Um regulamento ajuste fino da transcrição do gene subjacente a decisão destino da célula embrionária. Aqui, descrevemos ensaios de imunoprecipitação de cromatina utilizados para investigar regulação epigenética de ambos diferenciação cardíaca de células estaminais e desenvolvimento cardíaco de embriões de camundongos.
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Artigo de método
Regulação epigenética da Cardiac diferenciação de células estaminais embrionárias e Tecidos
Neste artigo
Resumo
Resumo
a transcrição do gene específico é um processo biológico fundamental que está subjacente a decisão destino celular durante o desenvolvimento embrionário. O processo biológico é mediada por factores de transcrição que se ligam a regiões reguladoras genómicas incluindo intensificadores e promotores de genes constitutivos cardíacas. ADN é envolvido em torno histonas que são sujeitas a modificações químicas. Modificações das histonas ainda levar a transcrição de genes reprimida, activado ou equilibrado, trazendo assim mais um nível de regulamentação sintonia fina da transcrição de genes. As células-tronco embrionárias (células ES) recapitular dentro de corpos embrióides (ou seja, agregados celulares) ou em cultura 2D os primeiros passos de desenvolvimento cardíaco. Eles fornecem material suficiente em princípio para imunoprecipitação da cromatina (ChIP), uma tecnologia amplamente utilizada para identificar regiões reguladoras de genes. Além disso, as células embrionárias humanas representam um modelo celular humano de cardiogenesis. Em fases posteriores do desenvolvimento, rato tecidos embrionários permitirinvestigando paisagens epigenéticas específicas necessárias para a determinação da identidade da célula. Descrevemos os protocolos de Chip, ChIP sequencial seguido por PCR ou chip-sequenciação usando células ES, corpos embrióides e regiões embrionárias específicas cardíacas. Estes protocolos permitem a investigar a regulação epigenética da transcrição de genes cardíaca.
Introdução
O coração é o primeiro órgão a ser formada e para se tornar funcional no embrião. O coração é construído a partir de muitas linhagens de células que surgem a partir dos primeiro e segundo campos cardíaco embrionário 1. A partir do blastocisto pós-fertilização organizar-se para o coração em forma, as células embrionárias têm, assim que tomar muitas decisões destino celular. Gene transcrição é regulada de forma tempo e dependente do espaço e é um processo biológico fundamental que está subjacente a decisão destino celular durante o desenvolvimento embrionário. Um tal processo é mediada por factores de transcrição específicos que se ligam a regiões regu....
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Protocolo
1. ADN-proteína de reticulação
- Fixam em 15 ml tubos de células-ES colhidas (2 x 10 6 células para Chip regulares, 2 x 10 5 células para Microchip), corpos embrióides (EBS) gerados a partir de células-tronco embrionárias e tecidos cardíacos embrionárias dissecados de embriões de rato E9.5 (atrioventricular canal, via de saída e ventrículo), utilizando 1% de formaldeído em PBS para as células ou em tampão PB2 permeabilização de tecidos embrionários. Colocar os tubos num agitador orbital a uma velocidade de 60 rpm à temperatura ambiente durante exactamente 10 min.
- Parar a reacção de reticulação por adição de glicina para uma co....
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Resultados
A Figura 1A ilustra a preparação em primeiro lugar de grânulos de ligação de ADN e de controlo de qualidade utilizando ADN de tamanhos diferentes (escada de 1 kb). 0ne, 2 e 2,5 volumes (1 a 3) de grânulos foi adicionada a um volume de amostra a purificar fragmentos de DNA de alto e baixo peso molecular.
As Figuras 1 B, C, D são exemplos típicos de géis de DNA a partir de DNA sonicado todo extr.......
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Discussão
Epigenética tornou-se um importante campo de pesquisa em biologia do desenvolvimento. Como um programa genético é activada em células embrionárias para permitir que as células a adquirir uma identidade específica dentro de uma linhagem embrionário tem sido por muito tempo uma questão essencial para biólogos do desenvolvimento.
Chip tem sido amplamente utilizada nos últimos anos e combinados para sequenciamento de DNA seguinte melhoria na resolução de sequenciamento. Isto tornou-se uma técnic.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Os autores agradecem às agências de financiamento, ao programa comunitário europeu IMI StemBANCC, à Fundação leducq (SHAPEHEART) e à Agence Nationale de la Recherche (Genopath)
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Formaldeído | Fixação de Célula | Sigma | F8775 |
| Glycine | Sigma | G8898 | Parada de reticulação |
| Aprotinin | Fluka | 10820 | Inibidor de proteases |
| Hemissulfato de leupeptina | Sigma | L2882 | Inibidor de proteases |
| PMSF | Sigma | P7626 | Inibidor de proteases |
| Proteína A contas magnéticas | Life technologies | 10001D | Imunoprecipitação |
| SPRI contas magnéticas | Thermo Scientific | 15002-01 | Purificação de DNA |
| Proteinase K | Life technologies | 25530-015 | Digestão de proteínas |
| Padrão DNA BR | Life technologies | Q32850 | Faixa de calibração |
| Sondas Moleculares | Syber green | S-11484 | Quantificação de DNA |
| TE tampão | Invitrogen | P7589 | Quantificação de DNA |
| PBX 1x | Life technologies | 14190-094 | Lavagem |
| DNase Água livre de RNase | Life technologies | 10977-035 | Diluição |
| Tubo Axygen | Axygen | MCT-175-C | ChIP purificção |
| Anticorpo < / strong> | Company< / strong> | Reference< / strong> | ChIP concentration |
| H3K27ac | Abcam | ab4729 | 3 µ g para ESC e EBs, 1 µ g para tecidos |
| H3K4me1 | Diagenode | C15410194 (pAb-194-050) | 3 µ g para ESC e EBs, 1 µ g para tecidos |
| H3K36me3 | Diagenode | C15410058 (pAb-058-050) | 3 µ g para ESC e EBs, 1 µ g para tecidos |
| H3K9me2 | Diagenode | C15410060 (pAb-060-050) | 3 µ g para ESC e EBs, 1 µ g para tecidos |
| H3K4me3 | Diagenode | C15410030 (pAb-030-050) | 3 µ g para ESC e EBs, 1 µ g para tecidos |
| H3K27me3 | Diagenode | C15410069 (pAb-069-050) | 3 µ g para ESC e EBs, 1 µ g para lenços de papel |
Referências
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6, 826-835 (2005).
- Chen, T., Dent, S. Y. Chromatin modifiers and remodellers: regulators of cellular differentiation. Nat Rev Genet.
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Reimpressões e permissões
