Usando uma estratégia de microarray de glicano impresso, um ensaio convencional de placa de 96 poços foi miniaturizado para análise da avidez e especificidade da hemaglutinina do vírus influenza A para receptores contendo ácido siálico.
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Artigo de método
A Miniaturized Glycan Microarray Ensaio para a Avaliação de avidez e especificidade do Hemaglutininas vírus da gripe A
Neste artigo
Resumo
Resumo
Vírus da Influenza A (IAV) hemaglutininas reconhecem ácidos siálicos na superfície celular como receptores funcionais para ganhar a entrada nas células. aves aquáticas selvagens são o reservatório natural para IAV, mas IAV pode cruzar a barreira das espécies para aves, suínos, cavalos e seres humanos. vírus aviários reconhecer ácido siálico ligado a um penúltimo galactose através de uma ligação α2-3 (receptores do tipo aviário), enquanto que os vírus humanos reconhecem preferencialmente ácido siálico com uma ligação α2-6 (receptores do tipo humano). Para monitorar se os vírus aviários estão a adaptar-se aos receptores do tipo humano, podem ser usados vários métodos. microarrays de glicano com diversas bibliotecas de sialosides sintéticos são cada vez mais utilizadas para avaliar a especificidade do receptor. No entanto, esta técnica não é usada para medir a avidez. Medição de avidez é tipicamente alcançada por avaliação da ligação de hemaglutinina ou de vírus diluído em série a glicanos adsorvidos ao polipropileno placas de 96 poços convencionais. Neste ensaio, os glicanos com α2-3 ou α2-6 ácidos siálicos são acoplados a biotina e adsorvido a placas de estreptavidina, ou são acoplados a poliacrilamida (PAA), que adsorver directamente para o plástico. Temos miniaturizado significativamente este ensaio, imprimindo directamente ligada sialosides-PAA e os seus homólogos não ligada-PAA em lâminas de vidro de micro-poços. Este set-up, com 48 matrizes em um único slide, permite ensaios simultâneos de 6 glicano proteínas de ligação em 8 diluições, interrogando 6 glicanos diferentes, incluindo dois controles não-sialilados. Isto é equivalente a 18x placas de 96 cavidades na placa de ensaio tradicionais. O formato de matriz de glicanos diminui o consumo de compostos e produtos biológicos e, portanto, aumenta muito a eficiência.
Introdução
aves aquáticas selvagens são o reservatório natural para IAV, mas IAV é capaz de atravessar a barreira das espécies para aves e mamíferos, incluindo os humanos. IAVS aviárias reconheçam α2-3 ácidos siálicos ligados (receptores do tipo aviário), enquanto que os vírus humanos se ligam α2-6 ácidos siálicos ligados (receptores do tipo humano). Para ser capaz de se replicar eficientemente e transmitir entre seres humanos uma IAV aviária necessita de se ligar a receptores do tipo 1 humano.
IAVS são divididas com base na serologia que caracteriza a sua antigenicidade de hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA) glicoproteínas do envelop....
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Protocolo
NOTA: Todos os passos são realizados à temperatura ambiente a menos que indicado de outra forma.
1. Disposição Construção
- Glicanos Preparação e configuração da placa
- Prepare um estoque de tampão impressão. Em primeiro lugar fazer 500 ml de uma solução de estoque de 150 mM de fosfato de sódio dibásico. Também fazem 50 ml de uma solução de estoque de 150 mM de solução de fosfato de sódio monobásico. Num balão, utilizando uma barra de agitação magnética e um medidor de pH, lentamente titule a solução de fosfato de sódio dibásico com a solução monobásico até um pH de 8,5 seja alcançado. Adicionar Tween-20 a 0,005%.
- Prepare as amostra....
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Resultados
Impressão, digitalização e análise de dados
Para garantir a impressão correta, é vital ter o alinhamento correto da grade manchado dentro da máscara de teflon, que delineia cada matriz no slide. Durante a impressão, devido à natureza do revestimento de Teflon, as manchas não podem ser vistos a olho nu nas lâminas MPX. Dá-se atenção, em seguida, para o aparecimento dos pré-manchas sobre as lâminas de poli-L-lisina revestidos. D.......
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Discussão
Avaliando especificidade de receptor IAV é um passo importante na análise do potencial pandemia de vírus aviários. reconhecimento de ácido siálico por o vírus está ligada a várias propriedades biológicas, tais como ligação e libertação a partir da célula. O conhecimento de que mutações de aminoácidos são necessários para vírus aviários para alcançar α2-6 vinculativo e cruzar a barreira das espécies permite preparação para uma pandemia. Vários ensaios são utilizados para determinar a especificidade do receptor; No entant.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado em parte pela facilidade Scripps Microarray Core, e um contrato a partir dos Centros de Controle de Doenças (JCP). RPdV é um beneficiário de uma doação Rubicon e VENI da Organização Holandesa para Pesquisa Científica (NWO). O Consórcio para Glycomics Funcionais (http://www.functionalglycomics.org/) financiado pela concessão NIGMS GM62116 (JCP) forneceu vários glicanos utilizados neste estudo. Esta é a publicação 29113 do The Scripps Research Institute.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| NEXTERION® Slide H MPX-48 | Lâminas Schott | 1091525 | Microwell |
| ProScanArray Plus | PerkinElmer | descontinuou | o scanner de microarray confocal |
| Innoscan 1100AL Scanner/Mapix Software | Innopsys-scanner | de microarray confocal | |
| MicroGrid II | Impressora Digilab-microaray | ||
| SNA | Vector Labs | B-1305 | Lectina vegetal |
| ECA | Vector Labs | B-1145 | Lectina vegetal |
| Anticorpo Anti-Estreptococo | IBA | 2-1509-001 | Anitbody para ligação HA |
| Anti-Mouse Alexa-647 | Life | A-21235 | Anitbody para ligação |
| HA Tween-20 | Sigma | P2287 | Detergente |
| Fosfato de Sódio di-básico | Sigma | 255793 | componente de buffer de impressão |
| mono-básico Fosfato de sódio Sigma | 229903 | componente de buffer de impressão | |
| solução de poli-l-lisina | Sigma | P8920; | componente de slide de pré-localização |
| hidróxido de sódio | Sigma | 221465 | componente de lâmina de pré-mancha |
| etanol | Sigma | 493546 | componente de lâmina de pré-mancha |
| tampão de fosfato solução salina | Corning | 46-013-CM | tampão de incubação/lavagem |
| SMP4B pinos | Telechem | SMP4B | pino de impressão |
| Nitrogênio comprimido (Grade5) | Praxair | UN1066 | ferramenta geral de espanagem/secagem |
| Ácido bórico | Sigma | B6768-500G | Reagente de bloqueio de lâminas |
| etanolamina | Sigma | E9508-500ML | Reagente de bloqueio de lâminas |
| Atto 488 | AttoTec | AD 488-91 | Marcador de grade na matriz |
| Consórcio PAA-LNLN | para Glicômica Funcional | PA368 | Glicanos manchados |
| Consórcio PAA-3SLNLN | para Glicanos Manchados | PA362 | Glicanos Funcionais |
| PAA-6SLNLN | Consórcio para Glicômica Funcional | PA343 | Glicanos Manchados |
| LNLN | Consórcio para Glicômica Funcional | Te98 | Glicanos Manchados |
| 3SLNLN | Consórcio para Glicômica Funcional | Te175 | Glicanos Manchados |
| 6SLNLN | Consórcio para Glicômica Funcional | Te176 | Glicanos manchados |
| Placa de microtitulação de 384 poços | Matrix TechCorp | 4361 | Placa de impressão |
| Marcador de laboratório VWR | VWR | 52877-150 | Numeração de lâminas |
| Placa de coloração de lâminas Wheaton | Sigma | Z103969-1EA | Bloqueio e secagem |
Referências
- Tumpey, T. M., et al. A two-amino acid change in the hemagglutinin of the 1918 influenza virus abolishes transmission. Science. 315 (5812), 655-659 (2007).
- Xu, R., et al. Functional ba....
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Reimpressões e permissões
