Biologia de sistemas de regulação metabólica pelo receptor de estrogênio sinalização no cancro da mama

Resumo

A integração de dados de experimentos de sequenciamento de todo o genoma e experimentos metabolômicos é um desafio. Neste artigo, relatamos, pela primeira vez, a geração, análise e integração de dados de transcriptoma, cistrome e metaboloma de células de câncer de mama tratadas com estradiol.

Resumo

Com o advento das -ómicas se aproxima de nossa compreensão das doenças crônicas como câncer e síndrome metabólica melhorou. No entanto, a mineração eficaz da informação nas bases de dados de grande escala que são obtidas a partir de microarrays de expressão genética, experimentos de seqüenciamento profundas ou perfil metabólico é essencial para descobrir e, em seguida, efetivamente alvo os reguladores críticos de fenótipos celulares doentes. Receptor de estrogênio α (ERa) é um dos fatores mestre de transcrição que regulam os programas de genes que são importantes para estrogênio cancros da mama responsivos. A fim de compreender o papel de ERa sinalização no metabolismo do cancro da mama que utilizaram dados transcriptomic, cistromic e metabolômica de células MCF-7 tratadas com estradiol. Neste relatório nós descrevemos a geração de amostras para RNA-Seq, Chip-Seq e experiências metabolômica e análise computacional integrativa dos dados obtidos. Essa abordagem é útil em delinear nova toupeiramecanismos cular e circuitos gene regulador que são regulados por um fator de transcrição especial que impacta metabolismo das células normais ou doentes.

Introdução

Os estrogênios são importantes reguladores de muitos processos fisiológicos em ambos os sexos, incluindo tecidos reprodutivos, tecidos metabólicos, cérebro e ossos ^1. Em adição aos efeitos benéficos nestes tecidos, os estrogénios também conduzir cancros que surgem da mama e tecidos reprodutivos. Estrógenos trabalhar principalmente através ERs para induzir efeitos específicos do tipo de célula. sequenciamento profundo de transcritos regulados por ERa usando RNA-Seq e de todo o genoma DNA ERa análise de sítios de ligação usando o chip-Seq provou ser útil para entender como ERa trabalha em diferentes tecidos e tipos de câncer que surgem a partir deles. Nós e ....

Protocolo

1. Preparação de amostras de RNA-Seq

1. Cultura Celular e Tratamento
   1. Cultura das células MCF-7 em MEM melhorado (IMEM) mais meio de vermelho de fenol com calor a 10% de FBS inactivo, 1% de penicilina / estreptomicina a 37 ° C em humidificada com 5% de _CO2.
      Nota: A mesma linha de células e condições de cultura de células é utilizado ao longo do estudo.
   2. Semente de 100.000 células MCF7 por poço em placas de 6 poços. Tem triplicado para cada tratamento. No dia três, remover o meio e adicionar 2 ml de meio fresco com ou sem 10 ^-8 M E2 a cada poço. Incubar as placas durante 24 h em 37 ° C em humidificada com 5% de

Resultados

transcriptomics
Para analisar genes diferencialmente expressos por tratamento E2, optamos por realizar um experimento RNA-Seq. Para além de fornecer informação sobre os níveis de mRNA, os dados de RNA-Seq também pode ser utilizado para monitorizar alterações na (RNAs longos não-codificantes, microRNAs) RNA não codificante e eventos de splicing alternativo. Nós não fornecem informações sobre a análise de genes não-codificantes ou RNAs transcritos alternativamente, desde âmbito do n.......

Discussão

Neste trabalho, nós descrevemos geração e análise integrativa da RNA-Seq, Chip-Seq e os dados de metabolômica de células MCF-7 que são tratadas com E2. Desenvolvemos um conjunto de protocolos strategizing para utilizar os métodos mais eficientes e usuário soft wares amigáveis ​​que produzem descoberta biologicamente relevante. Para o nosso conhecimento, o nosso é o primeiro estudo para integrar -ómicas dados de três diferentes análises e identificadas novas vias metabólicas que ERa diretamente regulados em células de câ.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Mistura de Triglicerídeos	Sigma	17810-1AMP-S
Ácido oleico	Sigma	O1257-10MG	Ácido Oleico-Pó Solúvel em Água
Tecnologias de vida útil do reagente TRIzol		15596-026
Dynabeads Protein A	Life technologies	10006D
Dynabeads Protein G	Life technologies	10007D
QIAquick QIAGEN		28106	Isolamento de DNA da amostra de entrada
Kit de isolamento ZYMO ChIP-DNA	Zymo Research	D5205	ChIP DNA Limpo & Concentrador
Quant-iTª PicoGreen¨ Kit de Ensaio dsDNA	Invitrogen	P7589
Conjunto de DNase livre de RNase	QIAGEN	79254	Purificação de RNA
DEPC Água tratada	LIFE TECH	462224	Dnase/Rnase Modelo Livre
120 Sonic Dismembrator	Fisher Scientific	FB120110	Com sonda de 1/8
Gabinete de Som Fisher	Scientific Fisher Scientific	FB-432-A	Para redução de som
Eppendorf Tubos 5.0 ml	Eppendorf	0030 119.401	200 tubos (2 sacos de 100 unidades)
Mistura de Primer Aleatório	NEB	S1330S
DNTP MIX	NEB	N0447S
M-MuLV Transcriptase reversa	NEB	M0253S
FastStart SYBR Green Master	ROCHE	4673484001
Agarose	Fisher	BP160100	gel de agarose a 1,5%;
Kit de Ensaio Qubit RNA HS	Life technologies	Q32852	Quantificação de RNA (100 ensaios)
Sigma	F8775		de formaldeído
	Roche	4693116001	Cada comprimido é suficiente para 10 ml de tampão de lise
PhosSTOP PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets	Roche	4906845001	Cada comprimido é suficiente para um tampão de lise de 10 ml
Kits de Ensaio Qubit Life	technologies	Q32850	Para 100 ensaios
Contador de células automatizado	ORFLO	MXZ000
tubo Rotator	VWR	10136-084
Victor X5 Leitor de placas múltiplas	Microcentrífuga PerkinElmer	2030-0050
5417R	Eppendorf	22621807
Suporte Magnético	Diagenode	B04000001
Sistema de PCR rápido em tempo real	Ciência Aplicada

Kit de Purificação PCR de quantificação de DNA Comprimidos inibidores de protease 4351405