kan se bullriga (topp vid 380 nm). (B) Celler med samma relativa topp och form är i genomsnitt ihop och stänger standard fel sätts. Här har sju blå celler från sju personer i genomsnitt ger starka belägg för att en celltyp finns i denna art maximalt känsliga för ljus vid 440 nm. (C) Denna process kan upprepas för alla celltyper som finns, och plottades tillsammans. Insect ögon varierar kraftigt i deras spektrala känslighet men en typisk insect kan ha toppar som visas här, vid 370 nm, 440 nm och 510 nm. Observera dessa spektrala känslighet är alla beräknas med hjälp av verkliga data, men topparna har flyttats eftersom uppgifterna ännu inte publicerats för denna art.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Intracellulära inspelning kan vara en svår teknik att bemästra på grund av de många tekniska stegen. För framgångsrika experiment flera viktiga punkter måste beaktas. Det första är det viktigt att ha en korrekt vibrationsmässigt isolerad bord på vilket experimentet utförs. Många forskare använder luft tabeller som helt separata bordsskivan från basen, vilket ger överlägsen vibrationsisolering. Vår inställning innebär en tjock marmorbord med en sandlåda på toppen, i vilken är placerad mikromanipulator / elektrodhållare / provstadiet apparat. Detta är en effektiv och mer prisvärt alternativ till ett luftbord, särskilt om tillgång till interna gas eller tryckluft är en begränsning. Ytterligare vibrationsdämpande åtgärder kan vidtas, såsom passiv luftfjädring, eller tillsats av dämpande element bordsbenen (t.ex. öppnade tennisbollar, cykelslangar, tjock gel pads). Vidare är det väsentligt att den experimentuppställning vara inne i enFaradays bur med allt ordentligt jordad. Faradays bur bör ha ett metallnät skärm på framsidan som kan tas bort när man arbetar inne i buren och ersätts lätt vid inspelning. Även en liten mängd av omgivande elektriskt brus (i synnerhet 50 Hz buller från huvudväxelströmsförsörjning) kan göra en annars bra inspelning oanvändbar.
Vid framställning av provet, hemolymph och pigmentskikt som omger ommatidia kan förhindra framgångsrika inspelningar. Om hålet i hornhinnan skärs alltför stor, normal pumpning av hemolymph i kroppen orsakar vätskeytan för att flytta upp och ner på den skurna plats, vilket resulterar i en instabil inspelning. När hålet skärs, kommer hemolymph och yta pigmentskikten koagulera snabbt till en ogenomtränglig skorv även när förseglas med petroleumgelé, så det är viktigt att få elektroden in i ögat så snart som möjligt. Ringers lösning, kan också användas i stället för vaselin. Jordelektroden kan införas i denmouthparts eller i stubben av ett snitt antenn.
Dessutom är det ofta till hjälp för att hålla djuret så mörka anpassade som möjligt. För denna metod innefattar stegen att hålla inspelningsrummet mycket mörk, blockera ströljus från xenonlampan kommer in i Faradays bur, kortvariga stimulans blinkar (30-50 ms), och en tillräckligt låg frekvens mellan blinkar (0,5 eller högre). När en visuell pigment absorberar en foton, kromoforen i rhodopsin växlar från 11-cis-3-hydroxyretinal för alla - trans -retinal, inducerar konformationsförändring av opsin proteinet och aktivera hela komplexet som metarhodopsin, som initierar G-protein kaskad. Foto-blekning inträffar när högintensivt ljus orsakar kromoforen att fysiskt skilja från opsin proteinet. Tid är en begränsande faktor i detta experiment eftersom elektroden kommer endast stabilt spela in svar från inuti cellen under en viss tid innan det faller uteller membranet är skadat. Av denna anledning har vi inte bryta att tillåta cellen att återhämta sig, men vi använder en flash varaktighet och frekvens som vi har funnit inte försämra cellens svar över tiden. Det är viktigt att minska både frekvensen och intensiteten av ljus om fotoblekning sker.
Under inspelning, kan ett stort elektrodspets eller stor rörelse av elektroden skada cellen när penetrerar membranet. Bara fina tips (åtminstone ~ 100 Mohm) och små rörelser ska användas när man närmar sig en cell för inspelning. Om intracellulära inspelningen appliceras på andra applikationer, såsom hjärn inspelningar, kan extremt fina, robusta elektroder dras med hjälp av kvartsglas, men en specialiserad avdragare måste användas för dessa elektroder. När först göra en elektrod drar program, vi kontrollerat spets motstånd genom återfyllning elektroden, säkra den till elektrodhållaren i en falsk inställning och placera spetsen och jordelektroden i saltlösning. Next vi tillämpat en ström för att mäta förändringar i spänning på oscilloskopet. Att flytta elektrodspetsen vi använder en manuell mikromanipulator som rör sig längs två axlar. Andra manipulatorer existerar inklusive digitala ettor som tillåter rörelse längs alla tre axlarna och dessa kan användas för detta eller mer komplexa applikationer. Det finns många sätt att bygga en scen för inspelning, och det finns många olika typer av hårdvara och mjukvara som används vid inspelning och analysera observerade data. Vår inställning representerar en enkel, lätt och prisvärd installation av inspelnings riggen.
Vid konstruktionen av VlogI kurva, funktioner som utvecklats av Naka och Rushton 33 och andra 34,35 står för icke-linjära delar av plottade svar. Olika metoder används för att passa denna kurva till data, och vi plottade resultaten av en sådan metod som inte kräver kurvanpassningsprogram, även om andra metoder är också lämpliga 36,37 (
En begränsning med denna metod är att om studien organismen uttrycker mer än en genetiskt likartad opsin i ögat, kan det vara svårt att identifiera vilka opsin mRNA motsvarar sannolikt att vilken spektral klass av fotoreceptorcellen. För att lösa detta problem, har denna metod kombinerats med dye-injektioner och in situ hybridisering eller immunohistokemi att framgångsrikt identifiera opsins uttryckt i inspelade celler 10.
Vår metod är enkel och tillgänglig för forskare är obekanta med visuell elektrofysiologi. Denna teknik är vanligt i neuroscience, men specifika och tydliga metoder är frånvarande i litteraturen, vilket gör denna metod svår att reproducera. Även om många varianter av denna teknik finns, erbjuder vi ett enkelt sätt att mäta spektral känslighet i föreningen ögat. Den fysiologiska data är en viktig del av bevis i berättelser om visuell ekologi och evolution 41. Opsin sekvensvariation är kopplad tätt med känsligheten hos en fotoreceptor cell, vilket gör denna metod idealisk för studier som undersökt den genetiska grunden för fenotypisk förändring. Mätning av fotoreceptor cell känsligheter kan också kopplas ihop med beteendemässiga analyser färg diskriminering, visar den fysiologiska grunden för trösklar viktiga diskriminering i färgseende 42-46. I genetiska eller terapeutiska manipulationer i Drosophila exempelvis denna technique kan vara ett bra sätt att mäta korrekt fysiologisk funktion hos ögat eller hjärnan samt 47,48. Även vår är inte den första eller den mest komplicerade metoden av intracellulära inspelning i ögat, är vår förhoppning att vi kan göra den här metoden mer lättillgänglig för reproduktion och integration i forskningsprogram utanför formella neurovetenskap.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi tackar sena Rudy Limburg för att tillverka kraftöverförings arm omkrets, Kimberly Jamison, Matthew McHenry och Raju Metherate för utlåning oss utrustning, och Almut Kelber och Kentaro Arikawa, för uppmuntran. Detta arbete stöddes av National Science Foundation (NSF) Graduate Research Fellowship till KJM och NSF bidrag IOS-1.257.627 till ADB
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Butterfly pupae | Several local species available, need USDA permits for shipping. Carolina Bio Supply has several insect species that may be ordered within the U.S. without the need for additional permits | ||
| Large plastic cylinder | Any chamber that remains humidified will work | ||
| Insect pins, size 2 | BioQuip | 1208B2 | |
| 100% Desert Mesquite Honey | Trader Joe's | Any honey or sucrose solution will work | |
| Xenon Arc Lamp | Oriel Instruments | 66003 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Universal Power Supply | Oriel Instruments | 68805 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Optical Track | Oriel Instruments | 11190 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Rail Carrier, Large (2x) | Oriel Instruments | 11641 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Rail Carrier, Small (4x) | Oriel Instruments | 11647 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Thread Adaptor, 8-32 Male to 1/4-20 Male, pack of 10 | Newport Corporation | TA-8Q20-10 | |
| Optical Mounting Post, 1.0 in., 0.5 in. Dia. Stainless, 8-32 & 1/4-20 (5x) | Newport Corporation | SP-1 | |
| No Slip Optical Post Holder, 2 in., 0.5 in. Diameter Posts, 1/4-20 (5x) | Newport Corporation | VPH-2 | |
| Fixed lens mount, 50.8 mm | Newport Corporation | LH-2 | |
| Fixed lens mount, 25.4 mm | Newport Corporation | LH-1 | |
| Condenser lens assembly | Newport Corporation | 60006 | |
| Convex silica lens, 50.8 mm | Newport Corporation | SPX055 | |
| Six Position Filter Wheel, x2 | Newport Corporation | FW1X6 | |
| Filter Wheel Mount Hub | Newport Corporation | FWM | |
| Concave silica lens, 25.4 mm | Newport Corporation | SPC034 | |
| Collimator holder | Newport Corporation | 77612 | |
| Collimating beam probe | Newport Corporation | 77644 | |
| Ferrule Converter, SMA Termination to 11 mm Standard Ferrule | Newport Corporation | 77670 | This adapter allows the fiber optic to fit into the collimator holder |
| 600 μm diameter UV-vis fiber obtic cable | Oriel Instruments | 78367 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Shutter with drive unit | Uniblitz | 100-2B | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.1 OD | Newport | FRQ-ND01 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.3 OD | Newport | FRQ-ND03 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.5 OD | Newport | FRQ-ND05 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 1.0 OD | Newport | FRQ-ND10 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 2.0 OD | Newport | FRQ-ND30 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 3.0 OD | Newport | FRQ-ND50 | |
| LS-1-Cal lamp | Ocean Optics | LS-1-Cal | |
| Spectrometer | Ocean Optics | USB-2000 | |
| SpectraSuite Software | Ocean Optics | ||
| Interference bandpass filter, 300 nm | Edmund Optics | 67749 | |
| Interference bandpass filter, 310 nm | Edmund Optics | 67752 | |
| Interference bandpass filter, 320 nm | Edmund Optics | 67754 | |
| Interference bandpass filter, 330 nm | Edmund Optics | 67756 | |
| Interference bandpass filter, 340 nm | Edmund Optics | 65614 | |
| Interference bandpass filter, 350 nm | Edmund Optics | 67757 | |
| Interference bandpass filter, 360 nm | Edmund Optics | 67760 | |
| Interference bandpass filter, 370 nm | Edmund Optics | 67761 | |
| Interference bandpass filter, 380 nm | Edmund Optics | 67762 | |
| Interference bandpass filter, 390 nm | Edmund Optics | 67763 | |
| Interference bandpass filter, 400 nm | Edmund Optics | 65732 | |
| Interference bandpass filter, 410 nm | Edmund Optics | 65619 | |
| Interference bandpass filter, 420 nm | Edmund Optics | 65621 | |
| Interference bandpass filter, 430 nm | Edmund Optics | 65622 | |
| Interference bandpass filter, 440 nm | Edmund Optics | 67764 | |
| Interference bandpass filter, 450 nm | Edmund Optics | 65625 | |
| Interference bandpass filter, 460 nm | Edmund Optics | 67765 | |
| Interference bandpass filter, 470 nm | Edmund Optics | 65629 | |
| Interference bandpass filter, 480 nm | Edmund Optics | 65630 | |
| Interference bandpass filter, 492 nm | Edmund Optics | 65633 | |
| Interference bandpass filter, 500 nm | Edmund Optics | 65634 | |
| Interference bandpass filter, 510 nm | Edmund Optics | 65637 | |
| Interference bandpass filter, 520 nm | Edmund Optics | 65639 | |
| Interference bandpass filter, 532 nm | Edmund Optics | 65640 | |
| Interference bandpass filter, 540 nm | Edmund Optics | 65642 | |
| Interference bandpass filter, 550 nm | Edmund Optics | 65644 | |
| Interference bandpass filter, 560 nm | Edmund Optics | 67766 | |
| Interference bandpass filter, 570 nm | Edmund Optics | 67767 | |
| Interference bandpass filter, 580 nm | Edmund Optics | 65646 | |
| Interference bandpass filter, 589 nm | Edmund Optics | 65647 | |
| Interference bandpass filter, 600 nm | Edmund Optics | 65648 | |
| Interference bandpass filter, 610 nm | Edmund Optics | 65649 | |
| Interference bandpass filter, 620 nm | Edmund Optics | 65650 | |
| Interference bandpass filter, 632 nm | Edmund Optics | 65651 | |
| Interference bandpass filter, 640 nm | Edmund Optics | 65653 | |
| Interference bandpass filter, 650 nm | Edmund Optics | 65655 | |
| Interference bandpass filter, 660 nm | Edmund Optics | 67769 | |
| Interference bandpass filter, 671 nm | Edmund Optics | 65657 | |
| Interference bandpass filter, 680 nm | Edmund Optics | 67770 | |
| Interference bandpass filter, 690 nm | Edmund Optics | 65659 | |
| Interference bandpass filter, 700 nm | Edmund Optics | 67771 | |
| Faraday cage | Any metal structure will work that can be grounded and that fits the experimental setup. | ||
| Stereomicroscope, 6X, 12X, 25X, 50X magnification | Wild Heerbrugg | Wild M5 | Any Stereomicroscope will do |
| Microscope stand with swinging arm and heavy base | McBain Instruments | Any heavy base with arm will do | |
| Cardan arm | Custom built, See Figure 4 | ||
| Fiber-lite high intensity illuminator | Dolan-Jenner | MI-150 | For lighting specimen |
| Fiber-lite goose-neck light guide | Dolan-Jenner | EEG 2823 | Any goose-neck light guide will do |
| Marble table | |||
| Raised wooden table | Hole should be cut through this table so that the sandbox can rest on the marble table underneath | ||
| Wooden box filled with sand | custom built, any box with sand | ||
| Manipulator | Carl Zeiss - Jena | ||
| Electrode holder | |||
| Specimen stage | |||
| Alligator clip wires for grounding | |||
| Insulated copper wire | |||
| Silver wire, 0.125 mm diameter | World Precision Instruments | AGW0510 | |
| BNC cables | |||
| Preamplifier with headstage | Dagan Corporation | IX2-700 | |
| Humbug Noise reducer | Quest Scientific | Humbug | |
| Oscilloscope, 30 MHz, 2 CH, Dual Trace, Alt-triggering, without probe | EZ Digital | os-5030 | |
| BNC T-adapter | |||
| Powerlab hardware 2/20 | ADI instruments | ML820 | |
| Labchart software | ADI instruments | Chart 5 | |
| 10 MHz Pulse Generator | BK Precision | 4030 | |
| Glass pipette puller | Sutter Instruments | P-87 | |
| Borosillicate glass capillaries with filament | World Precision Instruments | 1B120F-4 | |
| Potassium chloride, 3 M | |||
| Slotted plastic tube | |||
| Low melting temperature wax | |||
| Soldering Iron | Weller | ||
| Platform with ball-and-socket magnetic base | Hama photo and video | ||
| Double edge carbon steel, breakable razor blade | Electron Microscopy Sciences | 72004 | |
| Vaseline | |||
| Microsoft Excel | Microsoft |
References
- Beckmann, H., et al. Spectral sensitivity in Onychophora (velvet worms) revealed by electroretinograms, phototactic behaviour and opsin gene expression. J. Exp. Biol. 218, 915-922 (2015).
- Leboulle, G., et al. Characterisation of the RNA interference response against the long-wavelength receptor of the honeybee. Insect Biochem. Mol. Biol. 43, 959-969 (2013).
- Martinez-Harms, J., et al. Evidence of red sensitive photoreceptors in Pygopleurus israelitus Coleoptera) and its implications for beetle pollination in the southeast Mediterranean. J. Comp. Physiol. A. 198, 451-463 (2012).
- Knox, B. E., et al.
- Salcedo, E., Zheng, L., Phistry, M., Bagg, E. E., Britt, S. G. Molecular basis for ultraviolet vision in invertebrates. J. Neurosci. 23, 10873-10878 (2003).
- Salcedo, E., et al. Blue- and green-absorbing visual pigments of Drosophila: ectopic expression and physiological characterization of the R8 photoreceptor cell-specific Rh5 and Rh6 rhodopsins. J. Neurosci. 19, 10716-10726 (1999).
- Vilinsky, I., Johnson, K. G. Electroretinograms in Drosophila: robust and genetically accessible electrophysiological system for the undergraduate laboratory. J. Undergrad. Neurosci. Educ. 11, 149-157 (2012).
- Hu, X., Leming, M. T., Whaley, M. A., O'Tousa, J. E. Rhodopsin coexpression in UV photoreceptors of Aedes aegypti Anopheles gambiae mosquitoes. J. Exp. Biol. 217, 1003-1008 (2014).
- Telles, F. J., et al. Out of the blue: the spectral sensitivity of hummingbird hawkmoths. J. Comp. Physiol. A. 200, 537-546 (2014).
- Arikawa, K., Mizuno, S., Kinoshita, M., Stavenga, D. G. Coexpression of two visual pigments in a photoreceptor causes an abnormally broad spectral sensitivity in the eye of the butterfly Papilio xuthus. J. Neurosci. 23, 4527-4532 (2003).
- Arikawa, K., et al. An ultraviolet absorbing pigment causes a narrow-band violet receptor and a single-peaked green receptor in the eye of the butterfly Papilio. Vision Res. 39, 1-8 (1999).
- Cronin, T. W., Jarvilehto, M., Weckstrom, M., Lall, A. B. Tuning of photoreceptor spectral sensitivity in fireflies (Coleoptera: Lampyridae). J. Comp. Physiol. A. 186, 1-12 (2000).
- Skorupski, P., Doring, T. F., Chittka, L. Photoreceptor spectral sensitivity in island and mainland populations of the bumblebee, Bombus terrestris. J. Comp. Physiol. A. 193, 485-494 (2007).
- Stalleicken, J., Labhart, T., Mouritsen, H. Physiological characterization of the compound eye in monarch butterflies with focus on the dorsal rim area. J. Comp. Physiol. A. 192, 321-331 (2006).
- Skorupski, P., Chittka, L. Photoreceptor processing speed and input resistance changes during light adaptation correlate with spectral class in the bumblebee, Bombus impatiens. PLoS One. 6, 25989 (2011).
- Yang, E. -C., Osorio, D. Spectral sensitivities of photoreceptors and lamina monopolar cells in the dragonfly, Hemicordulia tau. J. Comp. Physiol. A. 169, (1991).
- Yang, E. C., Lin, H. C., Hung, Y. S. Patterns of chromatic information processing in the lobula of the honeybee, Apis mellifera L. J. Insect Physiol. 50, 913-925 (2004).
- Rosner, R., Homberg, U. Widespread sensitivity to looming stimuli and small moving objects in the central complex of an insect brain. J. Neurosci. 33, 8122-8133 (2013).
- Trager, U., Homberg, U. Polarization-sensitive descending neurons in the locust: connecting the brain to thoracic ganglia. J. Neurosci. 31, 2238-2247 (2011).
- Heinze, S., Reppert, S. M. Sun compass integration of skylight cues in migratory monarch butterflies. Neuron. 69, 345-358 (2011).
- Greiner, B., Cronin, T. W., Ribi, W. A., Wcislo, W. T., Warrant, E. J. Anatomical and physiological evidence for polarisation vision in the nocturnal bee Megalopta genalis. J. Comp. Physiol. A. 193, 591-600 (2007).
- Stowasser, A., Buschbeck, E. K. Electrophysiological evidence for polarization sensitivity in the camera-type eyes of the aquatic predacious insect larva Thermonectus marmoratus. J. Exp. Biol. 215, 3577-3586 (2012).
- Osorio, D. Directionally selective cells in the locust medulla. J. Comp. Physiol. A. 159, 841-847 (1986).
- Nordström, K., Barnett, P. D., Moyer de Miguel, I. M., Brinkworth, R. S., O'Carroll, D. C. Sexual dimorphism in the hoverfly motion vision pathway. Curr. Biol. 18, 661-667 (2008).
- Plachetzki, D. C., Fong, C. R., Oakley, T. H. The evolution of phototransduction from an ancestral cyclic nucleotide gated pathway. Proc. Biol. Sci. 277, 1963-1969 (2010).
- Feuda, R., Hamilton, S. C., McInerney, J. O., Pisani, D. Metazoan opsin evolution reveals a simple route to animal vision. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 18868-18872 (2012).
- Palczewski, K., et al. Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled receptor. Science. 289, 739-745 (2000).
- Hardie, R. C., Raghu, P.
- Katti, C., et al. Opsin co-expression in Limulus differential regulation by light and a circadian clock. J. Exp. Biol. 213, 2589-2601 (2010).
- Smith, W. C., Price, D. A., Greenberg, R. M., Battelle, B. A. Opsins from the lateral eyes and ocelli of the horseshoe crab, Limulus polyphemus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6150-6154 (1993).
- Sison-Mangus, M. P., Bernard, G. D., Lampel, J., Briscoe, A. D. Beauty in the eye of the beholder: the two blue opsins of lycaenid butterflies and the opsin gene-driven evolution of sexually dimorphic eyes. J. Exp. Biol. 209, 3079-3090 (2006).
- Rushton, W. Review Lecture. Pigments and signals in colour vision. J. Physiol. 220, 1-31 (1972).
- Naka, K. I., Rushton, W. A. S-potentials from luminosity units in the retina of fish (Cyprinidae). J. Physiol. 185, 587-599 (1966).
- Lipetz, L. E. Handbook of Sensory Physiology. Vol. 1. Principles of Receptor Physiology. Loewenstein, W. R. 1, Springer. Berlin Heidelberg. Ch. 6 191-225 (1971).
- Matić, T., Laughlin, S. B. Changes in the intensity-response function of an insect's photoreceptors due to light adaptation. J. Comp. Physiol. A. 145, 169-177 (1981).
- Evans, L. S., Peachey, N. S., Marchese, A. L. Comparison of three methods of estimating the parameters of the Naka-Rushton equation. Documenta Ophthalmologica. 84, 19-30 (1993).
- Aylward, G. W. A simple method of fitting the Naka-Rushton equation. Clinical Vision Sciences. 4, 275-277 (1989).
- Stavenga, D. G., Smits, R. P., Hoenders, B. J. Simple exponential functions describing the absorbance bands of visual pigment spectra. Vision Res. 33, 1011-1017 (1993).
- Bernard, G. D.
- Ogawa, Y., et al. Coexpression of three middle wavelength-absorbing visual pigments in sexually dimorphic photoreceptors of the butterfly Colias erate. J. Comp. Physiol. A. 198, 857-867 (2012).
- Briscoe, A. D., Chittka, L. The evolution of color vision in insects. Annu. Rev. Entomol. 46, 471-510 (2001).
- Kelber, A., Thunell, C., Arikawa, K. Polarisation-dependent colour vision in Papilio butterflies. J. Exp. Biol. 204, 2469-2480 (2001).
- Kelber, A., Balkenius, A., Warrant, E. J. Scotopic colour vision in nocturnal hawkmoths. Nature. 419, 922-925 (2002).
- Koshitaka, H., Kinoshita, M., Vorobyev, M., Arikawa, K. Tetrachromacy in a butterfly that has eight varieties of spectral receptors. Proc. Biol. Sci. 275, 947-954 (2008).
- Blackiston, D., Briscoe, A. D., Weiss, M. R. Color vision and learning in the monarch butterfly, Danaus plexippus (Nymphalidae). J. Exp. Biol. 214, 509-520 (2011).
- Sison-Mangus, M. P., Briscoe, A. D., Zaccardi, G., Knuttel, H., Kelber, A. The lycaenid butterfly Polyommatus icarus uses a duplicated blue opsin to see green. J. Exp. Biol. 211, 361-369 (2008).
- Schneuwly, S., et al. Drosophilia ninaA gene encodes an eye-specific cyclophilin (cyclosporine A binding protein). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (1989).
- Luan, Z., Reddig, K., Li, H. S. Loss of Na(+)/K(+)-ATPase in Drosophila leads to blindness and age-dependent neurodegeneration. Exp. Neurol. 261, 791-801 (2014).
