Isolamento e caracterização de células individuais de embriões Zebrafish

Leigh Ann Samsa; Nicole Fleming; Scott Magness; Li Qian; Jiandong Liu

doi:10.3791/53877

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Artigo de método

Isolamento e caracterização de células individuais de embriões Zebrafish

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DOI:

10.3791/53877

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12 de março de 2016

Leigh Ann Samsa¹^,² , Nicole Fleming²^,³ , Scott Magness¹ , Li Qian²^,³ , Jiandong Liu²^,³

¹Department of Cell Biology and Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill, ²McAllister Heart Institute, University of North Carolina at Chapel Hill, ³Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina at Chapel Hill

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve um método para isolar células únicas de embriões de peixe-zebra, enriquecendo para células de interesse, capturando células de peixe-zebra em sistemas multiplex de célula única baseados em microfluídica e avaliando a expressão gênica de células únicas.

Resumo

O peixe-zebra (Danio rerio) é um poderoso organismo modelo para estudar o desenvolvimento dos vertebrados. Embora muitos aspectos do desenvolvimento embrionário do peixe-zebra tenham sido descritos no nível morfológico, pouco se sabe sobre a base molecular das mudanças celulares que ocorrem à medida que o organismo se desenvolve. Com os recentes avanços em microfluídica e tecnologias de multiplexação, agora é possível caracterizar a expressão gênica em células individuais. Isso permite a investigação da heterogeneidade entre células individuais de populações celulares específicas para identificar e classificar subtipos celulares, caracterizar estados intermediários que ocorrem durante a diferenciação celular e explorar respostas celulares diferenciais a estímulos. Este estudo descreve um protocolo para isolar células únicas viáveis de embriões de peixe-zebra para ensaios de multiplexação de alto rendimento. Este método pode ser rapidamente aplicado a qualquer tipo de célula embrionária de peixe-zebra com marcadores fluorescentes. Uma extensão desse método também pode ser usada em combinação com tecnologias de sequenciamento de alto rendimento para caracterizar completamente o transcriptoma de células individuais. Como prova de princípio, a abundância relativa de marcadores de diferenciação cardíaca foi avaliada em células isoladas e únicas derivadas de progenitores cardíacos positivos para nkx2.5. Por meio da avaliação da expressão gênica no nível de uma única célula e em um único ponto de tempo, os dados apóiam um modelo no qual os progenitores cardíacos coexistem com a progênie diferenciadora. O método e o fluxo de trabalho descritos aqui são amplamente aplicáveis à comunidade de pesquisa do peixe-zebra, exigindo apenas uma linha de peixes transgênicos rotulados e acesso a tecnologias microfluídicas.

Introdução

A maioria dos estudos atuais de biologia celular e molecular são baseados em médias populacionais. No entanto, os eventos biológicos importantes podem ser mascaradas por estas análises tradicionais de base populacional já que as populações menores podem desempenhar papéis importantes em processos biológicos e evolução da doença. Compreendendo a expressão do gene em populações heterogéneas ao nível da célula individual podem (e têm) levar a insights biológicos e clínicos relevantes ^1,2. Motivo de preocupação para estudos de desenvolvimento embrionário, em uma população maior de células, as células progenitoras são muitas vezes sub-representados, tornando-o ....