Artigo de método

Multi-alvo Chromogenic Whole-mount

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DOI:

10.3791/53830

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31 de janeiro de 2016

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Biosciences, The Wenner-Gren Institute (MBW), Stockholm University

Neste artigo

Resumo

Nós descrevemos um monte de todo o processo de hibridação in situ multi-alvo cromogénico (MC-DESEJO) em embriões de Drosophila intactas permitindo a detecção simultânea e específica de três padrões de distribuição mRNA diferentes, contrastando precipitados de cor.

Resumo

Para analisar as redes activas reguladoras de genes durante o desenvolvimento embrionário e organogénese é essencial para definir com precisão a forma como os diferentes genes são expressos em relação espacial um para o outro in situ. Multi-alvo cromog�ico todo-mount hibridização in situ (MC-DESEJO) facilita muito a comparação instantânea de padrões de expressão gênica, uma vez que permite a visualização distintivo da espécie de ARNm diferentes em cores contrastantes no mesmo espécime de amostra. Isso proporciona a possibilidade de se relacionar domínios de expressão gênica topograficamente uns aos outros com alta precisão e definir locais de expressão únicos e sobrepostos. No protocolo apresentado, descrevemos um procedimento MC-Wish para comparar os padrões de expressão de mRNA de diferentes genes em embriões de Drosophila. Até três sondas de ARN, cada um específico para um outro gene e marcado por um hapteno diferente, são simultaneamente hibridados com as amostras de embriões e subsequentemente detectado por alcaliNE fosfatase baseada em imuno-histoquímica colorimétrico. O procedimento descrito é detalhado aqui para Drosophila, mas funciona igualmente bem com embriões de peixe-zebra.

Introdução

A hibridação in situ (ISH) é o método padrão para a detecção e localização de transcritos de ARN em um contexto morfológica, dentro das células, tecidos e organismos 1. Os sinais produzidos pelo procedimento ISH são normalmente visualizados por sistemas de detecção radioactivos, fluorescentes e cromogénicos. Nos últimos anos os avanços tecnológicos significativos na ISH fluorescente (FISH) 2 conduziu a uma melhoria dramática sensibilidade e resolução, permitindo a detecção e quantificação da expressão de RNA em células individuais e níveis sub-celulares e visualização ARN até moléculas individuais 3,4 .Enquanto métodos sofisticados FISH de molécula única são utilizadas para aplicações mais especializadas, ISH cromogénico é difundido como um ARN de rotina no método de detecção in situ em pesquisa e diagnóstico clínico. Para a detecção cromogénica reacções de precipitação enzima são utilizados, o que gera produtos visíveis em cores contrastantes nos locais5 de hibridação. Isto tem a vantagem de que a visualização de ARN pode ser combinado com manchas histológico de rotina e contexto morfológica é imediatamente evidente por microscopia de campo claro padrão. Além disso, numerosos dos substratos de cor aplicadas produzir precipitados, que são estáveis ​​em meios de montagem orgânicos e / ou aquosos, de modo que as preparações de amostra permanentes podem ser obtidos 5.

Em Drosophila, os protocolos ISH iniciais aplicadas sondas marcadas com radioisótopos para a detecção de transcrição em material seccionado 6. Embora seja difícil de reconstituir a partir de secções de tecido padrões de transcrição completa de embriões inteiros ou sistemas de órgãos, a aplicação de procedimentos ISH cromogénicos com sondas marcadas não-radioactivamente torna possível detectar globalmente distribuições de ARN em montagens inteiras-7. Embora existam muitas variações de ISH cromogénico, em todo típico de montagem de hibridização in situ (desejo) protocolos hybsondas marcadas com hapteno ridized são detectados por anticorpos anti-hapteno conjugado com uma enzima repórter transcritos de ARNm e são visualizados por um cromogénio precipitante.

A paleta de cores diferentes de precipitados produzidos pela repórter enzimas de fosfatase alcalina (AP), a peroxidase de rábano (POD), e beta-galactosidase (GAL) permite a detecção de alvos múltiplos distintiva em uma e a mesma amostra de 8-14. No entanto, a actividade enzimática POD dura apenas durante um período de tempo limitado e a reacção colorimétrica GAL é um pouco menos sensíveis, de modo que sem amplificação adicional (tiramida) de sinal 15 a detecção de transcritos menos abundantes pode ser um desafio com estas enzimas. Em contraste, a atividade de resistência da AP permite o volume de negócios substrato de longa duração e alta relação sinal-ruído. Portanto, a detecção sequencial utilizando enzima repórter da AP com substratos de cores diferentes tem sido bem sucedida na eficaz edetecção distintivo de até três transcritos diferentes em embriões únicos 10-12,16.

Para este multi-alvo DESEJOS cromogénico (MC-Wish) método (Figura 1) 14, sondas de ARN anti-sentido marcadas são geradas por transcrição in vitro e marcados com uma das etiquetas de hapteno-disponíveis. Os embriões são formaldeído e permeabilizadas por fixo metanol e o tratamento com proteinase K de digestão. A hibridação de embriões é realizado simultaneamente com até três sondas de ARN marcadas de forma diferente anti-sentido específicos para cada um gene diferente. Após a remoção da sonda não ligada por lavagens de rigor cada rótulo hapteno é visualizado em uma rodada separada de detecção. Um único ciclo de detecção é constituído por incubação de embriões com um anticorpo anti-hapteno acoplado a AP e visualização de ARN por aplicação de um AP-substrato que produz um precipitado de cor localizada estável. Após a detecção de anticorpos e de coloração, o conju aplicado anticorpo-APgate é removido por uma lavagem a baixas pH. Em experiências multicolor, cada ciclo de detecção utiliza um anticorpo dirigido contra um hapteno rótulo diferente e cada padrão de transcrição é visualizado por um substrato de cor diferente (Tabela 1). Os embriões são montadas em glicerol e fotografadas com um microscópio composto de alta resolução utilizando contraste de interferência diferencial (DIC) óptica.

Protocolo

1. A marcação de sondas de ARN por transcrição in vitro

  1. Montar reacção de transcrição in vitro num microtubo de 1,5 mL sob RNase condições: 10,5 ul tratada com DEPC H2O, 4,0 mL de 5x tampão de transcrição, 1,0 ul (1 ug) linearizado, ADN molde purificada tratada com DEPC H2O, 1,3 ul de mistura de NTP, 0,7 ul marcado com hapteno UTP, 0,5 ul de inibidor de RNA RiboLock, 2,0 ul de ARN-polimerase.
    Nota: O volume final da reacção é de 20 uL.
  2. Dependendo da sequência de promotor de T7 a utilização do modelo, T3 ou SP6 RNA polimerase para a transcrição in vitro (ver referência 17).
  3. Escolha digoxigenina-11-UTP, biotina-16-UTP, ou fluoresceína-12-UTP como etiqueta para a sonda de ARN. Para mais detalhes, veja a discussão do hapteno- rótulos e concentrações de sonda na discussão.
  4. Misture reação de transcrição e girar para baixo em breve.
  5. Vamos transcreverdurante 3 h a 37 ° C.
  6. Adicionar 1 ml de ARNase isenta de ADNase I à reacção de transcrição para a remoção de ADN molde, misturar bem e incubar durante 15 min a 37 ° C.
  7. Ajustar com tratada com DEPC H2O para o volume de amostra de 200 uL.
  8. Adiciona-se 100 ul (0,5 vol) de acetato de amónio 7,5 M e 600 ul (3 vol) de etanol para precipitar sonda de RNA etiquetada. Incubar durante 30 min à TA.
    1. Não use etanol gelado, pois isso pode levar à precipitação indesejada de nucleótidos não incorporados.
  9. Girar o ARN transcrito numa centrífuga de temperatura controlada a velocidade máxima (20.800 x g) durante 30 min a 20 ° C. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante.
  10. Lava-se a pelete resultante com etanol a 70% à TA e centrifugar a 20.800 xg durante 10 min a 20 ° C.
  11. Remover o sobrenadante e ter cuidado para não aspirar acidentalmente o sedimento solto. Vamos ar sedimento seco no microtubo com a tampa aberta por alguns minutos à temperatura ambiente.
  12. Disresolver o sedimento obtido em 100 ul de tratada com DEPC H2O
  13. Adicionar 300 ul de tampão de pré-hibridação (50% vol / vol de formamida desionizada, 5x SSC, 50 ug / ml de heparina de sódio de sal, 0,1% v / v de Tween-20, 5 mg / ml torula ARN) e armazenar a -20 ° C . As sondas podem ser armazenadas a longo prazo a -20 ° C.
    Nota: Para um primeiro teste do diluído sonda 3 ul sonda de RNA marcado com hapteno recentemente transcrito em tampão de hibridação ul 100 para obter a concentração final para o experimento DESEJO.

2. Processamento das Amostras Embrião Usando inserções

Nota: A utilização microtubos ou placas multi-bem para o processamento de embriões através das diferentes etapas de incubação assume o risco de perder quantidades significativas de embriões por aspiração-los acidentalmente durante a troca de soluções. Para evitar esta perda, pode ser útil utilizar cestos (tais como inserções NetWell) para o transporte de amostras através do procedimento do embrião. Estes são em poliestirenoserts com uma malha de poliéster na parte inferior (figura 2A), em que os embriões descansar durante o processamento.

  1. Para o processamento de embriões no procedimento desejar, montar as inserções em uma placa de 12 poços (Figura 2B) e adicionar 2 ml da solução apropriada a cada poço.
  2. Pipetar os embriões para as inserções usando uma ponta azul. Certifique-se que todos os embriões são imersos em líquido.
  3. Quando o tempo de incubação é superior a colocação das inserções contendo embriões noutro placa de 12 poços, a qual é preenchida com a solução para o passo seguinte.
    1. Use transportadoras e alças (Figura 2C) para transferir até 12 amostras de cada vez de uma solução para outra (Figura 2D).
      Nota: Para reduzir os volumes necessários, use 2,0 ml microtubos para as etapas de pré-hibridação / hibridação (veja o passo 4.1) e placas de 24 poços para as reacções de coloração (Passo 6.2). As reacções de hibridação e de coloração são realizadas em volumes de 1001; L e 400 ul, respectivamente.

3. Preparação de embriões para Hibridização

  1. Recolha, dechorionate, corrigir e devitellinize embriões utilizando procedimentos padrão 14,18. Os embriões são preparados rotineiramente armazenados em metanol a -20 ° C.
  2. Embriões de transferência a ser utilizado para a hibridação in situ para a TA e distribuir o meio das inserções de uma placa de 12 poços preenchidos com 2 ml de metanol por poço.
  3. Rehidratar embriões através de uma série decrescente de metanol à RT. Incubar embriões de cada vez durante 3 min em: (i) 75% de metanol em 1x PBS (ii) 50% de metanol em 1x PBS, 0,1% de Tween-20 (iii) 25% de metanol em 1x PBS, 0,1% de Tween-20 (iv ) 1x PBS, 0,1% de Tween-20 (v) 1x PBS, 0,1% de Tween-20.
  4. Pré-corrigir os embriões em 4% de paraformaldeído em PBS 1x durante 20 min à TA.
  5. Remover o fixador por 4 lavagens durante 3 min em PBS 1X, 0,1% de Tween-20 à TA. Enquanto isso descongelar e preparar proteinase K e soluções de glicina trabalhando.
  6. Embriões permeabilizar em proteinase K fresca (10 ug / ml a 50 ug / ml) em PBS 1X, 0,1% de Tween-20 durante 3 min à TA.
    Nota: O tratamento com proteinase K é equilibrado com a força de fixação do embrião. Por exemplo, se o passo de pré-fixação (3.4) é omitido, o tratamento mais suave proteinase K pode ser aplicada.
  7. Parar a reacção por duas lavagens de 1 min em 2 mg / ml de glicina em PBS 1X, 0,1% de Tween-20 à TA.
  8. Pós-corrigir os embriões em 4% de paraformaldeído em PBS 1x durante 20 min à TA.
  9. Subsequentemente, remover paraformaldeído fixador por lavagem quatro vezes durante 3 min em PBS 1X, 0,1% de Tween-20 à TA.
  10. Transferência de embriões pós-fixadas de pré-hibridação buffer. Armazenar embriões em tampão de pré-hibridação a 20 ° C ou directamente efectuar a hibridação de sondas.

4. A hibridação de sondas

  1. Transferência de embriões armazenados a -20 ° C em tampão de pré-hibridação para a TA. Distribuir embriões em tampão de pré-hibridação em 2,0 ml microtubes.
  2. Durante 30 min, no mínimo, amostras de pré-embrião hibridar a 65 ° C em tampão de pré-hibridação.
    Nota: Para pré-hibridação e hibridação passos banho de água é usado. Durante a pré-hibridação que haja tempo para se preparar a mistura de sonda através da combinação de até três sondas de ARN anti-sentido, cada um específico para um transcrito do gene diferentes e marcadas com um hapteno diferente.
  3. Para se obter a mistura de sonda, adicionar quantidades em conjunto apropriadas (usualmente entre 1 ul a 6 ul) de cada anti-sentido sonda de ARN desejado original é marcado com hapteno em tampão de hibridação de 100 uL (50% vol / vol de formamida desionizada, 5x SSC, 50 ug / ml sal de sódio de heparina, 0,1% v / v de Tween-20, 5 mg / ml de ARN torula, 5% p / v de sulfato de dextrano).
    Nota: A adição de sulfato de dextrano é opcional.
  4. Desnaturar a sonda de ARN anti-sentido mistura num bloco de calor a 80 ° C durante 5 min. Subsequentemente transferir a mistura de sonda desnaturada directamente a 65 ° C.
  5. Remover a maior parte da pré-hibridaçãotampão das amostras de embriões e adicione a mistura de sonda desnaturada.
  6. Deixe as amostras de embrião de hibridizar para sondar mistura O / N a 65 ° C.
    Nota: As temperaturas variam entre 55 ° C e 65 ° C são rotineiramente usadas para hibridação, pré e pós-hibridação passos. Hibridação a 65 ° C proporciona as condições mais severas e é recomendado no caso de problemas de fundo quando se utiliza temperaturas mais baixas. Se não há problemas de fundo, hibridação a 55 ° C é recomendável, o qual proporciona a vantagem da potência do sinal aumentada e melhorada a integridade do embrião.
  7. Na manhã seguinte, primeiro transferir as soluções de lavagem de severidade a 65 ° C, para assegurar que eles são aquecidos até à temperatura correcta no tempo.
  8. Transferência de mistura de sondas de hibridação a partir de embriões com os microtubos de 2,0 ml em inserções de uma placa de 12 poços contendo 2 ml de tampão de lavagem de hibridação pré-aquecida (50% de formamida em 2 x SSC, 0,1% de Tween-20). Colocar a placa de 12 poços contendo o inbryo amostras em um forno e incubar durante 20 min a 65 ° C.
  9. Embryo Transfer amostras a 2 ml de tampão de lavagem nova hibridação e incubar durante 20 min a 65 ° C. Repita este passo mais uma vez.
  10. Remover o excesso de sonda por lavagens de 20 min a 65 ° C, uma vez em 2 x SSC, 0,1% três vezes em 0,2 × SSC Tween-20 e 0,1% de Tween-20.
  11. Transferir as amostras de embrião de 1x PBS, 0,1% de Tween-20 à TA.
  12. Incubar os embriões em tampão de bloqueio (8% de soro de carneiro em PBS 1X, 0,1% de Tween-20) durante pelo menos 30 min à temperatura ambiente.

5. Detecção de Anticorpos As sondas de hapteno-rotulados

Nota: Em contraste com a hibridação simultânea de todas as três sondas marcadas de forma diferente, cada uma das sondas é detectada uma após a outra em rodadas separadas de incubação do anticorpo e de coloração. Portanto, em cada ciclo de detecção é apenas um anticorpo utilizado (tanto anti-digoxigenina-AP ou anti-fluoresceína-AP ou anti-biotina-AP).

  1. Escolha entre STEP5.1.1 a 5.1.3 e prosseguir com a preparação da diluição do anticorpo apropriado de acordo com o rótulo hapteno que está a ser detectado.
    Nota: Para a detecção sequencial das sondas marcadas de forma diferente, outro anti-hapteno-anticorpo é aplicada em cada ciclo de detecção.
    1. Para a detecção de uma sonda marcada com fluoresceína diluir anti-fluoresceína-AP conjuga 1: 4.000 em tampão de bloqueio.
    2. Para a detecção de uma sonda marcada com digoxigenina diluir anti-digoxigenina-AP conjuga 1: 4.000 em tampão de bloqueio.
    3. Para a detecção de uma sonda marcada com biotina preparar uma solução de conjugado de anti-biotina-AP a uma diluição de 1: 4.000 em tampão de bloqueio.
  2. Incubar em embriões a solução anti-hapteno-AP seleccionado durante 3 a 4 horas à temperatura ambiente. Alternativamente, incubar O / N a 4 ° C. Não aplique os três anticorpos simultaneamente.
  3. A fim de remover anticorpo não ligado lavar os embriões com 1x PBS, 0,1% de Tween-20 por 4 vezes 15 min à temperatura ambiente.
  4. Para alterar sistemas tampão erah duas vezes 15 min à temperatura ambiente em TNT (0,1 M Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 0,1 M, 0,1% de Tween-20).

6. fosfatase alcalina Chromogenic Coloração

  1. Posteriormente a detecção de anticorpos escolher entre PASSO 6.1.1 a 6.1.4 e prosseguir com um dos fosfatase alcalina reações de coloração cromogénicos para obter o sinal de cor desejada (ver Tabela 1). Para cada ronda de detecção de uma reacção de substrato cromogénico diferente é aplicada para realçar cada padrão de transcrição em outra cor.
    1. Fast Red Coloração
      1. Lavar os embriões duas vezes durante 15 min em TT8.2 (0,1 M de Tris-HCl pH 8,2, 0,1% de Tween-20).
      2. Enquanto lavava embriões, preparar a solução de coloração vermelho rápido do Fast Red TR / NAMP fosfatase alcalina Substrato Tablets Set.
      3. Dissolver um comprimido tampão a partir do comprimido definida em 1 ml de água destilada e misturar em vortex para obter 0,1 M Tris-HCl pH 8,2.
      4. Largar um Fast Red TR / NAMP tablet no preparado Tris tampão e dissolver em vortex para obter a solução de coloração vermelho rápido.
      5. Limpar solução de coloração vermelho rápido de partículas não-dissolvido através de um filtro de seringa de 0,2 um.
    2. A coloração azul rápido
      1. Lavar duas vezes embriões durante 15 min em tampão de coloração SB8.2 fresco (0,1 M de Tris-HCl pH 8,2, 0,1 M de NaCl, 0,05 M de MgCl2, 0,1% de Tween-20).
      2. Enquanto lavar os embriões, preparar a solução de coloração azul rápido de 50 mg / ml de Fast Blue BB (em DMF) e 50 mg / ml de fosfato de naftol (em DMSO) soluções de estoque.
      3. Recentemente preparar uma solução de azul rápido em BB 0,5 mg / ml em SB8.2.
      4. Recentemente preparar uma solução de fosfato de naftol separado a 0,5 mg / ml em SB8.2.
      5. Adicionar gota a gota, a solução preparada de fosfato de naftol na solução azul BB rápido sob agitação constante, com um vórtice. A concentração final resultante de trabalho é de 0,25 mg / ml para ambos os componentes do substrato.
        Nota: Diferentes azul rápido phosp / naftolcombinações de ódio resultar em diferentes tons de cor (ver Tabela 1).
    3. BCIP / NBT Coloração
      1. Lavar duas vezes embriões durante 15 min em tampão de coloração SB9.5 fresco (0,1 M de Tris-HCl pH 9,5, 0,1 M de NaCl, 0,05 M de MgCl2, 0,1% de Tween-20).
      2. Para um sinal cromogénico purpleblue, preparar a solução de coloração recém-BCIP / NBT por adição de 1 ul de levamisol, 3,5 uL e 4,5 uL BCIP NBT por ml de tampão de coloração SB9.5 e misturar bem.
    4. INT Coloração
      1. Lavar os embriões duas vezes durante 15 min em tampão de coloração SB9.5 fresco.
      2. Para um sinal cromogénico yellowbrown, preparar a solução de coloração recém-INT pela adição de 1 ul de levamisol, 5 ul Magenta-Phos e 5 INT ul por ml de tampão de coloração SB9.5 e misturar bem.
        Nota: Como alternativa, use 7,5 ul / ml BCIP / INT solução de coloração ready-to-use.
  2. Para as amostras de reacção de transferência de embriões coloraçãopara uma placa de 24 poços. Incubar em cada amostra de 400 ul da solução de coloração escolhidos no escuro.
  3. Monitorar ocasionalmente sinalizar desenvolvimento sob um microscópio estereoscópico. Parar a reacção de coloração, quando a intensidade do sinal desejado é obtido e antes do sinal de fundo significativo é observado.
  4. Para parar a reacção cromogénica, transferir embriões corados em inserções de uma placa de 12 poços contendo 2 ml por poço TNT. Lavar os embriões corados duas vezes em TNT.
  5. Lavar os embriões duas vezes durante 10 minutos em 1 x PBS, 0,1% de Tween-20 à TA para remover substrato residual.

7. Remoção de fosfatase alcalina / anticorpo Inactivação

  1. Remover o anticorpo e inactivar a fosfatase alcalina por incubação em 2 ml de solução de paragem de baixo pH (glicina 0,1 M-HCl a pH 2,2, 0,1% de Tween-20) durante 10 min à TA.
  2. Lavar durante 1 minuto com 2 ml de 1 x PBS, 0,1% de Tween-20 à TA.
  3. Lavar 3 vezes durante 3 minutos em 1 x PBS, 0,1% de Tween-20 à TA.

8. Segunda Rodada de Detecção

  1. Para detectar o padrão de distribuição de um segundo transcrito efectuar a detecção de sondas marcadas anticorpo-hapteno (PASSO 5.1 a 5.4), utilizando conjugados de anticorpo-AP dirigidas contra a segunda etiqueta hapteno.
  2. Realizar fosfatase alcalina cromogénico coloração (PASSO 6.1 a 6.5) que aplica uma combinação de substrato que produz uma cor contrastante com o utilizado na primeira fase de detecção (por cores disponíveis ver Tabela 1).
  3. Remover segundo conjugado anticorpo-AP como descrito no passo 7.1 a 7,3.

9. Terceira Rodada de Detecção

  1. A fim de detectar o padrão de distribuição de um terceiro transcrição, prosseguir com a detecção de sondas marcadas anticorpo-hapteno (PASSO 5.1 a 5.4), utilizando anticorpo-AP os conjugados específicos para o hapteno terceira etiqueta.
  2. Realizar fosfatase alcalina cromogénico coloração (PASSO 6.1 para 6.5) aplicação de uma combinação de substrato que não foi apdobraram nas rodadas anteriores de detecção. Escolha uma reacção cromogénica que produz uma cor precipitar fácil distinguir dos das duas rondas de detecção anteriores (para escolha de cor ver Tabela 1).

10. Montagem e imagem

  1. Transferir embriões corados adequadamente a 30% de glicerol em PBS e incubar até embriões são totalmente embebido na solução de glicerol. Eles são bem equilibrado quando eles vão para o fundo.
  2. Embriões de transferência a 70% de glicerol em H2O e deixar equilibrar à RT. Os embriões corados podem ser armazenados em glicerol a 70% a 4 ° C.
  3. Para a montagem, pipeta embriões em uma gota de glicerol 70% corado sobre um objecto corrediça e sem tocar nos separadores colados à corrediça (Figura 3). Aplique a lamela.
  4. Ver embriões montado sob um microscópio de dissecação. Mover a lâmina de cobertura aplicada, de modo que os embriões rodar para a orientação desejada.
  5. Observe corretamenteembriões orientados em alta resolução (20x, 40x objetivos) sob um microscópio composto com interferência diferencial Contrast óptica.
  6. Capturar imagens com uma câmera digital a cores e economizar no dispositivo de armazenamento digital.

Resultados

O protocolo descrito permite a visualização simultânea de vários padrões de transcritos em diferentes cores. MC-Wish proporciona a vantagem de comparar directamente os padrões de expressão de genes diferentes no mesmo embrião. Como exemplo, os padrões de expressão de spiracles vazias (EMS) 19, fushi Tarazu (FTZ) 20 e desleixado emparelhado 1 (slp1) 21 estão diretamente comparados em Drosophila melanogaster blastoderme embriões em estágio e visualizados em uma variedade de tons de cor (Figura 4) .

Diferentes combinações de substrato de AP estão disponíveis para obter um painel de cor contrastante precipitados (Tabela 1). O precipitado cor vermelha produzida por Fast Red e o precipitado roxo produzido por BCIP / NBT pode ser facilmente distinguidos e, portanto, são utilizados mais comumLY em experiências de duas cores (Figura 4A). No entanto, a mancha BCIP / NBT pode rapidamente se transformar em uma cor bastante escura, para que a cor vermelha rápido é disfarçado em caso de co-distribuição parcial das transcrições. Por conseguinte, a aplicação de Fast Blue pode ser vantajoso, que gera produtos verdes, azuis e violetas em combinação com NAMP, NAGP e NABP, respectivamente (Tabela 1). A combinação de azul rápido com NAMP dá uma cor azul clara que é facilmente perceptível a partir do produto Red rápido em domínios de expressão adjacentes ou sobrepostos como mostrado aqui para ems e locais de expressão slp1 visualizadas em vermelho e azul, respectivamente (Figura 4B). A combinação azul rápido NAGP proporciona um forte contraste semelhante ao rápido mancha vermelha, de modo que o domínio EMS verde é claramente distinto do local de expressão slp1 vermelho (Figura 4C). No entanto, se ems e locais de expressão é DE slp1gidos por azul rápido NABP e Fast Red, respectivamente, o violeta resultante e precipitados de cor vermelha são menos perceptíveis (Figura 4D). Como mencionado acima, Fast Red e azul rápido NAGP são fáceis de distinguir, como mostrado por slp1 e FTZ expressão em vermelho e verde, respectivamente (Figura 4D).

MagentaPhos em combinação com INT produz um precipitado amarelo, o qual é usado para revelar a expressão de segmentar FTZ (Figura 4C, E). O precipitado de cor amarela gera um bom contraste para os substratos de cor azul tal como exemplificado pela detecção de slp1 e FTZ com azul rápido NAMP e MAG / INT, respectivamente (Figura 4E). No entanto, o precipitado amarelo é menos fácil discernível a partir do produto vermelho rápido. O domínio expressão manchado amarelo do ems pode ser mal disti nguished da expressão rostral de slp1 mostrado em vermelho (Figura 4F). Portanto, a combinação dos substratos de cor tem de ser cuidadosamente escolhidos para cada experimento.

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Figura 1. Fluxograma do MC-Wish. Para visualização multicolorida de três padrões de transcrição exclusivos, escolher entre diferentes conjugados anticorpo-AP e combinações de substrato de cor em cada ciclo de detecção. Abreviaturas: AP, da fosfatase alcalina; BIO, biotina; DIG, digoxigenina; FLUO, fluoresceína. Para outras abreviaturas ver lendas a Figura 4 e Tabela 1. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2. Inserções como transportadores embrião. (A) insere montados na parte inferior com membranas de poliéster de 15 mm de diâmetro e 74 uM de tamanho de malha são utilizados como veículos de embriões de Drosophila. (B) As pastilhas são montadas em placas de 12 poços, os quais funcionam como reservatórios para os tabuleiros de várias soluções. (C) As transportadoras disponíveis e alças permitir o processamento de (D) 12 inserções / amostras de embriões simultaneamente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3. Montagem de embriões corados. Os embriões são montados em uma gota de glicerol 70% entre duas pilhas de lamelas, que funcionam como espaçadores. Movimento suave do appmentiu lamela grande ajuda para girar os embriões montados na orientação desejada para observação e fotografia. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4. Visualização Multicolor de transcritos de ARNm em embriões de Drosophila. Exemplos de experiências MC-Wish em embriões de Drosophila são mostrados a partir de vistas laterais. Os padrões de expressão de mRNA de spiracles vazias (EMS), fushi Tarazu (ZLC) e desleixado emparelhado 1 (slp1) são visualizados por diferentes combinações de substratos de cor AP, que são indicados em cada painel. Transcrições foram detectados por (A) FLUO ftz e ems DIG, ( B) slp1 FLUO, ems BIO, e DIG ftz, (C) ems BIO, slp1 FLUO, e DIG ftz, (D) BIO ftz, slp1 FLUO, e ems DIG, (E) slp1 FLUO, ems DIG, e ftz BIO, (F) BIO ftz, slp1 FLUO, e ems DIG sondas marcadas. As sondas marcadas com hapteno foram immunohistochemically detectado um após o outro nas ordens listados. Abreviaturas: FB azuis rápido; FR, Fast tablet Vermelho. Para outras abreviaturas ver lendas a Figura 1 e Tabela 1. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Combinação de substrato Adicionar 1 mL de tampão de AP Concentração [ig / ml] Tampão AP Cor Sensibilidade de sinal
BCIP NBT 3,5 l 4,5 l 175 337,5 SB9.5 roxo +++
MAG INT 5 ul de 5 ul 250 250 SB9.5 amarelo +
Solução estoque BCIP / INT 7,5 ul 250 250 SB9.5 amarelo +
Azul Rápido NAMP 5 ul de 5 ul 250 250 SB8.2 azul ++
Azul Rápido NABP 20 ul 10 ul 1000 500 SB8.2 violeta ++
Azul Rápido NAGP 10 ul 10 ul 500 500 TT8.2 verde +
Fast Red NAMP 1 comprimido 1000 400 TT8.2 vermelho ++

Tabela 1. combinações de substrato Abreviaturas: +++, forte;. ++, Médio; +, Fraco NBT, cloreto de 4-nitro-azul-tetrazólio; BCIP, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato; INT, 2- (4-iodofenil) -3- (4-nitrofenil) -5-fenil-tetrazólio; MAG, Magenta-Phos, 5-bromo-6-cloro-3-indolil-fosfato, NAMP, Naftol-AS-MX-fosfato; NABP, Naphthol-AS-BI-fosfato; NAGP, Naftol-AS-GR-fosfato; SB9.5, tampão de coloração, a pH 9,5; SB8.2, tampão de coloração, a pH 8,2; TT8.2, Tween-tampão Tris a pH 8,2.

Discussão

A hibridação in situ (ISH) marcados radioactivamente com sondas de ácidos nucleicos é frequentemente utilizado para detectar a localização do RNA em secções de tecido. O método ISH radioactivos, no entanto, é demorado, menos sensíveis, e não permite a apreciação dos padrões de distribuição transcrição completa em montagens inteiras. Em contraste, o método de MC-Wish aqui descrito permite a comparação directa dos vários domínios de expressão de gene em cores contrastantes dentro de embriões intactos. MC-Wish tem a vantagem de contexto histológico é imediatamente evidente e visualizadas por microscopia de campo claro simplesmente padrão. Isto proporciona a possibilidade de relacionar domínios de expressão de genes topograficamente uns aos outros com grande precisão e definir locais de expressão única e que se sobrepõem, de uma forma rápida e fiável. Por outro lado, a ISH multiplexado fluorescente (FISH) é mais poderoso no que diz respeito à sensibilidade e resolução e é, de preferência utilizado, se celular ou até mesmo re sub-celularé necessária uma solução de detecção de ARNm.

O largo espectro de transcritos que foi mapeado por MC-Wish sugere que virtualmente qualquer transcrição podem ser analisados ​​não só em embriões, mas também em tecidos larvais e adultas e em outras espécies de Drosophila. Na verdade, o procedimento descrito detalhados aqui para Drosophila, funciona da mesma forma eficiente com embriões de peixe-zebra 11,16,22. Além disso, o método de MC-desejarem podem ser adaptadas a uma ampla variedade de vertebrados e invertebrados e embriões espécime de tecido.

Hapteno- rótulos e concentrações de sonda

Nós usam rotineiramente fluoresceína, digoxigenina, biotina e como etiquetas hapteno de sondas de RNA. Além disso, as sondas marcadas com dinitrofenol pode ser aplicada, que foram introduzidas em experiências de peixe-zebra DESEJO 23-25. Sondas marcadas com fluoresceína exibir uma sensibilidade menor em comparação com os outros rótulos hapteno, de modo a que a fluoresceína é melhor usado fou detecção de transcritos abundantes. Cada sonda recentemente transcrito é testado pela primeira vez em um único experimento DESEJO, onde seu desempenho é avaliado, utilizando BCIP / NBT ou Fast Red como substrato. A concentração da sonda é considerado como ideal quando um sinal forte sem fundo de desenvolvimento é alcançado dentro de alguns minutos a horas.

Para certificar-se que os domínios de interesse de expressão foram detectados em toda a sua extensão pelo MC-Wish, é essencial para visualizar cada padrão de transcrição por experimentos DESEJO de rótulo único, usando a combinação de substrato mais sensível, BCIP / NBT. Isso garante que os domínios de expressão fracos não são negligenciados na experiência multi-alvo. Para compensar a menor sensibilidade das outras combinações de substrato é essencial utilizar duplicou (a) as concentrações triplicadas de sondas, em comparação com BCIP / NBT coloração convencional.

Baixa inativação pH

A etapa de inactivação de pH baixo pode levar adesintegração parcial dos híbridos sonda de ARNm ARN / sentido anti-sentido marcada com hapteno, resultando em reduzida a detecção do sinal na segunda e terceira rondas de coloração. Para minimizar a perda de sensibilidade, os passos de inactivação são tão curto quanto possível. Nós experimentado que um tempo de incubação de 10 min a pH baixo é suficiente para a eliminação da actividade do AP-. As lavagens rápidas subsequentes em grandes volumes de diluição rápida de assegurar não ligados conjugados anticorpo-AP e evitar a re-ligação às sondas haptenizada. Procedimentos alternativos incluem fixação paraformaldeído e inactivação pelo calor. No entanto, alguns dos precipitados de cor não são estáveis ​​ao calor e paraformaldeído fixação pode não ser suficiente para a inactivação completa de AP. Inactivação incompleta do primeiro aplicada conjugado anticorpo-AP pode levar a re-visualização do padrão de ARNm no seguimento da detecção levando rodada para sobreposição de falsos positivos na expressão com a segunda espécie de ARNm a ser detectado. Portanto, numa experiência de controlo the os embriões são divididos em duas fracções após inactivação do primeiro aplicada conjugado anticorpo-AP. O segundo conjugado anticorpo-AP é omitida a partir da fracção de controlo e não deve produzir um sinal na segunda reacção de cor. No entanto, se a segunda reacção de cor gera um padrão de distribuição de sinal correspondente para o primeiro, em seguida, o procedimento de inactivação não foi eficaz. Neste caso, o tempo de incubação em solução de paragem baixo pH deve ser prolongada para a experiência seguinte.

Pedidos de aplicação substrato AP

Uma vez que a sensibilidade diminui com cada ciclo subsequente de detecção, é aconselhável para detectar ARNm menos abundantes antes transcritos mais abundante. Além disso, as combinações de substrato Fast Blue Fast Red e são significativamente menos sensível do que o purpleblue BCIP / NBT mancha, de modo que os corantes são preferivelmente aplicados rápida na primeira fase de coloração para a detecção do transcrito expresso mais forte. Isto também hcomo a vantagem de que subsequente BCIP / NBT coloração pode ser monitorado e parado no tempo antes do sinal purpleblue fica muito escuro em relação aos corantes rápidos leves. Assim, em um experimento de duas cores padrão, primeiro o mRNA expressa mais forte é detectado pelo Fast Red e segundo o mais fraco por BCIP / NBT. Como uma alternativa para os corantes amarelos rápidos as combinações dos substratos INT podem ser aplicados, que, contudo, produzir precipitados que se tornam difundem depois de algum tempo. Portanto BCIP / INT é aplicado exclusivamente na última rodada coloração. Consequentemente, em um experimento de três cores muitas vezes usamos primeiro Fast Red, segundo BCIP / NBT (azul ou rápido) e uma terceira combinação substrato INT. Note-se que é aconselhável para fotografar embriões corados tão rapidamente quanto possível quando se aplica a INT.

Detecção fluorescente de corantes azo

Pode ser, por vezes, difícil de reconhecer padrões de expressão que se sobrepõem quando um precipitado cor mais escura é sombreamento um mais leve. Fou exemplo, um precipitado BCIP / NBT fortemente desenvolvido pode mascarar sinais de corante rápidos leves. Uma forma de contornar este problema é para capturar imagens imediatamente após cada mancha e remover o precipitado cor aplicada antes da próxima ronda de detecção. Neste caso, corante azo solúvel em álcool (Fast Red) e INT precipitados são removidos por lavagens de etanol após o primeiro e segundo ciclos de detecção, respectivamente, coloração e BCIP / NBT como é aplicado o último substrato AP-26. Outra possibilidade é a de tirar partido das propriedades fluorescentes dos corantes azo. Fast Red pode ser visualizada usando rodamina filtro 27 define, enquanto Fast Blue pode ser observada tanto com filtros vermelhos-28,29. Comparação ou sobreposição de imagens fluorescentes cromogénicos e pode revelar o local de co-distribution.Using esta abordagem, BCIP / NBT de desenvolvimento de sinal tem de ser parado no tempo, de modo que ela não se torne demasiado densa e extinguir o sinal de fluorescência do corante azo produto da reacção.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Agradecemos aos nossos colegas pelos plasmídeos de cDNA para geração de modelos. O trabalho dos autores é apoiado pela Fundação Sueca do Câncer (CAN 2010/553), pela Fundação Sueca para Cooperação Internacional em Pesquisa e Ensino Superior (IG2011-2042) e pela Fundação Knut e Alice Wallenberg (KAW2012.0058).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Água tratada com dietilpirocarbonato (DEPC) daThermo ScientificR0603
T7 RNA Polimerase EP0111da Thermo Scientific
 Thermo ScientificEP0101
SP6 Thermo ScientificEP0131
RiboLock Inibidor de RNase Thermo ScientificEO0381
DNase I, livre de RNase Thermo ScientificEN0521
NTP SetThermo ScientificR0481
Digoxigenina-11-UTPRoche11209256910
Fluoresceína-12-UTPRoche11427857910
Biotina-16-UTPRoche11388908910
Acetato de amônioApplichemA2936
Etanol, absoluto Merck100983
hidrogenofosfato dissódicoScharlauSO0339
Dihidrogenofosfato de sódioScharlauSO0331
Tween-20SigmaP1379
ParaformaldeídoSigmaP6148
MetanolSigma32213
Proteinase KThermo ScientificEO0491
GlycineSigmaG7126
Ácido clorídrico Merck100317
citrato trissódicoScharlauSO0200
formamida deionizadaApplichemA2156
RNA tipo VI de levedura torulaSigmaR6625
Sal de heparina sódicaApplichemA3004
Sal de sódio sulfato de dextranoSigmaD6001
Soro de ovelhaSigmaS2263
Sheep anti-biotina-AP Fab fragments Roche11426303001
Fragmentos de Fab de anti-digoxigenina-fosfatase alcalina (AP) de ovelha11093274910Roche
11426303001
Laboratóriode vetorMB-3100
Tris-(hidroximetil)-aminometanoScharlauTR04241000
Cloreto de magnésioScharlauMA0036
Cloreto de sódioScharlauSO0227
LevamisolSigmaL9756
N, N-DimetilformamidaSigmaD4551
DimetilsulfóxidoApplichemA3006
Conjunto de comprimidos vermelho rápidoSigmaF4648
Sal azul rápido SigmaF3378
Naftol-AS-MX-fosfatoSigmaN5000
Naftol-AS-GR-fosfatoSigmaN3625
Naftol-AS-BI-fosfatoSigmaN2250
Magenta-PhosBiosynthB7550
INTSigmaI8377
NBTApplichemA1243
BCIPApplichemA1117
Solução INT / BCIPRoche11681460001
Glicerol 86-88%ScharlauGL0023
Incubadora universalMemmertBE400
Banho-mariaMemmertWB14
Bloco de calorGrantQBT2
Insertos Netwell 15 mmCorning3477
Kit de suporte Netwell 15 mmCorning3520
Placa de cultura de células de 12 poçosCorning3513
Placa de 24 poçosSarstedt83.3922
Microtubo de 1,5 mlSarstedt72.690.001
Microtubo de 2,0 mlSarstedt72.691
Polimerase RNA T3 Polimerase RNA Fragmentos de Fab de anti-fluoresceína-AP de ovelha

Referências

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