Artigo de método

Conversão epigenética como um método seguro e simples para obter células secretoras de insulina a partir de fibroblastos da pele de adultos

DOI:

10.3791/53880

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18 de março de 2016

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Biomedical Embryology, Unistem, Centre for Stem Cell Research, Università degli Studi di Milano

Neste artigo

Resumo

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Aqui, é apresentado um novo método que permite a conversão de fibroblastos da pele adulta em células secretoras de insulina. Esta técnica é baseada na conversão epigenética, não envolve o uso de vetores retrovirais nem a aquisição de um estado pluripotente estável. É, portanto, altamente promissor para aplicações em medicina translacional.

Resumo

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A medicina regenerativa requer células novas e totalmente funcionais que são entregues aos pacientes para reparar tecidos degenerados ou danificados. Quando tais células não estão prontamente disponíveis, elas podem ser obtidas usando diferentes abordagens que incluem, entre muitas, reprogramação e transdiferenciação, com vantagens e limitações específicas das diferentes técnicas. Aqui, uma nova estratégia para a conversão de um fibroblasto adulto maduro em uma célula secretora de insulina, arbitrariamente designada como células convertidas epigenéticas (EpiCC), é descrita. O método foi desenvolvido, com base na crescente compreensão dos mecanismos que controlam a regulação epigenética do destino e diferenciação celular. Em particular, o primeiro passo usa um modificador epigenético, ou seja, 5-aza-citidina, para levar as células adultas a um estado "altamente permissivo". Em seguida, aproveita essa janela breve e reversível de plasticidade epigenética para redirecionar as células para uma linhagem diferente. A abordagem é designada "conversão celular epigenética". É uma maneira simples e robusta de obter um interruptor de interlinhagem celular eficiente, controlado e estável. Como o protocolo não envolve o uso de nenhuma transfecção de genes, é livre de vetores virais e não envolve um estado pluripotente estável, é altamente promissor para aplicações em medicina translacional.

Introdução

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Um dos objectivos fundamentais da medicina regenerativa é a geração de células novas e funcionais que podem ser utilizadas para reparar ou substituir danificado, degenerou tecidos. Refazendo células adultas facilmente disponíveis para novos, convertendo-os a partir de um tipo de célula para outra, constitui uma abordagem particularmente interessantes, especialmente quando a população de células não é necessário abundante ou de difícil acesso. No entanto, células adultas são notavelmente estáveis. Eles adquirem seu estado diferenciado através de uma restrição gradual em suas opções e, uma vez que eles atinjam a especialização de terminais maduros, eles estavelmente guarde-1.

Nos últimos anos, um número de protocolos têm sido desenvolvidos, que permitem a reprogramação para pluripotência de uma célula somática (IPS) obtida através da expressão forçada de um conjunto de factores de transcrição 2,3. Alternativamente, a conversão de células podem ser obtidas por transdiferenciação linhagem directa, a introdução de um único quatro ou uma combinação de factores de transcrição 5-7. Esta estratégia não envolve a transição através de um estado diferenciado-de, mas exige alta expressão da transcrição específica fatores 8.

Nós desenvolvemos recentemente um protocolo de conversão com base na breve exposição de células adultas para as propriedades demetilantes da citidina análogo 5-azacitidina (5-aza-CR), um inibidor da DNA metiltransferase bem caracterizado. O passo de desmetilação é imediatamente seguido por um protocolo de diferenciação específica 9-11 que permite obter o fenótipo do terminal necessária. Este método é capaz de converter as células maduras, diferenciadas em células de uma linhagem diferente e tem a vantagem substancial a fim de evitar, tanto a utilização de vectores virais e a transfecção de quaisquer factores de transcrição exógenos. A aquisição de um estado pluripotente estável, eo aumento da susceptibilidade relacionadas à célula instabilidade também é evitado.

O protocolo detalhado que permite a conversão de fibroblastos da pele de seres humanos adultos em células totalmente funcionais secretoras de insulina é aqui apresentada. No entanto, é importante notar que a técnica tem sido aplicada a diferentes tipos de células e produziu resultados positivos, ao abordar células no sentido de várias vias de diferenciação. Além disso, a conversão epigenética tem sido utilizado com sucesso na espécie humana e suína 9-13, bem como no cão (manuscrito apresentado), sugerindo uma grande eficácia e robustez da abordagem.

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Protocolo

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Nota: Todos os procedimentos descritos abaixo deve ser realizada sob capela de fluxo laminar em condições estéreis. Certifique-se de que todos os procedimentos de cultura são realizadas em etapas termóstato e as células são mantidas a 37 ° C em toda a manipulação.

1. Pele Isolamento de fibroblastos

  1. Prepare Cultura Solution Dish Coating
    1. Dissolve-se 0,1 g de gelatina porcina em 100 ml de água (concentração final 0,1%). Esterilizar solução com autoclave.
    2. Adicionar 1,5 ml de solução estéril de gelatina porcina 0,1% a 35 mm pratos Petri. Espera 2 h para o revestimento, mantendo-as à temperatura ambiente.
      Nota: As biópsias da pele humana são recolhidas por excisão sob anestesia local a partir de uma zona avascular do aspecto anterior do antebraço e armazenado em tampão fosfato salino de Dulbecco (PBS) suplementado com solução de antibiótico antimicótico a 2% a 4 ° C antes de usar.
  2. Lavar com biópsias novo PBS suplementado com 2% de antibisolução antimicótico ótica.
  3. Coloque biópsias em um prato de 100 milímetros Petri e corte em cerca de 2 mm 3 fragmentos com bisturis esterilizados.
  4. Remover o excesso de solução de revestimento imediatamente antes do plaqueamento fragmentos.
  5. Coloque 5-6 fragmentos de pele na placa de Petri de pré-revestido 35 mm.
  6. Prepare meio de cultura de fibroblastos: 77% de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) elevado teor de glucose, 20% de Soro Fetal Bovino (FBS), 1% de solução de L-glutamina e 2% de solução de antibiótico antimicótico.
  7. Adicionar uma gota de meio de fibroblastos sobre cada fragmento (geralmente 100 ul por fragmento) e cultura los a 37 ° C em 5% de CO 2.
  8. Após 24 horas, adicionar 500 mL de meio de cultura de fibroblastos sobre os fragmentos para os manter húmida a 37 ° C em 5% de CO 2.
  9. Alterar o meio com uma pipeta, pelo menos uma vez a cada 48 horas.
  10. Após 6 dias de incubação, retirar fragmentos de tecido com cuidado e descartá-las.
    Nota: Após 6 dias, de fibroblastoss começar a crescer a partir dos fragmentos de tecido e começam a formar uma monocamada de células.
  11. Actualizar meio, adicionar 2 ml de meio de cultura de fibroblastos e continuar a cultura de células em monocamada a 37 ° C em 5% de CO2.

2. Cultura de fibroblastos

  1. Fibroblastos de cultura a 37 ° C em 5% de CO2, até 80% de confluência
  2. Para Passaging, meio de cultura de fibroblastos a partir de aspirado de pratos de cultura de tecidos. Lave as células três vezes com 4 ml de PBS suplementado com solução de antibiótico antimicótico a 1%.
  3. Adicionar uma camada fina (10% do volume de meio de cultura) de uma solução de tripsina-EDTA (0,5 g / L de porcino de tripsina e 0,2 g / L de EDTA) e incubar a 37 ° C até a monocamada de células começa a separar da parte inferior do tecido placa de cultura e as células se dissociam.
  4. Dilui-se a suspensão de células com 9 partes de meio de cultura de fibroblastos de acção para neutralizar a tripsina. A centrifugação não é necessário.
  5. células da placa em novas placas de cultura (coma gelatina) e cultura a 37 ° C em 5% de CO2. Mantenha a razão de passagem entre 1: 2 e 1: 4, dependendo da taxa de crescimento.
  6. Quando as células atingem cerca de 80% de confluência, passagem los (geralmente duas vezes por semana).

3. Fibroblasto chapeamento de epigenética Conversão

  1. Adicionar 0,26 ml / cm 2 de 0,1% de gelatina porcina (preparar como descrito em 1.1) para pratos de cultura de células. Esperar 2 horas para o revestimento.
  2. Remover o excesso de solução de revestimento min antes do plaqueamento 10-30 fibroblastos.
  3. Remover o meio de cultura de fibroblastos a partir de placas de cultura. Lave as células três vezes com PBS suplementado com solução de antibiótico antimicótico a 1%.
  4. Adicionar uma camada fina (10% do volume de meio de cultura) de uma solução de tripsina-EDTA (0,5 g / L de porcino de tripsina e 0,2 g / L de EDTA) e incubar a 37 ° C até a monocamada de células começa a separar da parte inferior do tecido placa de cultura e as células se dissociam.
  5. Dilui-se a suspensão de células com 9 partes de fibroblmeio de cultura de AST para neutralizar tripsina acção.
  6. Contagem de células utilizando uma câmara de contagem sob um microscópio à temperatura ambiente. Calcular o volume necessário de meio de cultura de fibroblastos para ressuspender as células, para se obter uma concentração celular de 7,8 x 10 4 fibroblastos / cm2. Isto dependerá do tipo específico de câmara utilizada.
    Células / ml = Número médio de célula por grade x 90 (fator de multiplicação) diluição x pequena
  7. suspensão de células Centrifugar a 150 g durante 5 min à temperatura ambiente. Remover as células sobrenadante e ressuspender com o volume calculado previamente de meio de cultura de fibroblastos.
  8. Células de placa em pratos de 0,1% de gelatina e cultura los durante 24 h a 37 ° C em 5% de CO 2 incubadora pré-revestidos.

A plasticidade celular 4. Aumento Usando o De-metilação Agente 5-aza-CR

  1. dia 0
    1. Prepare 5-aza-CR solução de reserva dissolvendo 2,44 mg de 5-aza-CR, em 10 ml de DMEM de alto teor de glucose Medium. Esterilizar por filtração. Prepare da 5-aza-CR imediatamente antes da utilização.
    2. Dilui-se 1 ul de 5-aza-CR solução estoque em 1 ml de meio de cultura de fibroblastos (concentração final de 1 uM).
    3. Para aumentar a plasticidade da célula, 24 horas após o plaqueamento de células (3,8 subtítulo), remover o meio de cultura a partir de fibroblastos semeados e adicionar 1 uM 5-aza-CR solução estoque e a cultura durante 18 horas a 37 ° C em 5% de CO2.
  2. Dia 1
    1. Prepare meio fresco pluripotentes humanas (HP), tal como descrito na Tabela 1.
    2. Após incubação com 1 uM de 5-aza-CR, remover o meio e lava-se as células três vezes com PBS para assegurar que a 5-aza-CR é lavado.
    3. Incubar 5-aza-CR fibroblastos tratados com meio de HP durante 3 horas (período de recuperação) a 37 ° C em 5% de CO 2.
    4. Após o período de recuperação, remover o meio, lavar três vezes com PBS.
    5. Para controlar a eficácia de 5-aza-CR tratamento, verificar neste passo fou a presença de alterações morfológicas (detalhado na secção de resultados). Células perdem a morfologia alongada típica de fibroblastos e adquirem uma forma redonda ou oval, tornando-se menores em tamanho, com núcleos aumentados.
    6. Prosseguir com a diferenciação de pâncreas.

5. pâncreas Diferenciação Protocolo

  1. dias 1-6
    1. Prepare pâncreas Meio Basal como descrito na Tabela 2.
    2. Prepare Activina A solução estoque: dissolver 5 ug de proteína de activina A recombinante humana em 166.6 ul de água estéril.
    3. Cultura 5-aza-CR tratada fibroblastos em 0,26 ml / cm 2 de pâncreas Meio Basal, suplementado com 1 ul / ml de activina A solução de reserva (ver 5.1.2) durante 6 dias a 37 ° C em 5% de CO2. Alterar média diária.
  2. dias 7-8
    1. Preparar solução mãe de ácido retinóico por adição de 16,6 ml de sulfóxido de dimetilo (DMSO) a 50 mg de aci retinóicod.
    2. Células de cultura em 0,26 ml / cm 2 de pâncreas Meio Basal suplementado com 1 ul / ml de activina A solução de reserva (ver 5.1.2) e / ml de solução concentrada de ácido retinóico 1 ul (ver 5.2.1) durante 2 dias a 37 ° C em 5% de CO 2. Alterar média diária.
  3. dias 9-36
    1. Células de cultura em 0,26 ml / cm 2 de pâncreas Meio Basal suplementado com 1% (v / v) insulina-transferrina-selênio (ITS), 2% (v / v) B27 e 0,1% (v / v) recombinante de FGF humano básico (bFGF) da solução (ver Quadro 1) a 37 ° C em 5% de CO2. Mudar a forma diariamente durante os primeiros 15 dias.
    2. A partir do dia 16 em diante, refrescar meio todos os outros dias, sob um microscópio, uma vez que as células formadoras de agregados pode soltar-se do fundo do prato de cultura.

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Resultados

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Estabelecimento de cultura primária a partir de biópsias de pele
As biópsias da pele foram cortados em pequenos fragmentos e colocados em pratos de gelatina pré-revestidos. Após 6 dias, os fibroblastos começou a crescer a partir dos fragmentos de tecido e formou uma monocamada de células (Figura 1A). As células apresentaram uma forma típica alongado e, como esperado, apresentou um imuno-positividade uniforme para o fibroblasto vimentina marcador específico (VIM,

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Discussão

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O presente manuscrito descreve um método que permite a conversão de fibroblastos de pele humana em células produtoras de insulina, por meio de uma exposição transitória e breve a 5-aza-CR, seguido por um protocolo de indução de tecido específico. Esta abordagem permite que um interruptor de mesoderme endoderme de células relacionadas, sem a expressão forçada de factores de transcrição ou microARNs nem a aquisição de um estado pluripotente estável, que torna as células mais instável e propenso a erros 14.

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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Este trabalho foi financiado pela Fundação Carraresi e Fundação Europeia para o Estudo da Diabetes (EFSD). GP é apoiado por uma bolsa de pós-doc, da Universidade de Milão. Os autores são membros da Acção COST FA1201 Epiconcept: Epigenética e Periconception ambiente e da Acção COST BM1308 Sharing avança em modelos animais de grande porte (SALAAM). Talb é membro da Acção COST CM1406 epigenética Chemical Biology (EPICHEM).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Solução salina tamponada com fosfato DulbeccoSigmaD5652PBS; para lavagem de células e preparação de solução
Solução antibiótica antibióticaSigmaA5955Componente de fibroblastos, HP e meios pancreáticos
Placa de Petri de 100 mmSarstedt83.3902Para isolamento de fibroblastos
Gelatina suínaSigmaG1890Para revestimento de pratos
ÁguaSigmaW3500Para preparação de solução
35 mm Placas de PetriSarstedt83.39Para isolamento de fibroblastos
DMEM, glicose alta, piruvatoLife Technologies41966052Para meio de cultura de fibroblastos
Soro bovino fetalLife Technologies10500064FBS; Componente de fibroblastos e meios HP
Solução de L-glutaminaSigmaG7513Componente de fibroblastos, HP e meios pancreáticos
Solução de tripsina-EDTASigmaT3924Para dissociação de fibroblastos
KOVA GLASSTIC SLIDE 10 COM GRADESHycor Biomedical87144Contagem de células
5-AzacitidinaSigmaA23855-aza-CR, para células increrase plasticidade em fibroblastos
Mistura de nutrientes F-10 da Ham'sLifeTechnologies 31550031Para meio HP
DMEM, baixa glicose, piruvatoLife Technologies31885023Para HP médio
KnockOut Serum ReplacementLife Technologies10828028Componente do meio HP
MEM Solução de Aminoácidos Não EssenciaisLife11140035Componente de HP e meio basal pancreático
2-mercaptoetanolSigmaM7522Componente de HP e meio basal pancreático
GuanosinaSigmaG6264Componente de estoque de mistura de nucleosídeos do meio HP
AdenosinaSigmaA4036Componente de estoque de mistura de nucleosídeos do meio HP
CitidinaSigmaC4654Componente de estoque de mistura de nucleosídeos do meio HP
UridinaSigmaU3003Componente de estoque de mistura de nucleosídeos do meio HP
TimidinaSigmaT1895Componente de estoque de mistura de nucleosídeos do meio HP
Millex-GS 0,22 µ mMilliporeSLGS033SBPara esterilização da solução
FGF-Basic (AA 1-155) Tecnologias de Vida de Proteína Humana RecombinantePHG0261bFGF; Componente de HP e meio basal pancreático
Albumina de soro bovinoSigmaA3311BSA; Componente do meio basal pancreático
DMEM / F-12Life Technologies11320074para meio basal pancreático
B-27 Suplemento menos vitamina ALife Technologies12587010componente do meio pancreático
N-2 SuplementoLife Technologies17502048do meio basal pancreático
Activin A Proteína humana recombinanteLife TechnologiesPHG9014Para meio pancreático
Ácido RetinóicoSigmaR2625Para meio pancreático
Dimetil sulfóxido SigmaD2650DMSO; para preparação de estoque de ácido retinóico
Insulina-Transferrina-SelênioLife Technologies41400045ITS; para meio Pancreático Final
Anticorpo anti-Vimentina Abcamab8069Para análise imunocitoquímica. Diluição de trabalho 1:100
4′,6-Diamidino-2-fenilindol dicloridratoSigma32670DAPI. Para análise imunocitoquímica. Diluição de trabalho  1 µ g/ml
5-MetilcitidinaEurogentecMMS-900P-BPara análise imunocitoquímica. Diluição de trabalho 1:500
Anti-C Peptídeo anticorpo Abcamab14181Para análise imunocitoquímica. Diluição de trabalho 1:100
Anti-PDX1 anticorpo Abcamab47267Para análise imunocitoquímica. Diluição de trabalho 1:500
Mercodia Insulina ELISAMercodia10-1113-10Para detecção de liberação de insulina
Technologies

Referências

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