Artigo de método

Olhando para Cérebro polissomos com Microscopia de Força Atômica

DOI:

10.3791/53851

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16 de março de 2016

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1Laboratory of Biomolecular Sequence and Structure Analysis for Health, Fondazione Bruno Kessler, 2Institute of Biophysics, CNR Unit at Trento

Neste artigo

Resumo

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Embora a estrutura do ribossomo tenha sido extensivamente caracterizada, a organização dos polissomos ainda é pouco estudada. Para superar essa falta de conhecimento, apresentamos aqui um protocolo de preparação detalhado para imagens precisas de polissomos de mamíferos por microscopia de força atômica (AFM) em ar e líquido.

Resumo

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A maquinaria de tradução, ou seja, o polysome ou polyribosome, é uma das maiores e mais complexas máquinas citoplasmáticos nas células. Polissomos, formadas por ribossomas, mRNAs, várias proteínas e RNAs não-codificantes, representam plataformas onde os controles de translação ocorrem integrado. No entanto, enquanto o ribossomo tem sido amplamente estudada, a organização do polissomos carece ainda de compreensão abrangente. Assim, muito esforço é necessário, a fim de elucidar a organização polissoma e qualquer novo mecanismo de controlo de tradução que pode ser incorporado. microscopia de força atômica (AFM) é um tipo de microscopia de varredura por sonda que permite a aquisição de imagens 3D em resolução nanoescala. Em comparação com técnicas de microscopia electrónica (ME), uma das principais vantagens da AFM é que ele pode adquirir milhares de imagens, tanto no ar e em solução, permitindo que a amostra a ser mantida sob condições fisiológicas próximo, sem qualquer necessidade de coloração e fixação próprocedimentos. Aqui, um protocolo detalhado para a purificação precisa da polissomos de cérebro do rato e sua deposição em substratos de mica é descrito. Este protocolo permite a imagiologia polissoma no ar e líquido com a AFM e a sua reconstrução de objectos tridimensionais. Complementar ao microscópio crio-elétron (crio-EM), o método proposto pode ser convenientemente utilizado para analisar sistematicamente polissomos e estudar sua organização.

Introdução

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A síntese de proteínas é o processo que consome mais energia nas células 1,2. Por isso, não surpreende que a abundância de proteína são controladas principalmente para a translação em vez de 3,4,5 nível da transcrição. O polissoma é o componente macromolecular fundamental que converte a informação em leituras de ARNm proteicos funcionais. Os polissomas são até agora reconhecida como complexos macromoleculares, onde vários controlos traducionais convergem 6-13. Apesar das centenas de estudos sobre a estrutura do ribossoma 14- 16, os insights moleculares detalhados sobre a dinâmica da tradução e da topologia da polissomos encontrou um interesse limitado. Como consequência, a organização do complexo polissomal ribonucleoprote�a nativa e seu efeito potencial sobre a tradução ainda são questões bastante obscura. Polissomos pode esconder organizações ordenadas e funcionais ainda desconhecidos, potencialmente um reflexo do que nucleossomos e contro epigenéticals ter representado para o campo de transcrição. Na verdade, a investigação desta hipótese intrigante requer estudos adicionais e novas abordagens técnicas. Nesta linha, as técnicas estruturais e de microscopia de força atômica pode proveitosamente colaboram para desvendar novos mecanismos para controlar a expressão do gene, à semelhança do que foi conseguido para a nucleossomo 17,18.

Desde a descoberta do ribossoma 14-16, a sua estrutura foi extensivamente caracterizado em procariotas, levedura 19,20 21 e, mais recentemente, em 22 humana, proporcionando a descrição molecular dos mecanismos na base da síntese de proteínas. Polissomas foram reconhecidos inicialmente na membrana do retículo endoplasmático, formando organizações geométricas 2D típicos 14. Como mencionado antes, polissoma montagem não tenha sido o objecto de interesse constante à medida que a estrutura do ribossoma. No passado, têm sido estudados polissomas essencialmente por trtécnicas ansmission EM-base. Só recentemente, técnicas de crio-EM permitiu a reconstrução 3D do polissomos purificados a partir in vitro sistemas de tradução 23-26, lisados ​​celulares humanos 27 ou em células 28. Estas técnicas ofereceu informações mais refinado sobre a organização ribossomo-ribossomo em polissomos 23, 26-28 e uma descrição molecular preliminar das superfícies de contato dos ribossomas adjacentes em polissomos gérmen de trigo 24. Assim, a tomografia crio-EM permite a divulgação de interações ribossomas-ribossomo com detalhes molecular, mas é sobrecarregado por extensa pós-processamento e análise de reconstrução que exigem recursos computacionais pesadas para a manipulação de dados. Além disso, para obter os detalhes moleculares das interacções ribossoma ao ribossoma, um mapa altamente resolvidas do ribossoma é necessário, e este tipo de ribossoma de referência está disponível apenas para algumas espécies. É importante ressaltar que a tomografia crio-EM não é capaz de detectar RNA livre. Therefminério, novas técnicas são necessárias para compreender plenamente a organização da maquinaria de tradução.

Ao lado de crio-EM, AFM foi também empregado como uma ferramenta útil para a imagem latente direta de polissomos em eucariotos inferiores 29-33 e humanos 27. Em comparação com EM, AFM não requer a fixação da amostra ou rotulagem. Além disso, as medições podem ser efectuadas em condições fisiológicas próximo e com a possibilidade única de identificar claramente ambos os ribossomas e cadeias de ARN nus 27. Imagiologia de polissomos individuais podem ser realizadas de forma relativamente rápida, a obtenção de milhares de imagens em nano-resolução com pouco esforço pós-processamento em comparação com a extensa e pesada de pós-processamento e análises de reconstrução exigida por microscopia crio-EM. Consequentemente, AFM manipulação e análise de dados não precisa de estações de trabalho caras e poder de computação de alta. Como tal, esta técnica recolhe informação sobre formas polissomal, características morfológicas (tais comoaltura, comprimento e largura), densidades de ribossomas, a presença de RNA livre eo número de ribossomas por polysome 27 com um caudal superior a crio-EM. Em tal forma, AFM representa uma abordagem poderosa e complementar às técnicas de EM para retratar polissomos 27.

Aqui nós apresentamos um gasoduto completa de purificação para análise de dados, onde AFM é aplicado à imagem e analisar polissomos cérebro do rato. O protocolo proposto concentra-se em problemas de purificação e na deposição precisa de polissomas em substratos de mica que são usados ​​para imagiologia AFM. Além da análise convencional de partícula que pode ser facilmente realizada com o software comum utilizado pela comunidade AFM, um plug-in ImageJ 34, chamado RiboPick, é apresentado para a contagem do número de ribossomas por polissoma 27, 35.

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Protocolo

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As práticas utilizadas para obter os tecidos de camundongos foram aprovadas pelo corpo para a Protecção dos Animais (OPBA) da Universidade de Trento (Itália), o Protocolo n. 04-2015, o Decreto conforme art.31 Legislativo n. 26/2014. Todos os ratos foram mantidos no Centro Organismo Modelo do Centro de Biologia Integrativa (CIBIO), da Universidade de Trento, Itália.

Cuidado: Para evitar qualquer degradação RNA das amostras, preparar todos os buffers que utilizam água tratada com DEPC para minimizar a contaminação RNase.

1. Preparação de polissomas a partir de cérebros inteiros

  1. Reunindo tecidos cerebrais (15 min)
    1. Eutanásia de tipo selvagem estirpe de murganho C57BL / 6 com asfixia com CO2 durante 5 min 36. Cuidadosamente dissecar o cérebro para fora a partir do crânio 36, colocar o tecido em um tubo de 1,5 ml e colocá-lo imediatamente em azoto líquido. Armazenar a -80 ° C até à sua utilização.
  2. Preparação de lisado (30 min)
    1. Pulverizar todo o tecido cerebral usandoum almofariz e pilão em azoto líquido.
    2. Transferir cerca de 25 mg de pó para um tubo de microcentrífuga e imediatamente a frio (para evitar o descongelamento do tecido pulverizado) adicionar 0,8 ml de tampão de lise (ver Tabela 1) e interromper a célula por pipetagem para cima e para baixo 25 vezes rapidamente.
    3. Centrifuga-se o tubo a 12.000 xg durante 1 min a 4 ° C para sedimentar os detritos celulares.
    4. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrifugação e manter o tubo em gelo durante 15 min.
    5. Centrifuga-se o tubo a 12.000 xg durante 5 min a 4 ° C para sedimentar os núcleos e as mitocôndrias.
    6. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrifugação.
    7. Armazenar o sobrenadante a -80 ° C durante um máximo de 6 meses ou utilizá-lo imediatamente.
  3. preparação em gradiente de sacarose e centrifugação (2 horas e 30 min)
    1. Lavagem de ultracentrífuga tubos extensivamente com RNase água (dietilpirocarbonato água tratada (DEPC-água) ou comercial) umd 3% de H 2 O 2 / DEPC H2O solução.
    2. Colocar os tubos em gelo e adiciona-se 5,5 ml de solução fria de 50% de sacarose na parte inferior de cada tubo (ver Tabela 1 para as soluções de sacarose). Adiciona-se cuidadosamente a 15% gota a gota uma solução de sacarose, permanecendo perto da interfase, a fim de preservar uma interfase afiado, até que o tubo está completamente cheia. Quando o tubo está completamente cheia, a fechar com uma tampa de borracha para evitar a formação de bolhas de ar.
    3. Em uma sala fria suavemente fixar os tubos na horizontal e mantê-lo nessa posição durante 2 horas. Após este tempo, os tubos de endireitar-se lentamente de volta para a posição vertical e colocá-los em gelo. Os gradientes está agora pronto para ser usado. Em alternativa, preparar o gradiente de sacarose de 15-50%, utilizando um gradiente convencional ex.
    4. Em um quarto frio remover cuidadosamente 1,0 ml a partir do topo do gradiente e sobrepor a gota sacarose a gota, com o lisado citosólica (isto é, o sobrenadante obtido no step 1,2).
    5. Cuidadosamente abaixe as para dentro dos baldes de rotor basculante. Centrifugar os gradientes de 100 min a 180000 xg, a 4 ° C usando uma ultracentrífuga.
    6. Depois da centrifugação, os tubos em deixar os baldes durante 20 min a 4 ° C para permitir que os gradientes de estabilizar.
  4. fraccionamento em gradiente de sacarose (2 h)
    1. Remova cuidadosamente um tubo de ultracentrífuga do rotor de ultracentrífuga e montá-la no dispositivo coletor de um gradiente de densidade Fracionamento do sistema. Recolher fracções de 1 ml monitorizando a absorvância a 260 nm com um detector de UV / VIS (Ver Figura 1 Painel superior). Mantenha as fracções recolhidas em gelo.
    2. Preparar alíquotas de 30-40 uL das fracções de interesse, mantê-los em gelo antes de as armazenar a -80 ° C até utilização. Não use alíquotas ou fracções de sacarose que foram submetidos a mais de dois ciclos de congelamento-descongelamento (ver Figura 1 painel inferior).

2. Preparação de Amostras para Microscopia de Força Atômica (3 horas)

  1. Usando a fita, retire as folhas de mica.
  2. Lave as folhas de mica 3-4 vezes com DEPC-água e colocá-lo em uma pequena placa de Petri. Em seguida, seque a superfície com o ar.
  3. Cobrir a mica com 200 ul de 1 mM de 4 Niso e incubar durante 3 min a RT.
  4. Remover a solução de níquel e, em seguida, seca-se a superfície utilizando ar. Realizar todos os passos futuros, a 4 ° C através da colocação da placa de Petri com a mica em gelo.
  5. Descongelar uma aliquota obtida em 1.4.2 em gelo e cuidadosamente adicionar toda a amostra gota a gota na mica. Utilizando uma ponta de pi 100-200, espalhar a amostra em toda a superfície da mica. Incubar a amostra em gelo durante 3 min.
  6. Cobrir a gota folha de mica a gota com 200 ul de Tampão de frio-AFM (ver Tabela 1) e incubar durante 1 hora em gelo.
  7. Imaging no líquido
    1. Retire cuidadosamente o tampão de-AFM e lavar as folhas de mica 3-4 vezs com 200 ul fria Tampão-AFM para remover o excesso de sacarose. Em seguida, lavar as folhas de mica 3 vezes com solução de lavagem frio (ver Tabela 1), deixando a superfície mica coberta por alguns microlitros de solução.
    2. Ir ao ponto 3 (aquisição de imagem).
  8. Imaging no ar
    1. Cuidadosamente remover o tampão e lava-se a AFM mica 3-4 vezes com 200 ul de Tampão de frio-AFM para remover o excesso de sacarose. Em seguida, lava-se a mica 3 vezes com solução de lavagem frio (ver Tabela 1) e drenar o excesso de água, utilizando papel.
    2. Deixar a secagem da amostra sob o capô química com a parte superior da placa de Petri parcialmente aberta. Após 2 horas, feche a placa de Petri e armazenar a RT. Medir a amostra depois de 2-3 horas, à medida que eles são estáveis ​​durante anos.

3. Aquisição de Imagem (15 min por imagem após estabilização térmica)

Nota: polissomos imobilizadas em mica podem ser visualizados no ar ou no estado líquido, usando o modo AC.

  1. Fixe a mica ao titular da amostra usando fita dupla face.
  2. Insira o suporte da amostra na fase AFM seguindo as instruções do fabricante. Quando imagiologia no estado líquido, se possível, para tentar manter a amostra a uma temperatura inferior a 25 ° C para aumentar a estabilidade no tempo polissoma.
  3. Selecione um cantilever adequado para imagiologia AC e montá-la no suporte a ponta seguindo as instruções do fabricante. Aqui, o uso de consolas com força constante entre 2-20 N / m para a imagem latente do ar e cerca de 0,1 N / m para a imagem latente líquida.
  4. Ajustar o ponto de laser sobre o braço de suporte e zero os sinais de detector de quadrante.
  5. Selecione uma frequência de condução oportuno e conduzir o cantilever com uma amplitude de 10-20 nm.
  6. Aproxime-se da amostra até a ponta engata na superfície.
  7. Selecione uma área de digitalização de mm 2x2, adquirir pelo menos 512x512 pixel imagens (pixels de largura <4 nm), seleccionar um modo de subtração de fundo ao vivo e uma escala Z de 20-25 nm.
  8. Inspecione tele imagem procurando a presença de objectos redondos, caracterizado por a altura entre 10 e 15 nm, quando a aquisição de ar e 25 e 30 nm, quando no estado líquido e a largura na gama de 25-30 nm. Ajustar os parâmetros de referência e de opinião até objetos pontiagudos são visualizados. O fundo deve aparecer relativamente plana em boas amostras, com alguns objetos de altura 2-4 nm (ver Figura 2A e B).
  9. Se a imagem parece ser bom (como indicado no ponto 3.8), adquirir vários (pelo menos dez) scans 2x2 mícron em diferentes áreas de amostra.
  10. (opcional). Se necessário, adquirir imagens de alta resolução de polissomos selecionadas (veja a Figura 2C).
  11. Aplicar correções de software (subtração de avião e linha por linha de algoritmos de correção) para corrigir as imagens de AFM remoção de inclinação arbitrário e efeitos à deriva.

4. Análise de Dados (30 min por imagem)

  1. Exportar imagens em ImageJ (opcional: aplicar um fator de escala) preferentei ra me usando um formato de compressão sem perdas, por exemplo, o formato TIFF (ver Figura 3A).
  2. Use a macro RiboPick.ijm conjunto de ferramentas ImageJ (a ser copiado no ImageJ macro / conjunto de ferramentas subdiretório) para contar ribossomos em polissomos (ver Figura 3B) e calcular propriedades estatísticas da amostra (ver Figura 3C).
    1. Começar a carregar uma imagem usando o ferramenta que inicializa o programa.
    2. Escolha os centros de ribossomas com o padrão ImageJ ferramenta (Shift + clique esquerdo permite que o multi-seleção de ribossomas). Marque os ribossomos selecionados com o ferramenta. coordenadas ribossomas aparecerá em uma janela de texto personalizado.
    3. Adicionar mais ribossomos ao mesmo polysome repetindo o procedimento indicado no ponto 4.2.2.
    4. Remover ribossomos erroneamente marcados usando o ferramenta (começa a remover a partir do último ribossomo adicionado ao primeiro212; na polysome atual).
    5. Quando o polysome for concluída, use o ferramenta. Como o número polysome é adicionado como uma sobreposição à imagem, a janela de texto é atualizado.
    6. Use o para escrever o ribossomo coordena uma imagem PNG que resume ribossomas e polissomos o escolhido arquivo (as unidades padrão da imagem são usados) e. A imagem original é fechado sem ser salvo.

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Resultados

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Sacarose profiling gradiente polissomal de cérebro inteiro de rato

É possível purificar polissomas a partir de um ligado celular por perfis polissomal, que separa as macromoléculas de acordo com o seu peso e tamanho. Com perfis polissomal, lisados ​​citoplasmáticos obtidos a partir de células ou tecidos em cultura, tal como neste exemplo, são carregados sobre um gradiente de sacarose linear e processadas por u...

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Discussão

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Como a estrutura do DNA foi provado ser de suma importância para descrever o processo de transcrição e como a organização da cromatina avançado nossa compreensão do controle transcricional da expressão do gene, é essencial analisar a organização e estrutura do polissomos para melhorar a compreensão verdadeiras da tradução e da sua regulação.

Com o protocolo descrito, uma densidade óptima de polissomas suavemente imobilizados sobre uma superfície plana, adequados para imagiologia de AFM é obt...

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Divulgações

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Os autores não têm interesses financeiros concorrentes neste artigo e nada a divulgar.

Agradecimentos

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Esta pesquisa foi apoiada pelo projeto de pesquisa AXonomIX financiado pela Provincia Autonoma di Trento, Itália.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
CicloheximidaSigma01810Preparação do lisado
DNAseIThermo Scientific89836Preparação do lisado
RiboLock RNAse InhibitorLife technologiesEO-0381Preparação do lisado
DEPCSigma40718Preparação do lisado
Triton X100SigmaT8532Preparação de lisado
DTTSigma43815Preparação de lisado
Desoxicolato de SódioSigmaD6750Preparação de
microcentrífuga de lisado Eppendorf5417RPreparação de lisado
de sacaroseSigmaS5016Preparação de gradiente de sacarose
UltracentrífugaBeckman CoulterOptima LE-80KCentrifugação de gradiente de sacarose
Ultracentrífuga RotorBeckman CoulterSW 41 TiCentrifugação de gradiente de sacarose
Tubo de polialômeroBeckman Coulter331372Centrifugação com gradiente de sacarose
Sistema de Fracionamento de Gradiente de Densidade Teledyne Isco67-9000-176Fracionamento de gradiente de sacarose
AFMAsylumResearch CypherPolysome visualização

Referências

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