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Immunology and Infection

उत्सुकता और इन्फ्लुएंजा एक वायरस Hemagglutinins की विशिष्टता का आकलन करने के लिए एक छोटी glycan माइक्रोएरे परख

Published: May 29, 2016 doi: 10.3791/53847
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Cell and Molecular Biology, Chemical Physiology and Microbial Science, The Scripps Research Institute, 2Department of Medicinal Chemistry and Chemical Biology, Utrecht Institute for Pharmaceutical Sciences, Utrecht University

Abstract

इन्फ्लुएंजा ए वायरस (IAV) hemagglutinins कोशिका की सतह पर सियालिक एसिड को पहचान के रूप में कार्य रिसेप्टर्स कोशिकाओं में प्रवेश पाने के लिए। जंगली जलपक्षी IAV के लिए प्राकृतिक जलाशय हैं, लेकिन IAV मुर्गी, सूअर, घोड़े और मनुष्य के लिए प्रजातियों बाधा पार कर सकते हैं। एवियन वायरस सियालिक एक α2-3 लिंकेज (एवियन प्रकार रिसेप्टर्स) द्वारा एक अंत से पहले गैलेक्टोज से जुड़ी है, जबकि मानव वायरस रियायत के तौर पर एक α2-6 उठाना (मानव-प्रकार रिसेप्टर्स) के साथ सियालिक एसिड को पहचान एसिड को पहचानते हैं। एवियन वायरस मानव प्रकार रिसेप्टर्स के लिए अनुकूल हैं, तो नजर रखने के लिए, कई तरीकों का इस्तेमाल किया जा सकता है। सिंथेटिक sialosides की विभिन्न पुस्तकालयों के साथ glycan प्रोटीन तेजी से रिसेप्टर विशिष्टता का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। हालांकि, इस तकनीक avidities को मापने के लिए इस्तेमाल नहीं किया है। उत्सुकता का मापन आम तौर पर क्रमानुसार पतला hemagglutinin या वायरस के बंधन का मूल्यांकन पारंपरिक polypropylene 96 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए adsorbed ग्लाइकान करने से हासिल की है। इस परख में, α साथ ग्लाइकान2-3 या α2-6 सियालिक एसिड बायोटिन करने के लिए मिलकर कर रहे हैं और streptavidin प्लेटों के लिए adsorbed, या polyacrylamide (PAA) जो सीधे प्लास्टिक को सोखना करने के लिए मिलकर कर रहे हैं। हम काफी सीधे सूक्ष्म अच्छी तरह से गिलास स्लाइड पर PAA से जुड़े sialosides और उनके गैर PAA से जुड़े समकक्षों मुद्रण द्वारा इस परख छोटी है। यह सेट-अप, एक एकल स्लाइड पर 48 सरणियों के साथ, 6 glycan 8 dilutions में प्रोटीन बंधन, दो गैर-sialylated नियंत्रण सहित 6 अलग ग्लाइकान, पूछताछ के एक साथ assays के लिए सक्षम बनाता है। इस पारंपरिक प्लेट परख में 18x 96 अच्छी तरह प्लेटें के बराबर है। glycan सरणी प्रारूप यौगिकों और बायोलॉजिकल की खपत कम हो जाती है और इस प्रकार बहुत क्षमता को बढ़ाता है।

Introduction

जंगली जलपक्षी IAV के लिए प्राकृतिक जलाशय हैं, लेकिन IAV मुर्गी और सहित, मनुष्य स्तनधारियों के लिए प्रजातियों बाधा पार करने में सक्षम है। एवियन IAVS, α2-3 जुड़े सियालिक एसिड (एवियन प्रकार रिसेप्टर्स) समझते हैं जबकि मानव वायरस α2-6 जुड़े सियालिक एसिड (मानव-प्रकार रिसेप्टर्स) बाँध। कुशलता से दोहराने के लिए और मनुष्य एक एवियन IAV मानव-प्रकार रिसेप्टर्स 1 के लिए बाध्य करने की जरूरत के बीच संचारित करने में सक्षम होने के लिए।

IAVS सीरम विज्ञान है कि उनके hemagglutinin (हेक्टेयर) और neuraminidase (एनए) लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन के प्रतिजनकता की विशेषता के आधार पर विभाजित हैं। हा, सियालिक एसिड को बांधता है, जबकि NA वायरल जीवन चक्र और cleaves सियालिक एसिड 2 के दूसरे छोर पर रिसेप्टर को नष्ट करने एंजाइम है। H1N1, H2N2 और H3N2 सहित सभी मानव को संक्रमित वायरस, एक एवियन मूल 3 लोगों की है। दशकों से अधिक समय मानव क्रॉसओवर करने के लिए कई एवियन के अंतिम दो H5N1, H7N7, H7N9 और साथ हुआ है सबसे अच्छी तरह से जाना जा रहा है; होवेदेखें, अन्य उपप्रकार अधिक कई मायनों मनुष्यों को संक्रमित है (H6N1, H7N1, H7N2, H9N2, H10N7, H10N8) 4। सौभाग्य से, ऐसा लगता है कि ये वायरस से कोई भी पूरी तरह से मानव-प्रकार α2-6 से जुड़े सियालिक एसिड रिसेप्टर्स 5-8 के लिए अनुकूल करने में सक्षम है। एवियन वायरस या अन्य जूनोटिक के अनुकूलन मानव मेजबान टीम में प्रतिकृति और ट्रांसमिशन समायोजित करने के लिए मानव स्वास्थ्य पर एक विनाशकारी प्रभाव हो सकता है। इसलिए, कैसे ये वायरस मानव-प्रकार रिसेप्टर्स के लिए बाध्य करने के लिए उभरते इन्फ्लूएंजा वायरस के दुनिया भर में व्यापक निगरानी में मदद मिलेगी विकसित हो रहे हैं के पूर्व ज्ञान।

रिसेप्टर वरीयता का निर्धारण पहले विभिन्न प्रजातियों के एरिथ्रोसाइट्स का उपयोग कर elucidated और फ्लू के शोधकर्ताओं ने 9-12 के बीच एक इष्ट परख रहता था। प्रदर्शन है कि एवियन वायरस को पहचान α2-3 सियालिक एसिड और मानव वायरस α2-6 सियालिक एसिड से जुड़े मूल रूप से एक परख एरिथ्रोसाइट्स enzymatically ली से प्रत्येक को शामिल करने के लिए इंजीनियर की hemagglutination के प्रयोग पर आधारित था13,14 nkages। हालांकि readout hemagglutination, virologists के लिए एक मानक परख है, अंतर्निहित glycan संरचनाओं परिभाषित नहीं कर रहे हैं, केवल टर्मिनल लिंकेज। इसके अतिरिक्त, sialyltransferases, कोशिकाओं को फिर से sialylate करने के लिए इस्तेमाल की सीमित उपलब्धता, इस परख 15-18 का उपयोग सीमित है। बाद में, रिसेप्टर बाध्यकारी वरीयताओं का निर्धारण करने के अन्य तरीकों sialylated glycan प्लेट आधारित assays 19,20 में पाली एक्रिलामाइड (PAA) या पाली ग्लूटामेट (पीजीए) संरचनाओं से जुड़े संरचनाओं का उपयोग शुरू किए गए थे। कई रूपों microtiter प्लेटें, जिनमें से प्रत्येक का एक मजबूत, विश्वसनीय और बहुत ही संवेदनशील एलिसा प्रकार परख 21-23 में परिणाम के लिए कोटिंग या तो ग्लाइकान या वायरस में संभव हो रहे हैं। वैकल्पिक रूप से, बायोटिन से जुड़े ग्लाइकान PAA / पीजीए जगह ले सकता है और streptavidin में लिपटे प्लेटों 2,24 संयुग्मित जा सकता है। हालांकि कुछ विशिष्ट सीरा आवश्यक हो सकता है, ELISAs मानक और कई PAA से जुड़े ग्लाइकान कर रहे हैं आसानी से commerciallY और गैर-व्यावसायिक रूप से उपलब्ध (कार्यात्मक Glycomics के लिए कंसोर्टियम (http://www.functionalglycomics.org))।

Glycan माइक्रोएरे प्रौद्योगिकी, रिसेप्टर विशिष्टता निर्धारित करने के लिए एक अमूल्य उपकरण के रूप में उभरा है के रूप में कई अलग अलग ग्लाइकान देखा जाता है, और विभिन्न संरचनाओं की एक विस्तृत सरणी के लिए बाध्य एक भी परख 25-29 के भीतर मूल्यांकन किया जा सकता है। इन संरचनाओं को IAV के बंधन glycan संरचनाओं कि IAV रियायत के तौर पर 30-33 पहचानता का एक बेहतर समझ प्रदान करता है। Glycan प्रोटीन एक बाध्यकारी परख प्रदर्शन करने के लिए नमूना मात्रा की छोटी मात्रा में आवश्यकता होती है और केवल स्थान (2 NL) प्रति glycan की मात्रा मिनट उपयोग करता है। हालांकि, इन सरणियों आम तौर पर ग्लाइकान रिसेप्टर्स की विशिष्टता का मूल्यांकन करने के लिए ही किया जाता है। कई वायरस, या hemagglutinin प्रोटीन, कई एकाग्रता पर्वतमाला में से विश्लेषण की आवश्यकता स्लाइड्स की संख्या की वजह से निषेधात्मक हो सकता है। इसके अलावा, आज तक, कोई रिश्तेदार उत्सुकता परख glycan की गिरफ्तारी का उपयोग कर विकसित किया गया हैरे तकनीक।

glycan माइक्रोएरे तकनीक और एलिसा आधारित assays में Paa से जुड़े ग्लाइकान की संवेदनशीलता द्वारा afforded कम नमूना आवश्यकता गठबंधन करने के लिए, हम के रूप में की तुलना में एक बहु अच्छी तरह से glycan सरणी है कि समान या बेहतर संकल्प के साथ उच्च throughput विश्लेषण के लिए अनुमति होगी विकसित करने की मांग पारंपरिक एलिसा आधारित परख करने के लिए। इसके साथ ही, हम बायोलॉजिकल और रिपोर्टर रसायन खपत की मात्रा को कम करना चाहता था। अंतिम परिणाम एक छोटी उत्सुकता परख, विशेष IAV विशिष्टता की निगरानी के लिए विकसित किया है और समान रूप से अन्य glycan बंधनकारी प्रोटीन का आकलन करने के लिए लागू है। एक गिलास स्लाइड एक Teflon मुखौटा द्वारा 48 माइक्रो कुओं में अलग प्रयोग, 6 अलग ग्लाइकान अच्छी तरह से प्रति 6 प्रतिकृति में देखा जाता है। माइक्रोएरे मंच देता है रिसेप्टर में एक ही प्रवृत्तियों कई फायदे के साथ मैक्रो एलिसा प्रारूप में देखा बंधन। ये (मैं) 6 प्रतिकृति में परिसर के मुद्रण, शामिल न्यूनतम नमूना का उपयोग कर, कई पंक्तियों की कोटिंग बनाम मैंna थाली, अच्छी तरह से प्रति 100 μl का उपयोग; (द्वितीय) कई विभिन्न यौगिकों नियंत्रण सहित एक भी अच्छी तरह से, एक साथ विश्लेषण किया; (तृतीय) ऊष्मायन मात्रा और में भारी कमी; (चतुर्थ) एक बड़ा गतिशील एक फ्लोरोसेंट readout का उपयोग कर सीमा होती है। एक एकल स्लाइड 18x 96 अच्छी तरह प्लेटें के बराबर होने की गणना की जा सकती है।

निम्नलिखित प्रोटोकॉल, fabricating और विश्लेषण के किसी भी प्रयोगशाला में सक्षम साथ देखा प्रोटीन इस छोटी एलिसा प्रारूप का निर्माण करने में सक्षम होना चाहिए।

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Protocol

नोट: सभी चरणों के कमरे के तापमान पर किया जाता है जब तक अन्यथा इंगित।

1. ऐरे निर्माण

  1. Glycan तैयारी और प्लेट सेटअप
    1. मुद्रण बफर के एक शेयर की तैयारी। सबसे पहले द्विक्षारकीय सोडियम फास्फेट की एक 150 मिमी शेयर समाधान की 500 मिलीलीटर बनाते हैं। इसके अलावा अकेले आधार सोडियम फास्फेट समाधान की एक 150 मिमी शेयर समाधान के 50 मिलीलीटर बनाते हैं। एक फ्लास्क में, एक चुंबकीय हलचल बार और पीएच मीटर का उपयोग कर, धीरे-धीरे अकेले आधार समाधान के साथ द्विक्षारकीय सोडियम फास्फेट समाधान titrate तक 8.5 के पीएच तक पहुँच जाता है। 0.005% के बीच -20 जोड़ें।
    2. glycan नमूने तैयार करें। PAA पतला संयुग्मित ग्लाइकान, (diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA), 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA) और 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA (चित्रा 1 ए )) 100μg को पतला करने की कर रहे हैं / step1.1.1। Monovalent ग्लाइकान से बफर छपाई में मिलीलीटर,diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ- (सीएच 2) 3 राष्ट्रीय राजमार्ग 2, 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ - (सीएच 2) 3 राष्ट्रीय राजमार्ग 2) और 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1- 4GlcNAcβ - कदम 1.1.1 से मुद्रण बफर में (सीएच 2) 3 राष्ट्रीय राजमार्ग 2)) 100μM करने के लिए। अंत में, अमाइन-क्रियाशील रंगों को तैयार है, ग्रिड मार्कर / लैंडिंग रोशनी के रूप में उपयोग करने के लिए। डाई मार्कर स्पॉट 1 माइक्रोन पर मुद्रित कर रहे हैं।
      नोट: Atto488 एनएचएस डाई हमारे प्रिंट में प्रयोग किया जाता है। हालांकि, किसी भी अमाइन-क्रियाशील डाई, स्लाइड स्कैनर द्वारा पठनीय इस उद्देश्य के लिए उपयुक्त है।
    3. स्थानांतरण 384 अच्छी तरह से microtiter प्लेट के लिए प्रत्येक glycan नमूना के 10 μl, मुद्रण रोबोट के लिए इस्तेमाल किया। सील ट्यूबों में -20 डिग्री सेल्सियस पर मुद्रण बफर समाधान में स्टोर अप्रयुक्त ग्लाइकान। Tansfer मुद्रण थाली करने के लिए डाई मार्कर के 10 μl।
  2. मुद्रण
    नोट: सभी काएंपुनश्च चिंता छूने या स्लाइड दस्ताने के साथ किया जाना चाहिए चलती है।
    1. लेआउट का सही विन्यास के अनुसार मुद्रण सिर में arrayer पिन रखें। इस लेआउट के लिए एक पिन का उपयोग सभी नमूनों और सारणियों मुद्रित करने के लिए। छह के ब्लॉक में ग्लाइकान प्रिंट, एक विशेषता लंघन (एक विशेषता एक निश्चित परिसर के एक स्थल के रूप में परिभाषित किया गया है), प्रत्येक पक्ष पर, ऐसा है कि एक ही नमूने के धब्बे को एक दूसरे के बगल में वास्तव में मुद्रित नहीं कर रहे हैं।
      ध्यान दें: अंत उपयोगकर्ता विन्यास तय करना होगा।
    2. बैग, खुले बक्से से स्लाइड्स निकालें, और किसी भी धूल कणों या प्लास्टिक के छोटे टुकड़े कि प्रत्येक स्लाइड पर अति उच्च शुद्धता नाइट्रोजन गैस उड़ाने से उनके सतहों पर हो सकता है हटा दें। स्लाइड्स की वांछित संख्या, लेपित पक्ष जगह, arrayer मंच पर।
    3. कार्यक्रम arrayer, यात्रा के प्रति 27 धब्बे के मापदंडों के स्रोत थाली करने के लिए, 3, पाली एल Lysine लेपित स्लाइड पर "पूर्व स्पॉट 'का उपयोग कर का उपयोग करें मुद्रण पिन की नोक पर अतिरिक्त तरल दूर करने के लिए
      1. MPU (मुख्य पावर यूनिट) और जलवायु नियंत्रण इकाई चालू करें। कंप्यूटर पर खुला टाइलिंग विश्लेषण सॉफ्टवेयर।
      2. प्रिंट करने के लिए लेआउट का चयन करें। 1 एकल पिन - विकल्प → पिन उपकरण सरणी 1 एक्स 1 प्रिंट उपकरण मुद्रण के लिए प्रयोग की जाने वाली चयन करें। लक्ष्य टैब → उपकरण ऐरे परिभाषा → प्रिंट पैटर्न का चयन करें और पिच को जोड़ने (स्पॉट करने के लिए मौके की दूरी), पंक्तियों और स्तंभों के नमूनों को समायोजित करने की संख्या मुद्रित करने के लिए, और नमूने के मुद्रण पैटर्न (इस सरणी एक 8 के लिए एक्स 8 मुद्रण पैटर्न कुल 7 नमूने के लिए 340 माइक्रोन पिच) पर प्रयोग किया जाता है।
      3. लक्ष्य → स्लाइड लेआउट का चयन करें और ब्लॉक करने के लिए ब्लॉक दूरी कार्यक्रम 48 अच्छी तरह से (4 x 12) स्लाइड टेम्पलेट में प्रत्येक को दोहराने सरणी के मुद्रण की अनुमति है। स्रोत का चयन करें और जब (1 पिन का उपयोग प्रत्येक नमूना के लिए 1) (इस प्रिंट 7 स्रोत पिकप के लिए 6 नमूना कुओं और 1 डाई मार्कर अच्छी तरह से समायोजित करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा) स्रोत पिकप की संख्या जोड़ सकते हैं।
        नोट: स्रोत संवाद हरे रंग की बारी चाहिए कि संख्या को दिखाने के लिएस्रोत दर्शक के नमूने प्रिंट पैटर्न में मुद्रित करने के लिए मेल खाता है।
      4. लक्ष्य → अनुकूलक प्लेट का चयन करें और स्लाइड लेआउट और स्लाइड संख्या को समायोजित (5 स्लाइड 1 पूर्व खोलना स्लाइड के साथ इस प्रिंट के लिए एक समय में मुद्रित कर रहे हैं)।
      5. ट्रे को सक्रिय करने और ट्रे करने के लिए स्लाइड की वांछित संख्या जोड़ने, पूर्व खोलना स्लाइड (नीला) और "असली" स्लाइड के स्थानों के करीब ध्यान दे करने के लिए T1 बटन पर क्लिक करके ट्रे रिलीज।
      6. वैक्यूम ब्लॉक और वैक्यूम सक्रिय करने के लिए ठीक क्लिक करने के लिए सभी शेष वैक्यूम बंदरगाहों पर सादे गिलास स्लाइड रखें। जाँच करें कि सभी स्लाइड्स जगह में आयोजित किया जाता है और घर की स्थिति के लिए ट्रे लौटने के लिए ठीक क्लिक करें।
      7. प्लेट धारक में प्रिंटिंग प्लेट लोड और यह सुनिश्चित रैक जगह में सही ढंग से स्थापित किया गया है। जाएँ क्लिक करें और मुद्रण प्रक्रिया आगे बढ़ने के लिए अनुमति देते हैं।
    4. प्रिंट सरणी प्रति 6 स्पॉट की प्रतिकृति में शेष 24 धब्बे (4 सरणियों / स्रोत पर जाएँ)।
    5. 384 अच्छी तरह प्लेटें लोडप्रिंटर में और छपाई शुरू करते हैं। सापेक्ष आर्द्रता बनाए रखने, जबकि बीच 55 और 65%, मुद्रण प्रिंट भर में। प्रिंटर 5 स्लाइड मुद्रण के बाद बंद हो जाता है।
      नोट: इस परख में माइक्रोएरे एक विशिष्ट 8 x 8 पैटर्न में मुद्रित किया जाता है, वहीं विभिन्न मुद्रण माइक्रोएरे रोबोट वांछित लेआउट को प्राप्त करने के लिए उपकरण विशेष प्रोग्रामिंग की आवश्यकता होगी। यह उनके उपकरणों की विशेषताओं को देखते हुए सबसे उपयुक्त पैटर्न निर्धारित करने के लिए अंत उपयोगकर्ता पर निर्भर है।
  3. Humidification / immobilizing
    नोट: एक बार स्लाइड मुद्रण समाप्त कर दिया है, वे एक अस्थायी स्थिरीकरण कदम है, यह भी कहा जाता humidifying गुज़रना पड़ता है। Humidifying के बाद प्रिंट फिर से गीला धब्बे और पूरा अवरुद्ध सुनिश्चित करने के द्वारा नमूना लगाव homogenize करने के लिए मदद करता है।
    1. तुरंत 30 मिनट की अवधि के लिए मुद्रण के बाद एक 100% नमी कक्ष में स्लाइड्स रखो। , एक बड़ा गिलास डिश के तल में बहुत गीला कागज तौलिए फ्लैट रखने स्लाइड रखकर चैम्बर का निर्माणइस तरह के एक टेस्ट ट्यूब रैक, प्रिंट पक्ष के रूप में रैक, किसी प्रकार का, और नमी में फंसाने के लिए प्लास्टिक की चादर के साथ सील पर।
    2. संख्या एक शराब / विलायक प्रतिरोधी अंकन कलम और एक सुखाना बॉक्स में दुकान के साथ स्लाइड। रात भर सूखना।
  4. नंबर, अवरुद्ध, और भंडारण
    1. 50 मिमी borate बफर में 50 मिमी ethanolamine - अवरुद्ध बफर तैयार करें। सबसे पहले, एक कुप्पी एक चुंबकीय हलचल बार युक्त में 50 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए, बोरिक एसिड भंग, DDH 2 हे में। एक भावप्रवण प्लेट पर सख्ती समाधान हलचल जब तक सभी ठोस भंग कर दिया है। जबकि लगातार क्रियाशीलता, वांछित 50 मिमी एकाग्रता तक पहुँचने के लिए एक 16.54 एम स्टॉक समाधान से ethanolamine की उचित मात्रा में जोड़ने। 9.2 की एक अंतिम पीएच को समायोजित करने के लिए केंद्रित सोडियम हाइड्रोक्साइड जोड़ें।
    2. 1 घंटे के लिए अवरुद्ध बफर समाधान में मुद्रित स्लाइड विसर्जित कर दिया।
    3. 1 घंटा के बाद, DDH 2 हे में स्लाइड्स कुल्ला बफर अवरुद्ध करने में किसी भी अतिरिक्त निशान को दूर करने के लिए।एक उचित अपशिष्ट कंटेनर में बफर अवरुद्ध फेकें।
    4. कांच धुंधला धारकों के लिए स्लाइड स्थानांतरण और सूखी स्पिन। 5 मिनट के लिए, झूल प्लेट धारकों के साथ सुसज्जित एक अपकेंद्रित्र में उन्हें रखने के 10 XG की गति से सूखी सरणियों।
    5. एक बार जब स्लाइड सूख रहे हैं, वे तुरंत incubated या संग्रहित किया जा सकता है। भंडारण की स्थिति एक मोहरबंद प्लास्टिक की थैली में -20 डिग्री सेल्सियस हैं।

2. का विश्लेषण glycan बंधनकारी प्रोटीन

  1. एक humidified कक्ष जिसमें सरणियों फिट होगा संकरित होने के लिए तैयार। एक साधारण चैम्बर एक Pyrex पकवान, घटा कागज तौलिए और एक रैक, जिस पर स्लाइड आराम करेंगे साथ तल पर बहुस्तरीय के होते हैं।
  2. Biotinylated lectins प्रयोग एसएनए (Sambuca Nigra agglutinin) और ईसीए (इरिथ्रिना cristagalli agglutinin) 10 माइक्रोग्राम / एमएल + 2 माइक्रोग्राम / Streptavidin-555 डाई की मिलीलीटर, बफर जांच में (पीबीएस + 0.01% बीच 20)। हा (ए / वियतनाम / 1203/04 H5N1 और ए / केंटकी / 07 H1N1, इस उदाहरण में), उपयोग के लिए20 माइक्रोग्राम की एक प्रारंभिक एकाग्रता / एमएल पूर्व complexed, के रूप में पहले 34 में वर्णित है। माउस-α-Strep: संक्षेप में, एक हा बनाने के बफर अवरुद्ध में बकरी-α चूहे-Alexa647 मिश्रण (पीबीएस + 3% बीएसए + 0.01% बीच 20), एक 4: 2: 1 अनुपात दाढ़।
    नोट: सरणी lectins के साथ जांच कर रहा है पता लगाने के लिए कि ग्लाइकान स्थिर कर रहे हैं और पता लगाने योग्य (चित्रा 1 बी)।
  3. 384 अच्छी तरह से थाली करने के लिए 20 μl के glycan बाध्यकारी प्रोटीन एंटीबॉडी मिश्रण समाधान स्थानांतरण और 30 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं। 1 बफर के 10 μl के साथ नमूना के 10 μl मिश्रण से उनके उचित बफर, 8 बार में: क्रमानुसार लेक्टिन और हा नमूने 1 पतला।
  4. पिपेट सूक्ष्म अच्छी तरह से सतह पर नमूना के 8 μl और 90 मिनट के लिए सील कर दिया आर्द्रीकरण (100% आरएच) कक्ष में सेते हैं।
  5. स्लाइड किनारों पकड़ रहा है और उन्हें पीबीएस के एक मिश्रण है और 0.05% के बीच में चार बार सूई से एक समय में एक से धो लें, तो चार पीबीएस में बार, और विआयनीकृत एच 2 ओ में अंत में चार बार का प्रयोगएक ही सूखने प्रोटोकॉल अवरुद्ध कदम में वर्णित है, पर 10 x जी पर 5 मिनट के लिए एक अपकेंद्रित्र में स्पिन सरणियों सूखी।

3. स्कैनिंग और डेटा विश्लेषण

ध्यान दें: glycan माइक्रोएरे स्कैनर के निर्माता के आधार पर अलग-अलग सेटिंग्स पर स्कैन किया जा सकता है। लेजर शक्ति और संकल्प अलग करके, साधन अपनी गतिशील रेंज (चित्रा 1 सी) के भीतर संभव के रूप में कई संकेतों के साथ एक छवि का उत्पादन कर सकते हैं।

  1. एक फ्लोरोसेंट स्लाइड स्कैनर का प्रयोग करें और तुरंत glycan बंधनकारी प्रोटीन के साथ ऊष्मायन के बाद सरणियों स्कैन। यह सुनिश्चित करने के लिए स्लाइड सही ढंग से स्कैनिंग साधन में डाला जाता है ख्याल रखना।
    1. ओपन स्कैनिंग सॉफ्टवेयर। कार्यक्रम को खोलने के लिए क्लिक करें प्रारंभ करें। स्कैनर → कनेक्ट या स्कैनर नेविगेशन पैनल मेनू में हरे बटन: स्कैनर से कनेक्ट करें।
    2. स्कैनर के ओपन autoloader दरवाजा। स्लॉट में स्लाइड विशेष क्रम में autoloader में रखें। बंद autoloader दरवाजा। सीएलICK "पढ़ा लोडर" ऑटो के लिए उपकरण नेविगेशन पैनल में स्कैनर में स्लाइड्स का पता लगाने।
    3. पैरामीटर स्कैन सेट: स्कैनर → स्कैन मापदंडों का प्रयोग (जैसे 635 लेजर शक्ति अधिक है, का पता लगाने के लाभ में 50%) के लिए उपयुक्त है। स्कैन स्लाइड: स्कैनर → स्कैन। छवियों स्कैन और नाम अलग-अलग स्कैन बचाने के लिए एक फ़ोल्डर बनाने के द्वारा पथ का चयन करें। वास्तविक स्कैनिंग करने के लिए इस से पहले करो। प्रत्येक व्यक्ति स्लाइड के लिए दोहराएँ। स्कैनिंग शुरू करने के लिए ठीक क्लिक करें।
  2. स्लाइड साधन की स्थापना की और स्कैन करने के लिए स्कैनर सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें। स्कैनर सेट iteratively 25%, 50% और 75% का लाभ सेटिंग्स में वृद्धि के साथ कम लेजर शक्ति (5 मेगावाट) स्कैन करने के लिए।
    नोट: सेटिंग्स का परीक्षण किया जा सकता है और अनुकूलित किया है, लेकिन ध्यान रखें कि प्रत्येक स्कैन संभवतः photobleaching के कारण रंगों के प्रतिदीप्ति उत्पादन कम कर सकते हैं में रहते हैं।
    1. ओपन डाटा अधिग्रहण और विश्लेषण सॉफ्टवेयर Mapix सॉफ्टवेयर के रूप में इस तरह के। कार्यक्रम को खोलने के लिए क्लिक करें प्रारंभ करें। ओपन स्कैन छवि: फ़ाइल → खोलें imउम्र। ओपन लड़की फ़ाइल: → खुला ग्रिड का विश्लेषण करें और उचित लड़की फ़ाइल का चयन करें।
    2. ग्रिड स्थानांतरित करने के लिए छवि → ब्लॉकों मोड: ब्लॉक मोड दर्ज करें। स्लाइड पर उचित स्थान पर ग्रिड स्थापित करने के लिए ग्रिड मार्कर का उपयोग। मुद्रित सरणी मैच के लिए आवश्यक के रूप में अलग-अलग ब्लॉकों को समायोजित करें।
    3. स्थान और ब्लॉक के भीतर अलग-अलग स्थानों में से आकार को समायोजित करने के लिए → स्पॉट मोड छवि: स्पॉट मोड दर्ज करें। एक बार सभी ब्लॉक और स्पॉट समायोजित कर रहे हैं और जगह में, उपाय के संकेत तीव्रता से → भामिति गणना का विश्लेषण। आउटपुट फ़ाइल सहेजें।
  3. एक बार जब स्लाइड स्कैनिंग समाप्त कर दिया है, छवियों छवि प्रसंस्करण स्थापित (- जी चित्रा -1) कार्यक्रम के साथ संकेतों बाइंडिंग के लिए विश्लेषण कर रहे हैं। छवि विश्लेषण के लिए, स्कैन झगड़ा छवि पर एक लड़की (ऐरे सूची) फ़ाइल लोड।
    नोट: लड़की फ़ाइल दोनों जगह लेआउट पैटर्न और प्रत्येक स्थान के स्थान की पहचान होती है। सरणियों के लिए लड़की फ़ाइलों सीआर हैंकि नमूनों की पहचान और 384 अच्छी तरह से स्रोत प्लेट में उनके स्थान होता है एक टैब-सीमांकित पाठ फ़ाइल का उपयोग प्रिंटर सॉफ्टवेयर द्वारा eated।
  4. ग्रिड मार्कर / लैंडिंग प्रोटीन पर मुद्रित रोशनी का उपयोग ठीक से जगह करने के लिए लड़की ग्रिड। व्यक्तिगत स्थानों को व्यक्तिगत रूप से ले जाया जा करना पड़ सकता है, लेकिन एक अच्छी तरह से मुद्रित सरणी आम तौर पर ग्रिड के भीतर ब्लॉकों आसानी से रखा जा करने की अनुमति देगा। ग्रिड प्लेसमेंट के बाद, सॉफ्टवेयर से हाजिर तीव्रता इकट्ठा करने और एक टैब-सीमांकित पाठ फ़ाइल (.txt) के रूप में बचाया।
    1. स्प्रेडशीट प्रोग्राम का उपयोग करना, स्कैनर से आउटपुट फ़ाइल खोलने के लिए। फ़ोल्डर स्थान से उचित मैक्रो फ़ाइल खोलें। क्लिक करें देखें → मैक्रो → RunMacro।
      नोट: पूर्व लिखा, कच्चे उत्पादन डेटा कॉपी अनावश्यक पंक्तियों और स्तंभों को निकालने नमूना से डेटा सॉर्ट औसत मतलब संकेत शून्य पृष्ठभूमि मूल्यों की गणना और एक फैल शीट प्रत्येक के लिए रेखांकन युक्त वर्कशीट करने के एवज में मूल्यों की साजिश होगा छह samp कीलेस सरणी पर परीक्षण किया।

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Representative Results

प्रिंटिंग, स्कैनिंग और डेटा का विश्लेषण करती है

उचित मुद्रण सुनिश्चित करने के लिए है, यह Teflon मुखौटा के भीतर देखा ग्रिड, जो स्लाइड पर प्रत्येक सरणी रूपरेखा बनाती है की सही संरेखण के लिए महत्वपूर्ण है। मुद्रण, Teflon कोटिंग की प्रकृति के कारण दौरान स्पॉट MPX स्लाइड पर नग्न आंखों से नहीं देखा जा सकता है। ध्यान पाली एल Lysine लेपित स्लाइड पर प्री-धब्बे की उपस्थिति को तो भुगतान किया जाता है। सीधे मुद्रण के बाद, प्रत्येक स्लाइड के बफर के लवण स्थान में सूखे के कारण प्रत्येक देखा यौगिक है कि दिख रहा है की उपस्थिति के लिए आंखों से जाँच की जानी चाहिए। सारणियों Teflon सीमाओं और देखा सुविधाओं की सही संख्या के भीतर स्पॉट के सही संरेखण के लिए निरीक्षण कर रहे हैं।

स्लाइड उच्च शक्ति स्कैन करने के लिए कम से चलने का एक प्रक्रिया में स्कैन कर रहे हैं तस्वीर विरंजन से बचने के लिए और hig की तुलना की अनुमतिउसकी उत्सुकता कम करने के लिए उत्सुकता से बाध्यकारी प्रोटीन है, जो उच्च और कम उत्पादन का संकेत है, क्रमशः। स्कैनिंग के बाद, उत्पादन छवियों में प्रत्येक स्थान के फ्लोरोसेंट तीव्रता एक इमेजिंग प्रोग्राम का उपयोग कर मापा जाता है। प्रत्येक सरणी एक ग्रिड फ़ाइल है कि सरणी सतह (- जी चित्रा -1) पर मुद्रित सुविधाओं की संख्या मैच के साथ overlayed है। मुद्रित फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग कर, मुद्रित ग्लाइकान की सीमाओं से परिभाषित कर रहे हैं और एक मुखौटा है कि मुद्रित नमूना की पहचान के साथ एकीकृत है प्रत्येक स्थान lassoes। इमेजिंग मुखौटा कमंद (, आकार, संकेत तीव्रता ग्रिड, आदि में निर्देशांक) imaged मौके के सभी पहलुओं को रिकार्ड होगा और उत्पादन में एक टैब-सीमांकित पाठ फ़ाइल के लिए इस जानकारी का। सारणीयन सॉफ्टवेयर (स्प्रेडशीट) का उपयोग करना, नमूने पहचान के आधार पर हल कर रहे हैं और मतलब संकेत तीव्रता शून्य पृष्ठभूमि प्रत्येक नमूना के लिए 6 स्थानों में से 4 पर औसतन है, outliers के रूप में उच्चतम और निम्नतम संकेत बाहर जा रही है। औसत मतलब संकेत के एक लाइन ग्राफशून्य से आठ पृष्ठभूमि प्रोटीन सरणी के लिए आवेदन किया सांद्रता के खिलाफ साजिश रची और प्रत्येक नमूना के लिए एक पंक्ति में शामिल किया जाता है। अंतिम उत्पादन ग्राफ एक गैर रेखीय प्रतिगमन गणना (चित्रा 1 मैं) का उपयोग smoothed है।

Glycan बंधनकारी प्रोटीन

PAA-ऐरे इन्फ्लूएंजा वायरस hemagglutinins के रिसेप्टर बाध्यकारी विशिष्टता का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है। हमारे घर से दूर अतिरिक्त सुविधा, अनुरूप प्लेट परख में मौजूद नहीं है, में एक ही सूक्ष्म अच्छी तरह से गैर sialylated नियंत्रण का समावेश है। आकलन करने के लिए है कि मुद्रित यौगिकों मुद्रण के बाद मौजूद हैं, आमतौर पर इस्तेमाल संयंत्र lectins ज्ञात विशिष्टता के साथ इस्तेमाल किया गया। ईसीए टर्मिनल एन एसिटाइल-glucosamine (Galβ1-4GlcNAc या LacNAc) से जुड़ा हुआ β1-4 गैलेक्टोज को बांधता है और बाध्य नहीं होगा यदि टर्मिनल गैलेक्टोज सियालिक एसिड के साथ छाया हुआ है। ईसीए केवल हमारी छोटी glycan आगमन पर गैर sialylated ग्लाइकान का पता लगाता हैप्र (2A चित्रा)। sialylated glycan नमूनों में से किसी के लिए बाध्य की कमी भी संकेत है कि ये पूरी तरह से टर्मिनल सियालिक एसिड के साथ छाया हुआ है है। Α2-6 जुड़े सियालिक एसिड के लिए, एसएनए एक लेक्टिन नियंत्रण (चित्रा 2 बी) के रूप में इस्तेमाल किया गया था। जैसी कि उम्मीद थी, एसएनए ही जुड़ा हुआ सियालिक एसिड α2-6 को बांधता है, लेकिन PAA से जुड़े गैर PAA से जुड़े di-LacNAc दोहराता के लिए आकर्षण में उल्लेखनीय मतभेदों के साथ। यह अंतर PAA से जुड़े ग्लाइकान की संवेदनशीलता को दर्शाता है और प्रोटीन है कि कम उत्सुकता के साथ बाँध सकता है की भेदभाव की अनुमति देता है। Α2-3 जुड़े सियालिक एसिड, एक H5 hemagglutinin से ए / वियतनाम / 1203/04 वायरस है कि α2-3 जुड़े सियालिक एसिड केवल पहचान करने के लिए जाना जाता है व्युत्पन्न 6 इस्तेमाल किया गया था। H5 हा के बंधन प्रोफ़ाइल वास्तव में α2-3 जुड़े सियालिक एसिड के लिए विशिष्टता, PAA से जुड़े संरचनाओं (चित्रा 2 सी) के लिए एक उच्च उत्सुकता के साथ दिखाता है। अंत में, एक मानव मौसमी H1N1 तनाव से एच 1 hemagglutinin इस्तेमाल किया गया था कि, उम्मीद के रूप में, केवलजुड़ा हुआ सियालिक एसिड युक्त संरचनाओं (चित्रा 2 डी) α2-6 करने के लिए बाध्य है।

आकृति 1
चित्रा 1: प्रिंटिंग, स्कैनिंग और छवि का विश्लेषण करती है (ए) PAA संयुग्मित 6SLNLN एक प्रतिनिधि glycan संरचना है कि कांच की स्लाइड्स पर मुद्रित किया जाता है के रूप में दिखाया गया है।। (बी) बहु अच्छी तरह से glycan सरणी पर एक glycan बाध्यकारी प्रोटीन Incubating एक 8 μl मात्रा है कि सरणी सतह पर एक छोटी बूंद बनाता है के साथ दिखाया गया है। (सी) सरणी और एक confocal फ्लोरोसेंट स्लाइड स्कैनर में स्कैनिंग पर glycan बंधनकारी प्रोटीन की ऊष्मायन के बाद, एक प्रतिनिधि छवि प्राप्त की है। (डी) छवि एक ग्रिड के साथ overlayed है और, उचित संरेखण के लिए ग्रिड मार्कर का उपयोग कर, एकल स्पॉट विश्लेषण किया जा सकता है। (ई) एक करीबी 8 सरणियों, का एक पूरा सेट के ऊपर जो एक एकल glycan बाध्यकारी प्रोटीन में1 dilutions: आठ 1 का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था। (एफ) एक कुएं में एक सरणी, का प्रतिनिधित्व करती है; सरणी शीर्ष सही (3 स्पॉट) और नीचे छोड़ दिया (2 स्पॉट) में ग्रिड मार्कर द्वारा demarked है, इस glycan बाध्यकारी प्रोटीन सरणी पर एक भी यौगिक बांधता के रूप में छह में से एक को दोहराने के लिए स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहा है। (G) ग्रिड विशिष्ट व्यक्ति के धब्बे को घेरने lassos के साथ दिखाया गया है। (एच) इमेजिंग सॉफ्टवेयर छवि फ़ाइल से संकेत मूल्यों की गणना करता है और एक टैब-सीमांकित डेटा फ़ाइल outputs। (मैं) के आंकड़ों स्प्रेडशीट या stastical सॉफ्टवेयर एक प्रतिनिधि उत्पादन ग्राफ बनाने के लिए सारणीबद्ध जा सकता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: संयंत्र lectins (ईसीए, एसएनए) और IAV हेमा के आउटपुटविभिन्न विशिष्टताओं के साथ gglutinins (से H5 ए / वियतनाम / 1203/04, एच 1 से ए / केंटकी / 07)। (ए) ईसीए विशेष टर्मिनल LacNAc या Galb1-4GlcNAc बांध और गैर-sialylated यौगिकों की उपस्थिति, नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल का पता लगाता है IAV hemagglutinins के लिए। (बी) एसएनए केवल एक टर्मिनल α2-6 सियालिक एसिड असर ग्लाइकान पहचानता है। (सी) H5N1 के पुनः संयोजक hemagglutinin (ए / वियतनाम / 1203/04) तनाव सियालिक एसिड α2-3 को बांधता है और एक एवियन प्रकार रिसेप्टर बंधन प्रोफ़ाइल प्रदान करता है। (डी) एक मानव मौसमी H1N1 के पुनः संयोजक hemagglutinin (ए / केंटकी / 07) मानव-प्रकार रिसेप्टर्स केवल को बांधता है। फ्लोरोसेंट संकेत तीव्रता प्रत्येक स्थान के लिए मापा गया था, और तीव्रता मतलब शून्य से मतलब पृष्ठभूमि स्प्रेडशीट प्रोग्राम का उपयोग कर की गणना की गई। प्रत्येक glycan के लिए, मतलब संकेत तीव्रता गणना की 6 से प्रतिकृति स्पॉट है। 6 प्रतिकृति के उच्चतम और निम्नतम संकेतों हटा रहे हैं और शेष 4 प्रतिकृतिटीईएस मतलब संकेत, मानक विचलन (एसडी) की गणना करने के लिए उपयोग किया जाता है, और मानक त्रुटि माप (SEM)। रेखांकन प्रत्येक नमूना और त्रुटि सलाखों के लिए औसत मतलब संकेत शून्य पृष्ठभूमि का प्रतिनिधित्व SEM मान रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

आकलन IAV रिसेप्टर विशिष्टता एवियन वायरस की महामारी क्षमता का विश्लेषण करने में एक महत्वपूर्ण कदम है। सियालिक एसिड मान्यता वायरस से इस तरह के बंधन और सेल से रिहाई के रूप में कई जैविक गुणों से जुड़ा हुआ है। जिनमें से ज्ञान एमिनो एसिड म्यूटेशन एवियन वायरस बाध्यकारी α2-6 को प्राप्त करने और पार प्रजातियों बाधा महामारी की तैयारियों के लिए सक्षम बनाता करने के लिए जरूरी हैं। कई assays रिसेप्टर विशिष्टता का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं; हालांकि, सभी उत्सुकता केवल मापने और न विशिष्टता और इसके विपरीत सहित उनके कमियां है।

यहाँ हम एक उपन्यास छोटी है जो अधिक जटिल ग्लाइकान की PAA से जुड़े टर्मिनल टुकड़े का उपयोग करता है व्यापक रूप से इस्तेमाल किया है और स्वीकार किए जाते हैं एलिसा, पर आधारित उपकरण का वर्णन है। 4 अच्छी तरह से परिभाषित lectins, संयंत्र के 2 और इन्फ्लूएंजा के 2 एक वायरस मूल का उपयोग करना, हम बताते हैं कि हम विशिष्टता और रिश्तेदार उत्सुकता बनाए रखें।

जब हम रसायनों और Biolog की कमी की राशि की गणनाएक glycan सरणी चिप पर एलिसा miniaturizing द्वारा इस्तेमाल के राजनैतिक, हम ऊँची बड़े मतभेद तक पहुँचने। सबसे पहले, बायोलॉजिकल; हम 10x कम परख मात्रा का उपयोग करें और 6 प्रतिकृति में 6 परीक्षण यौगिकों का उपयोग करें; इस 96 अच्छी तरह प्लेटें में 36x पंक्तियों के बराबर होने की गणना की जा सकती है। नतीजा यह है कि हम 360x कम बायोलॉजिकल इस्तेमाल होता है। महत्वपूर्ण कदम उचित मुद्रण और unpurified glycan बाध्यकारी एजेंट या गरीब का पता लगाने के एंटीबॉडी का उपयोग उच्च पृष्ठभूमि के जोखिम शामिल हैं।

, इस परख में इस्तेमाल यौगिकों हालांकि अभी भी उपलब्ध है, आसानी से केमो-enzymatic संश्लेषण द्वारा नहीं बने हैं। माइक्रोएरे मुद्रण प्रौद्योगिकी का उपयोग करना, हर जगह एक microtiter प्लेट की अच्छी तरह से प्रति 100 μl की तुलना में केवल 2 nl है। 48 कुओं और 6 यौगिकों, 6 प्रतिकृति में से युक्त एक एकल स्लाइड मुद्रण, हम लगभग 1,152 nl खपत करते हैं। में 96 अच्छी तरह प्लेटें परिणाम वही कोटिंग प्रक्रिया ही एकाग्रता में परिसर के 100 μl के साथ 1842 कुओं की कुल कोटिंग में। इसलिए, मुद्रण टीवह प्लेट परख की तुलना में यौगिक, हम 1,500x के हड़ताली कमी पाने की। इसलिए, कुल में, बायोलॉजिकल 360 गुना और glycan खपत 1,500 गुना से कम कर रहे हैं। रोबोट तरल संचालकों का उपयोग करना, हम कल्पना है कि सबसे अधिक कदम स्वचालित किया जा सकता है, की अनुमति पूरे परख एक उच्च throughput स्क्रीन के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा।

हालांकि मुद्रण प्रोटीन और बाद में छवि का विश्लेषण विशेष मशीनरी और उपकरणों की आवश्यकता होती है, इन उपकरणों दुर्लभ नहीं कर रहे हैं और कई विश्वविद्यालयों और संस्थानों में मौजूद हैं। मुद्रण प्रत्यक्ष है और रासायनिक परिवर्तन की आवश्यकता नहीं है। इसलिए, हमें विश्वास है कि, यौगिकों और सरल मुद्रण तकनीक के इस न्यूनतम राशि के साथ, इस परख अधिक आम तौर पर लागू हो सकता है। यह ऊष्मायन मात्रा कम कर देता है के रूप में, एंटीबॉडी और कीमती बायोलॉजिकल की लागत, इस तकनीक में यह संभव सीमित संसाधनों के साथ प्रयोगशालाओं IAV या उच्च निष्ठा के साथ अन्य glycan बंधनकारी प्रोटीन की विशिष्टता का आकलन करने के लिए कर देगा, जबकि कम लागत को बनाए रखनेएस।

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Acknowledgments

इस काम के स्क्रिप्स माइक्रोएरे कोर सुविधा, और रोग नियंत्रण केंद्र (जेसीपी) से एक अनुबंध द्वारा समर्थित किया गया था। RPdV वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए नीदरलैंड संगठन (NWO) से एक फ़ैसला और VENI अनुदान के एक प्राप्तकर्ता है। कंसोर्टियम कार्यात्मक Glycomics के लिए (http://www.functionalglycomics.org/) NIGMS अनुदान GM62116 (जेसीपी) द्वारा वित्त पोषित इस अध्ययन में इस्तेमाल कई ग्लाइकान प्रदान की है। इस स्क्रिप्स रिसर्च इंस्टीट्यूट से प्रकाशन 29113 है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NEXTERION® Slide H MPX-48  Schott 1091525 Microwell slides
ProScanArray Plus  PerkinElmer discontinued confocal microarray scanner
Innoscan 1100AL Scanner/Mapix Software Innopsys - confocal microarray scanner
MicroGrid II  Digilab - microaray printer
SNA Vector Labs B-1305  Plant Lectin
ECA Vector Labs B-1145  Plant Lectin
Anti-Strep Antibody IBA 2-1509-001  Anitbody for HA binding
Anti-Mouse Alexa-647 Life A-21235 Anitbody for HA binding
Tween-20 Sigma P2287  detergent
di-basic Sodium Phosphate Sigma 255793 printing buffer component
mono-basic Sodium phosphate Sigma 229903  printing buffer component
poly-l-lysine solution Sigma P8920  pre-spotting slide component
sodium hydroxide Sigma 221465 pre-spotting slide component
ethanol Sigma 493546 pre-spotting slide component
phosphate buffered saline Corning 46-013-CM incubation/washing buffer
SMP4B pins Telechem SMP4B printing pin
Compressed Nitrogen (Grade5) Praxair UN1066 general dusting/drying tool
Boric Acid Sigma B6768-500G Slide blocking reagent
ethanolamine Sigma E9508-500ML Slide blocking reagent
Atto 488 AttoTec AD 488-91 Gridmarker on array
PAA-LNLN Consortium for Functional Glycomics PA368 Spotted glycans
PAA-3SLNLN Consortium for Functional Glycomics PA362 Spotted glycans
PAA-6SLNLN Consortium for Functional Glycomics PA343 Spotted glycans
LNLN Consortium for Functional Glycomics Te98 Spotted glycans
3SLNLN Consortium for Functional Glycomics Te175 Spotted glycans
6SLNLN Consortium for Functional Glycomics Te176 Spotted glycans
384-well microtiter plate Matrix TechCorp 4361 Printing plate
VWR lab marker VWR 52877-150 Slide Numbering
Wheaton slide staining dish Sigma Z103969-1EA Blocking and Drying

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References

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उत्सुकता और इन्फ्लुएंजा एक वायरस Hemagglutinins की विशिष्टता का आकलन करने के लिए एक छोटी glycan माइक्रोएरे परख
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McBride, R., Paulson, J. C., de Vries, R. P. A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins. J. Vis. Exp. (111), e53847, doi:10.3791/53847 (2016).

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