Colheita seletiva de Marginating-pulmonar Leucócitos

Resumo

Os leucócitos pulmonares marginantes exibem características únicas e funções imunológicas distintas em comparação com outras populações de leucócitos. Aqui descrevemos a coleta seletiva dessa subpopulação de leucócitos pulmonares, por perfusão forçada dos pulmões em ratos e camundongos. Os leucócitos pulmonares marginais parecem críticos na determinação da suscetibilidade a doenças transmitidas pelo sangue e relacionadas ao pulmão.

Resumo

Os leucócitos pulmonares marginados (MP) são leucócitos que aderem ao endotélio interno dos capilares pulmonares. Os leucócitos MP demonstraram exibir composição e características únicas em comparação com os leucócitos de outros compartimentos imunológicos. As evidências sugerem maior citotoxicidade das células natural killer e um perfil pró e anti-inflamatório distinto da população de leucócitos MP em comparação com os imunócitos circulantes ou esplênicos. O método aqui apresentado permite a colheita seletiva de leucócitos MP por perfusão forçada dos pulmões em camundongos ou ratos. Em contraste com outros métodos usados para extrair leucócitos pulmonares, como trituração de tecidos e degradação biológica, esse método produz exclusivamente leucócitos dos capilares pulmonares, não contaminados com células parenquimatosas, intersticiais e bronco-alveolares. Além disso, a técnica de perfusão preserva melhor a integridade e o meio fisiológico dos leucócitos MP, sem induzir respostas fisiológicas devido ao processamento tecidual. Esta população única de leucócitos MP está estrategicamente localizada para identificar e reagir a células circulantes anormais, pois todas as células malignas circulantes e células infectadas são detidas ao passar pelos capilares pulmonares, interagindo fisicamente com células endoteliais e leucócitos residentes. Assim, a colheita seletiva de leucócitos MP e seu estudo sob várias condições podem avançar nossa compreensão de seu significado biológico e clínico, especificamente no que diz respeito ao controle de células aberrantes circulantes e doenças relacionadas ao pulmão.

Introdução

Os leucócitos aderentes para os capilares dos pulmões (isto é, marginating-pulmonar (MP) leucócitos) foram ¹ mostrado exibir composição distinta de leucócitos e a actividade única em comparação com os leucócitos a partir de outros compartimentos do sistema imunológico (por exemplo, circulação, do baço, da medula óssea) ^{2- 4.} Por exemplo, exposição de MP-leucócitos maior células assassinas naturais (NK) a citotoxicidade contra diversas células tumorais, em comparação com células circulantes e esplénicos NK, bem como os níveis de RNA mensageiro (mRNA) diferenciadas e aumento da secreção de citoquinas pró-inflamatórias e anti. A composição das células também é diferenciado a partir de leucócitos circulantes como MP-leucócitos têm uma proporção mais elevada de imunidade inata / adaptativa em comparação com os leucócitos circulantes (50% vs. 30%, respectivamente). O objectivo do método aqui apresentado é o de permitir a colheita selectiva de MP-leucócitos, a fim de estudar este compartimento imunológica importante e original (população de células), e a elucIdate o impacto das diversas manipulações (por exemplo, ativação imune) sobre essas células específicas.

Para compreender o significado deste população original, é importante notar que o sistema imune pode controlar células tumorais, micrometástases e de doença residual que circula através de funções in vivo de imunidade mediada por células (CMI). Esta capacidade é evidente, apesar da falha precedente do sistema imunitário para controlar o tumor primário, e suportado por um amplo evidências in vivo em doentes com cancro e em modelos animais ^5. Mais importante, estes resultados são muitas vezes inconsistentes com estudos in vitro e ex vivo, que reportam que a maioria das células tumorais autólogas são resistentes a citotoxicidade por leucócitos em amostras de sangue em circulação a partir de seres humanos e animais (medido por ensaios de citotoxicidade) ^6,7. Esta discrepância pode ser atribuída à existência in vivo, de populações de leucócitos distintas, tais como o supramencionado população de leucócitos MP e, especificamente, a sua subpopulação de células NK activadas ^3. Com efeito, as células singeneicas de tumor (MADB106), que se verificou ser resistente à circulante e leucócitos esplénicas, foram mostrados para serem lisadas por células NK-MP ^3,8. Assim, as células '' resistentes a NK-alegadamente MADB106 que metastizam para os pulmões de ratos fischer344 (F344) são controlados por células NK-MP, mas não por células NK circulantes ou esplénicas, que são vulgarmente estudada, dada a sua facilidade de acesso.

Purificada e activas MP-leucócitos são inacessíveis através dos métodos de colheita padrão de leucócitos a partir dos pulmões, os quais são baseados na moedura de tecido pulmonar ou degradação biológica ^9. A nossa abordagem tem duas vantagens principais em comparação com abordagens de processamento de tecidos. Em primeiro lugar, a abordagem de perfusão colhe seletivamente MP-leucócitos, separando-os de outras células que se originam a partir do parênquima pulmonar, intersticial e compar bronco-alveolartimentos. Em segundo lugar, a técnica de perfusão melhor preserva a integridade e o meio fisiológico de MP-leucócitos, ao contrário da moagem e processamento biológico abordagens que danificam as células, alteram a sua morfologia, e induzem a produção e libertação de vários factores que modulam a actividade imunológica e especificamente suprimem NK citotoxicidade ^10.

Os pulmões são um dos principais alvos de metástase do câncer e para várias doenças infecciosas. Todas as células malignas circulantes e células infectadas passar através dos capilares pulmonares, onde eles precisam deformar e interagir com as células endoteliais capilares e leucócitos residentes. Sob estas condições, as células circulantes podem ser facilmente alvo de MP-leucócitos residentes. Parece, portanto, biologicamente vantajoso ter leucócitos activados neste compartimento imune, e é importante para estudar esta MP-população única em diferentes configurações biológicos, experimentais, e clínicos. É digno de nota que syactivação stemic imune por vários-resposta-modificadores biológicos (por exemplo, ácido polyinosinic-polycytidylic (poli I: C) ou oligodesoxinucleótidos tipo-C CpG (CpG-C ODN)) ter mostrado activar MP-leucócitos mais de leucócitos circulantes ^{3, 8,11.}

Protocolo

Procedimentos envolvendo indivíduos animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal (IACUC) da Universidade de Tel-Aviv.

1. Protocolo Rat

1. preparativos
   1. Organizar 2 borboleta 21 agulhas G. Opcionalmente, prepare 2 borboleta 21 g agulhas gumes contundentes mediante a apresentação da borda afiada da agulha.
   2. Esterilizar instrumentos cirúrgicos: 2 pares de tesouras, fórceps embotados-gumes, hemostática, fórceps dente-de tecidos esterilizadas por autoclave a 121 ° C durante pelo menos 30 min no ambiente gravidade (seco).
   3. Prepare heparinizado PBS (30 unidades / ml) por adição de 30 unidades de heparina por ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS 1x). Use a RT. 35 ml é o volume mínimo necessário por animal.
   4. Transmitir heparinizado PBS para as linhas de bomba peristáltica e as agulhas borboleta para evitar bolhas de ar.
2. Perfusão dos Pulmões e recolha de MP-leucócitos
   1. Eutanásia do animal por uma overdose de 8% de isoflurano. Confirmar eutanásia por cessação de monitorização de respiração.
   2. Após interrupção da respiração, abra imediatamente as cavidades peritoneal e no peito, usando a tesoura estéreis e pinças dente de tecidos. Realizar uma incisão abdominal na linha média ao longo do abdómen até o processo xifóide.
   3. Levante o esterno usando a pinça, cuidadosamente cortar a caixa torácica em ambos os lados, sem perfurar qualquer órgão interno ou grandes vasos sanguíneos. Fixe uma pinça hemostática sobre o esterno, e rostralmente dobrar a caixa torácica para expor o complexo cardiopulmonar.
   4. Inserir uma agulha de borboleta dentro do ventrículo direito do coração, e no prazo de, aproximadamente, um minuto recolher o volume máximo de sangue para uma seringa (~ 6 ml a partir de 250 g de origem animal).
   5. Prender a veia cava com uma pinça hemostática para evitar trás perfusão do fígado (ver discussão).
   6. Segure a agulha borboleta dentro do ventrículo direito ao substituir a seringa contendo o sangue com o tubo de saída do pbomba eristaltic.
   7. Inserir uma segunda agulha borboleta ligada a uma seringa de 5 mL de colheita para o ventrículo esquerdo, evitando a penetração do septo interventricular.
   8. Ligar a bomba peristáltica a uma velocidade de cerca de 5 ml / min e recolhem suavemente para dentro da seringa os primeiros ml de perfusato que estão contaminados com sangue. Continue até que a cor perfusato muda de escuro para vermelho pálido. (Descartar o perfuste contaminados com sangue).
   9. Sem abandono da bomba peristáltica, rapidamente substituir a seringa de 5 mL com uma seringa de colheita de 20 ml de colheita e recolher 20 ml de perfusato pulmão empregando uma velocidade mais elevada de perfusão (até 7 ml / min). monitorizar continuamente o fluxo de perfundido para a seringa de recolha, evitando ao mesmo tempo a formação de vácuo.
   10. Cessar o fluxo da bomba peristáltica.
3. leucócitos Extração
   1. Centrifuga-se o perfusado durante 10 min a 400 x g.
   2. Aspirar o fluido.
   3. Adicionar 10 ml de PBS ou meio, centrifugar a 400 xg durante 10 min, e aspirar o fluido. Repita esta etapa duas vezes. O uso de PBS ou meio depende da consequente utilização da amostra.
   4. Adicionar 20 ml de PBS ou meio, centrifugar a 400 xg durante 10 min, e aspirar o fluido.
   5. Reconstituir as células na concentração desejada, com base na utilização da amostra (FACS, PCR, etc.).

2. Rato Protocolo

1. preparativos
   1. Organizar 2 borboleta 25 agulhas G. Opcionalmente, prepare 2 borboleta 25 g agulhas gumes contundentes mediante a apresentação da borda afiada da agulha.
   2. Esterilizar instrumentos cirúrgicos: 2 pares de tesouras, fórceps embotados-gumes, hemostática, fórceps dente-de tecidos esterilizadas por autoclave a 121 ° C durante pelo menos 30 min no ambiente gravidade (seco).
   3. Prepare heparinizado PBS (30 unidades / ml) por adição de 30 unidades de heparina por ml de solução de PBS 1x. Use a RT. 25 ml é o volume mínimo necessário por animal.
   4. streestou heparinizado PBS para as linhas de bomba peristáltica e as agulhas borboleta para evitar bolhas de ar.
2. Perfusão dos Pulmões e recolha de MP-leucócitos
   1. Eutanásia do animal por uma overdose de 8% de isoflurano. Confirmar eutanásia por cessação de monitorização de respiração.
   2. Após interrupção da respiração, abra imediatamente as cavidades peritoneal e no peito, usando a tesoura estéreis e pinças dente de tecidos. Realizar uma incisão abdominal na linha média ao longo do abdómen até o processo xifóide.
   3. Levante o esterno usando a pinça, cuidadosamente cortar a caixa torácica em ambos os lados, sem perfurar qualquer órgão interno ou grandes vasos sanguíneos. Fixe uma pinça hemostática sobre o esterno, e rostralmente dobrar a caixa torácica para expor o complexo cardiopulmonar.
   4. Prender a veia cava com uma pinça hemostática para evitar trás perfusão do fígado (ver discussão).
   5. Inserir uma agulha borboleta ligado ao tubo de saída da bomba peristáltica para a direita ventricle do coração, e uma segunda agulha borboleta ligada a uma seringa de 2 ml de colheita para o ventrículo esquerdo do coração, avoidingpenetration do septo interventricular.
   6. Ligue a bomba a uma velocidade de aproximadamente 2 ml / min e recolher os primeiros ml de perfusato contaminados com sangue na seringa a colheita até que o perfusato muda de escuro para vermelho pálido (Descartar o perfuste contaminados com sangue).
   7. Sem abandono da bomba peristáltica, rapidamente substituir a 2 ml de seringa de colheita com uma seringa de 10 ml de colheita e recolher 10 ml de perfusato pulmão empregando uma velocidade mais elevada de perfusão (até 4 ml / min). monitorizar continuamente o fluxo de perfundido para a seringa de recolha, evitando ao mesmo tempo a formação de vácuo.
   8. Cessar o fluxo da bomba peristáltica.
3. leucócitos Extração
   1. Centrifuga-se o perfusado durante 10 min a 400 x g.
   2. Aspirar o fluido.
   3. Adicionar 10 ml de PBS ou meio, centrifugar a 400xg durante 10 min, e aspirar o fluido. Repita este passo três vezes. O uso de PBS ou meio depende da consequente utilização da amostra.
   4. Adicionar 10 ml de PBS ou meio, centrifugar a 400 xg durante 10 min, e aspirar o fluido.
   5. Reconstituir as células na concentração desejada, com base na utilização da amostra (FACS, PCR, etc.).

Resultados

A exposição MP-compartimento uma composição de leucócitos subconjunto diferente em comparação com leucócitos circulantes. Usando a análise de citometria de fluxo, as subpopulações de leucócitos foram identificados e quantificados para caracterizar a composição de ambas as circulante e leucócitos MP. Granulócitos e linfócitos foram identificados com base na frente eo lado espalha. Dentro dos linfócitos, NKRP-1 células ^vivas foram identificadas como células NK, CD3 ⁺ ...

Discussão

O método aqui apresentado permite a colheita selectiva e estudo da população única de MP-leucócitos. Em comparação com circulante ou leucócitos esplénicas, a população MP é caracterizada por uma composição distinta de subpopulações de leucócitos, níveis de activação mais elevadas, maior libertação de várias citocinas, e mais elevados os níveis de mRNA de citocinas pró- e anti-inflamatórios ^2,3. Especificamente, mostraram que as células NK-MP são mais citotóxicos do que as células circulatórias NK contra vária...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
			peristáltica Autoclud
Agulha borboleta	OMG		26G
Agulha borboleta	OMG		21G * 3/4 "
Solução		seringa	1 ml
seringa	Pic		2,5 ml
Solução de seringa	Pic 5		ml
Seringa	Solução Pic	10 ml

Bomba de Pic Solução de Seringa Solução Pic 25 ml Pinça de borda romba Tesoura hemostático Pinça de tecido Heparina sódica mucosa suína (sem conservativos)Sigma Aldrich