Artigo de método

A Miniaturized Glycan Microarray Ensaio para a Avaliação de avidez e especificidade do Hemaglutininas vírus da gripe A

DOI:

10.3791/53847

⸱

29 de maio de 2016

 ,  , 
1Department of Cell and Molecular Biology, Chemical Physiology and Microbial Science, The Scripps Research Institute, 2Department of Medicinal Chemistry and Chemical Biology, Utrecht Institute for Pharmaceutical Sciences, Utrecht University

Neste artigo

Resumo

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Usando uma estratégia de microarray de glicano impresso, um ensaio convencional de placa de 96 poços foi miniaturizado para análise da avidez e especificidade da hemaglutinina do vírus influenza A para receptores contendo ácido siálico.

Resumo

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Vírus da Influenza A (IAV) hemaglutininas reconhecem ácidos siálicos na superfície celular como receptores funcionais para ganhar a entrada nas células. aves aquáticas selvagens são o reservatório natural para IAV, mas IAV pode cruzar a barreira das espécies para aves, suínos, cavalos e seres humanos. vírus aviários reconhecer ácido siálico ligado a um penúltimo galactose através de uma ligação α2-3 (receptores do tipo aviário), enquanto que os vírus humanos reconhecem preferencialmente ácido siálico com uma ligação α2-6 (receptores do tipo humano). Para monitorar se os vírus aviários estão a adaptar-se aos receptores do tipo humano, podem ser usados ​​vários métodos. microarrays de glicano com diversas bibliotecas de sialosides sintéticos são cada vez mais utilizadas para avaliar a especificidade do receptor. No entanto, esta técnica não é usada para medir a avidez. Medição de avidez é tipicamente alcançada por avaliação da ligação de hemaglutinina ou de vírus diluído em série a glicanos adsorvidos ao polipropileno placas de 96 poços convencionais. Neste ensaio, os glicanos com α2-3 ou α2-6 ácidos siálicos são acoplados a biotina e adsorvido a placas de estreptavidina, ou são acoplados a poliacrilamida (PAA), que adsorver directamente para o plástico. Temos miniaturizado significativamente este ensaio, imprimindo directamente ligada sialosides-PAA e os seus homólogos não ligada-PAA em lâminas de vidro de micro-poços. Este set-up, com 48 matrizes em um único slide, permite ensaios simultâneos de 6 glicano proteínas de ligação em 8 diluições, interrogando 6 glicanos diferentes, incluindo dois controles não-sialilados. Isto é equivalente a 18x placas de 96 cavidades na placa de ensaio tradicionais. O formato de matriz de glicanos diminui o consumo de compostos e produtos biológicos e, portanto, aumenta muito a eficiência.

Introdução

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aves aquáticas selvagens são o reservatório natural para IAV, mas IAV é capaz de atravessar a barreira das espécies para aves e mamíferos, incluindo os humanos. IAVS aviárias reconheçam α2-3 ácidos siálicos ligados (receptores do tipo aviário), enquanto que os vírus humanos se ligam α2-6 ácidos siálicos ligados (receptores do tipo humano). Para ser capaz de se replicar eficientemente e transmitir entre seres humanos uma IAV aviária necessita de se ligar a receptores do tipo 1 humano.

IAVS são divididas com base na serologia que caracteriza a sua antigenicidade de hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA) glicoproteínas do envelop....

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Protocolo

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NOTA: Todos os passos são realizados à temperatura ambiente a menos que indicado de outra forma.

1. Disposição Construção

  1. Glicanos Preparação e configuração da placa
    1. Prepare um estoque de tampão impressão. Em primeiro lugar fazer 500 ml de uma solução de estoque de 150 mM de fosfato de sódio dibásico. Também fazem 50 ml de uma solução de estoque de 150 mM de solução de fosfato de sódio monobásico. Num balão, utilizando uma barra de agitação magnética e um medidor de pH, lentamente titule a solução de fosfato de sódio dibásico com a solução monobásico até um pH de 8,5 seja alcançado. Adicionar Tween-20 a 0,005%.
    2. Prepare as amostra....

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Resultados

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Impressão, digitalização e análise de dados

Para garantir a impressão correta, é vital ter o alinhamento correto da grade manchado dentro da máscara de teflon, que delineia cada matriz no slide. Durante a impressão, devido à natureza do revestimento de Teflon, as manchas não podem ser vistos a olho nu nas lâminas MPX. Dá-se atenção, em seguida, para o aparecimento dos pré-manchas sobre as lâminas de poli-L-lisina revestidos. D.......

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Discussão

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Avaliando especificidade de receptor IAV é um passo importante na análise do potencial pandemia de vírus aviários. reconhecimento de ácido siálico por o vírus está ligada a várias propriedades biológicas, tais como ligação e libertação a partir da célula. O conhecimento de que mutações de aminoácidos são necessários para vírus aviários para alcançar α2-6 vinculativo e cruzar a barreira das espécies permite preparação para uma pandemia. Vários ensaios são utilizados para determinar a especificidade do receptor; No entant.......

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado em parte pela facilidade Scripps Microarray Core, e um contrato a partir dos Centros de Controle de Doenças (JCP). RPdV é um beneficiário de uma doação Rubicon e VENI da Organização Holandesa para Pesquisa Científica (NWO). O Consórcio para Glycomics Funcionais (http://www.functionalglycomics.org/) financiado pela concessão NIGMS GM62116 (JCP) forneceu vários glicanos utilizados neste estudo. Esta é a publicação 29113 do The Scripps Research Institute.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
NEXTERION® Slide H MPX-48 Lâminas Schott1091525Microwell
ProScanArray Plus PerkinElmerdescontinuouo scanner de microarray confocal
Innoscan 1100AL Scanner/Mapix SoftwareInnopsys-scannerde microarray confocal
MicroGrid II Impressora Digilab-microaray
SNAVector LabsB-1305 Lectina vegetal
ECAVector LabsB-1145 Lectina vegetal
Anticorpo Anti-EstreptococoIBA2-1509-001 Anitbody para ligação HA
Anti-Mouse Alexa-647LifeA-21235Anitbody para ligação
HA Tween-20SigmaP2287 Detergente
Fosfato de Sódio di-básicoSigma255793componente de buffer de impressão
mono-básico Fosfato de sódio Sigma229903 componente de buffer de impressão
solução de poli-l-lisinaSigmaP8920;componente de slide de pré-localização
hidróxido de sódioSigma221465componente de lâmina de pré-mancha
etanolSigma493546componente de lâmina de pré-mancha
tampão de fosfato solução salinaCorning46-013-CMtampão de incubação/lavagem
SMP4B pinosTelechemSMP4Bpino de impressão
Nitrogênio comprimido (Grade5)PraxairUN1066ferramenta geral de espanagem/secagem
Ácido bóricoSigmaB6768-500GReagente de bloqueio de lâminas
etanolaminaSigmaE9508-500MLReagente de bloqueio de lâminas
Atto 488AttoTecAD 488-91Marcador de grade na matriz
Consórcio PAA-LNLNpara Glicômica FuncionalPA368Glicanos manchados
Consórcio PAA-3SLNLNpara Glicanos ManchadosPA362Glicanos Funcionais
PAA-6SLNLNConsórcio para Glicômica FuncionalPA343Glicanos Manchados
LNLNConsórcio para Glicômica FuncionalTe98Glicanos Manchados
3SLNLNConsórcio para Glicômica FuncionalTe175Glicanos Manchados
6SLNLNConsórcio para Glicômica FuncionalTe176Glicanos manchados
Placa de microtitulação de 384 poçosMatrix TechCorp4361Placa de impressão
Marcador de laboratório VWRVWR52877-150Numeração de lâminas
Placa de coloração de lâminas WheatonSigmaZ103969-1EABloqueio e secagem

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tumpey, T. M., et al. A two-amino acid change in the hemagglutinin of the 1918 influenza virus abolishes transmission. Science. 315 (5812), 655-659 (2007).
  2. Xu, R., et al. Functional ba....

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Reimpressões e permissões

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Etiquetas

Glycan Microarray AssayInfluenza A VirusHemagglutinin BindingAvidity MeasurementSpecificity AnalysisSialic Acid LinkagePAA Conjugated GlycansSerial DilutionFluorescent DetectionData Analysis

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