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Identificação de condições críticas para Immunostaining no Pea Aphid Embriões: Aumento Tissue permeabilidade e diminuir a coloração de fundo

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DOI:

10.3791/53883

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2 de fevereiro de 2016

 , 
1Department of Entomology, National Taiwan University, 2Institute of Biotechnology, National Taiwan University, 3Research Center for Developmental Biology and Regenerative Medicine, National Taiwan University, 4Genome and Systems Biology Degree Program, National Taiwan University and Academia Sinica

Neste artigo

Resumo

Um protocolo de imunocoloração de montagem total em embriões de pulgões é apresentado, no qual são abordadas as condições críticas para diminuir a coloração de fundo e aumentar a permeabilidade do tecido. Essas condições são desenvolvidas especificamente para a detecção eficaz da expressão de proteínas nos tecidos embrionários de pulgões.

Resumo

O Acyrthosiphon pisum ervilha pulgão, com um genoma seqüenciado e abundante plasticidade fenotípica, tornou-se um modelo emergente para estudos genômicos e de desenvolvimento. Como outros pulgões, A. Pisum propagar rapidamente via reprodução vivípara parthenogenetic, onde os embriões se desenvolvem dentro de câmaras de ovo em uma forma de linha de montagem na ovaríolo. Anteriormente nós estabelecemos uma plataforma robusta de todo-mount hibridização in situ permitindo a detecção da expressão de mRNA nos embriões de afídeos. Para analisar a expressão de proteínas, no entanto, os protocolos estabelecidos para a imunocoloração os ovarioles de pulgões assexuadas vivíparos não produziu resultados satisfatórios. Aqui nós relatamos condições otimizadas para aumentar a permeabilidade dos tecidos e diminuição da coloração de fundo, sendo que ambos foram problemas ao aplicar abordagens estabelecidas. Optimizações incluem: (1) incubação de proteinase K (1 ug / ml, 10 min), o qual foi encontrado f essencialou a penetração de anticorpos em embriões de médio e em estágio final de pulgões; (2) a substituição de albumina sérica de soro de cabra / bovina normal com um reagente de bloqueio fornecido por um digoxigenina (DIG) -based conjunto de tampões e (3) aplicação de metanol em vez de peróxido de hidrogénio (H 2 O 2) para o branqueamento da peroxidase endógena; que reduziu significativamente a coloração de fundo nos tecidos de afídeos. Estas condições críticas optimizadas para imunocoloração permitirá a detecção eficaz de produtos de genes em embriões de A. Pisum e outros pulgões.

Introdução

Pulgões são insetos hemípteros com pequenos (1-10 mm) corpos macios. Eles se alimentam de plantas sugando a seiva floema com mouthparts piercing. Além disso, eles contam com uma bactéria endosymbiotic obrigatório, Buchnera aphidicola, para sintetizar aminoácidos essenciais que são deficientes na dieta seiva floema. Pulgões tem uma história de vida complexo que inclui reprodução vivípara parthenogenetic durante a primavera eo verão fotoperíodo longo dia e reprodução ovípara sexual desencadeada por fotoperíodos de curto-dia durante o qual eles estabelecem um número limitado de ovos overwintering 1,2. Na Primavera esses ovos eclodem para produzir a primeira geração de todo-fêmea pulgões (fundatrices), na sequência de muitas rodadas de reprodução parthenogenetic até o outono. A partenogênese cíclico em pulgões, onde fases sexuada e assexuada, alternam no ciclo de vida anual, tem sido considerada como um 1,2 novidade evolucionária. Nos pulgões vivíparos partenogenéticas, Embriogênese ocorre dentro de câmaras de ovos dos túbulos ovarianos (ovaríolos). Em contrapartida, os embriões ovíparos sexuais desenvolver nos ovos fertilizados. Além de plasticidade reprodutiva, os pulgões podem exibir transgeracional polifenismo asa: em resposta a sinais de superlotação e ameaças de predadores, as fêmeas assexuadas unwinged pode vivíparos produzir descendentes voado para a migração de longa distância. Publicação da sequência do genoma do pulgão da ervilha pisum Acyrthosiphon -a primeira sequência de genoma para uma basal inseto-hemimetabolous permite uma maior exploração da plasticidade reprodutiva, asa polifenismo, e outros recursos, incluindo interações inseto-planta, vetorização viral e simbiose em pulgões em um molecular 3 base.

Além do genoma sequenciado, ferramentas para caracterizar expressão e função do gene são necessários para promover o afídeo da ervilha como um organismo modelo 4 madura. Nós descrevemos protocolos robustos de todo-mount hibridação in situ para detectar a expressão de ARNm em embriões de afídeos 5-7. Interferência de RNA (RNAi), através de injecção de ARN de cadeia dupla e de alimentação foi usado para silenciamento de genes em ninfas de afídeos e adultos, mas condições estáveis ​​para o gene knockdown nos embriões não foram ainda relatados 8-10. A imunocoloração, uma abordagem baseada em anticorpo que se pode detectar a expressão de proteínas em amostras antes e depois de ARNi knockdown, foi realizada em embriões de ervilha 11-13 afídeos. No entanto, o aumento da permeabilidade do tecido e a eliminação de coloração de fundo é ainda insatisfatória utilizando protocolos convencionais para a imunocoloração nas embriões vivíparos assexuadas de ervilha pulgão. Por exemplo, verificou-se que a penetração do anticorpo aos tecidos diminuiu em embriões gastrulating (fases 8-10) e que os embriões com brotos dos membros morfologicamente identificáveis ​​(etapas 13-14) eram pouco permeável ao anticorpo. Além disso, a coloração de fundo foi visualizado no viviparo assexuadaUS embriões de afídeos de ervilha coradas utilizando o anticorpo contra o marcador da linha germinativa dos vasos, bem como contra a proteína que Engrailed / Invected expressa nos segmentos embrionárias 12,13. Na verdade, a coloração de fundo foi ainda claramente visível em embriões corados com o anticorpo secundário sozinho.

A fim de aumentar a permeabilidade, sem danificar a integridade dos tecidos de afídeos, cuidadosamente titulada a concentração de proteinase K e determinaram as condições óptimas para a digestão de tecidos de embriões de afídeos. A fim de evitar coloração não específica na ervilha pulgão, temos procurado por compostos que poderia bloquear eficazmente os embriões e suprimir a actividade endógena de peroxidase (POD), uma enzima utilizada para amplificar os sinais durante a imunocoloração. Um reagente de bloqueio proporcionada por uma digoxigenina (DIG) -based conjunto tampão, em vez do soro de cabra normal utilizado tradicionalmente (NGS) / albumina do soro bovino (BSA), reduziu significativamente a coloração de fundo. Além disso, o metanol foi encontrado para inhimordeu a actividade POD endógena mais eficaz do que o peróxido de hidrogénio (H 2 O 2). Os detalhes a respeito dessas condições específicas de afídeos para immunostaining sobre os embriões serão descritos nas seções a seguir.

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Protocolo

1. Cultura de pulgões

NOTA:. A cepa laboratorial da parthenogenetic viviparous ervilha pulgão A pisum foram originalmente coletadas no centro de Taiwan e tem sido criados em plantas hospedeiras (a sativum jardim ervilha Pisum ou fava Vicia faba) sob longo dia fotoperíodo para mais de 300 gerações (uma geração: ~ 10 dias).

  1. Germinação de sementes
    1. Mergulhe as sementes de plantas hospedeiras em água corrente por 3-5 dias em temperatura ambiente. Reabastecer com água fresca, uma vez por dia.
      NOTA: Como alternativa, colocando sementes de plantas hospedeiras em linha reta em solo úmido pode induzir a germinação também.
    2. Crescer 10 sementes germinam em uma panela pequena (9 cm de diâmetro x 7 cm de altura) com solo na câmara de crescimento sob fotoperíodo de 16 horas de luz / 8 h escuro, a 20 ° C.
    3. Cerca de 10 dias após o crescimento começa, transferir pulgões sobre as plantas cuja altura é de mais de 8 cm.
  2. Transferência de pulgões
    1. Mantenha cada vaso de plantas dentro de um copo de vidro de 1 L, transferir 8 pulgões adultos em plantas usando um pincel, e, em seguida, selar o copo com uma tampa permeável ao ar, como malha gaze para evitar a fuga dos pulgões.
    2. Incubar pulgões em uma câmara de crescimento sob fotoperíodo de 16 horas de luz / 8 h escuro, a 20 ° C. Regue cada vaso de plantas uma vez por dia.
    3. Para obter a próxima geração de pulgões, reiterar passos 1.1.3-1.2.2 dez dias após a transferência pulgão primário.

2. Dissecção e Fixação de Ovários

  1. Recentemente preparar 4% de paraformaldeído (PFA) em solução salina tamponada 1x com fosfato (PBS) como o tampão de fixação.
  2. Encha um poço de uma placa de ponto com PFA (cerca de 500 mL), colocar a placa sob um microscópio estéreo com pequeno aumento, e submergir um pulgão adulto dentro da PFA para dissecção.
  3. Dissecar ovários, segurando a cabeça e abdômen com um conjunto de pinças, cortando abrir o dorsalcutícula do abdómen, e arrastando os ovários de distância a partir da cavidade abdominal.
  4. Fix três pares de ovários em um tubo de 1,5 ml contendo 1 ml de PFA à TA durante 20 min.
  5. Decantar tampão de fixação com uma pipeta de transferência (de vidro ou descartável) e, em seguida, lavar ovários com 0,2% de Triton X-100 em PBS 1x (PBST) 3 vezes durante 10 minutos cada. Leve agitação num misturador / rotador (ângulo de rotação: 60 ° (F60) / velocidade de rotação: 8 RPM) é recomendado tanto para a fixação e lavagem.

3. O tratamento com proteinase K (PK) para aumentar a permeabilidade dos tecidos embrionários

NOTA: tratamento PK é aplicada a embriões de extensão banda germe em diante (estágio 11 de desenvolvimento). Para os embriões jovens, este passo é opcional.

  1. Serialmente diluir a solução mãe de PK (10 mg / ml) com 1x PBS para a concentração de trabalho de 1 ug / ml.
  2. Incubar ovários com 1 ug / mL de PK (cerca de 500 mL) durante 10 minutos com agitação suave.
  3. Decantar PK solutiem seguida, lavar e os ovários com 700 ul de glicina (2 mg / ml) 3 vezes durante 5 minutos cada.
  4. Lavar ovários com PBST 0,2% duas vezes durante 10 minutos cada.
  5. Fix ovários novamente com tampão de fixação durante 15 min à temperatura ambiente com agitação suave.
  6. Elimine o sobrenadante e lava-se com 0,2% ovários PBST duas vezes durante 10 minutos cada.

4. Metanol Incubação para suprimir a peroxidase endógena (POD) atividade

NOTA: O metanol incubação não é aplicada aos embriões sujeitos a phalloidin de coloração ou epítopos de anticorpos que são metanol sensível.

  1. Desidratar ovários em série com diferentes percentagens de metanol em PBST 0,2% (v / v: 1: 3, 1: 1, 3: 1) através da incubação de ovários em cada concentração da solução de metanol durante 10 min com agitação suave.
  2. Desidratar ovários com 100% de metanol durante 1 hora à TA com agitação suave.
    NOTA: Resultados satisfatórios de coloração pode ser ainda obtido a partir de tecidos de pulgões que foram armazenados em 100% de metanol a -20 &# 176; C, durante um mês.
  3. Seriadamente reidratar ovários com diferentes percentagens de metanol em PBST 0,2% (v / v: 3: 1, 1: 1, 1: 3) através da incubação de ovários em cada concentração da solução de metanol durante 10 min com agitação suave.

5. Coloração de anticorpos

  1. Diluir a solução 10x de bloqueio do conjunto tampão à base de DIG (DIG-B) para 1x.
    NOTA: A solução de bloqueio 1x DIG-B é mais eficaz para a redução da coloração de fundo de reagente padrão de bloqueio composto por 5% (v / v) de soro de cabra normal (NGS) e 0,5% (v / v) de albumina de soro bovino (BSA ) em 0,2% de PBST.
  2. Incubar os ovários com a solução 1x DIG-B bloqueio durante 2,5 a 4 horas à temperatura ambiente ou O / N a 4 ° C com agitação suave.
    NOTA: Para três pares de ovários em um tubo de 1,5 ml, 200 ul é o volume mínimo para o bloqueio por amostra e coloração com anticorpo.
  3. Decantar o sobrenadante e substituir com solução de bloqueio 1x DIG-B fresco contendo o anticorpo primário em diluti apropriadoem proporção. Manchar os ovários durante 4 horas à temperatura ambiente ou O / N a 4 ° C com agitação suave.
    NOTA: Para o experimento descrito aqui, use as seguintes diluições ideais de anticorpos primários: (1) ApVas1 anticorpos: 1: 500 para a coloração cromogénico, 1:50 para imunofluorescência; (2) anticorpo anti-tubulina α: 1: 500; (3) o anticorpo monoclonal 4D9: 01:25.
  4. Lavar ovários com 0,2% PBST 4 vezes durante 15 minutos cada.
  5. Incubar ovários com solução de bloqueio 1x DIG-B durante 1 hora à TA com agitação suave.
  6. Decantar o sobrenadante e substituir com frescos solução de bloqueio DIG-B 1x contendo anticorpo secundário em razão de diluição apropriado. Manchar os ovários durante 4 horas à temperatura ambiente ou O / N a 4 ° C com agitação suave.
    1. Use as seguintes razões de diluição de anticorpos secundários: (1) Para a coloração de imunofluorescência: 1: 500 para Alexa Fluor 633 IgG de cabra anti-coelho ou de cabra Alexa Fluor 488 anti-IgG de ratinho; (2) Para a coloração cromogénico: 1: 200 de IgG de cabra biotinilada anti-coelho.
      NOTA: O anticorpo secundário biotinilado é aplicada para interagir com o complexo avidina-biotina (ABC) na (cromogénica) a detecção baseada em substrato, através do qual os sinais são amplificados significativamente coloração.
    2. Para imunofluorescência, realizar coloração no escuro, porque o anticorpo secundário é sensível à luz.
  7. Lavar anticorpo secundário com 0,2% PBST 4 vezes durante 10 minutos cada.

6. Nuclear e F-actina Coloração

NOTA: Isto só é aplicada por imunofluorescência.

  1. Mancha ovários com 0,2% PBST contendo DAPI (2 ng / ul) e faloidina-TRITC (100 nM) durante 2 horas à temperatura ambiente no escuro.
  2. Lavar ovários com 0,2% PBST 4 vezes durante 10 minutos cada.
  3. Incubar ovários com o meio de montagem O / N a 4 ° C com agitação suave.

7. Desenvolvimento de sinal

NOTA: Isto só é aplicada para a coloração cromogênico.

  1. Preparação de 100 ul dereagente de avidina-biotina (ABC) para reforçar os sinais através da adição de 1 ml de reagente A (avidina) em 98 ul de 0,2% de PBST, misturando cuidadosamente através de pipetagem suave, e adicionando 1 ml de reagente B (biotina conjugado com peroxidase de rábano ), seguido de mistura imediata. Incubar a mistura durante 30 min à temperatura ambiente com agitação suave.
  2. Incubar ovários (incluindo as câmaras de ovo dissociados) na mistura de reagentes A e B durante 30 min à temperatura ambiente com agitação suave.
  3. Lavar a mistura de reagentes A e B com 0,2% de PBST 4 vezes durante 10 minutos cada.
  4. Transferir ovários submersas em PBST a um poço na placa de ponto com um conta-gotas de plástico.
  5. Preparar a solução de substrato de 3,3'-diaminobenzidina (DAB): dissolver um comprimido DAB mais outra contendo peróxido de hidrogénio ureia em 1 ml de ddH2O através de vórtice vigoroso durante 1 min.
    NOTA: DAB, um substrato precipitante de peroxidase, é um cromogénio popular para immunostaining. Ela produz uma brprecipitado insolúvel próprio e depois de ter sido oxidado pelo peroxidase. Os sinais fracos podem ser melhorados pela adição de cloreto de níquel para a solução de substrato (concentração final de 0,05-0,08%).
  6. Remover a solução de PBST remanescente no poço e voltar a encher com 100 uL da solução de substrato DAB para o desenvolvimento do sinal.
  7. Monitorar a intensidade de sinais sob um microscópio estéreo em baixa ampliação.
  8. Pare reacções removendo a solução DAB, seguido de reenchimento com 1x PBS imediatamente. Repita a lavagem duas vezes.
  9. Transferir ovários de volta para o tubo de 1,5 ml e, em seguida, lava-se com 1x PBS ou PBST duas vezes durante 15 minutos cada.
  10. Incubar ovários em um meio à base de glicerol de montagem (70% de glicerol) O / N a 4 ° C com agitação suave.

8. Montagem do Aphid Embriões

NOTA: A espessura de embriões de afídeos varia entre fases de desenvolvimento. Estratégias de montagem são, portanto, modificado para atender precoces (germaria e encena 0-10), meio (estágios11-18), e tardios embriões (etapas 19-20), que são mostrados na Figura 2B - D. Estadiamento embrionário seguido Miura et al 12.

  1. Transferir ovários junto com meio de montagem para a bandeja de celular com um conta-gotas plástico e observar amostras sob um microscópio estéreo em baixa ampliação.
  2. Corte os cálices associados ao oviduto lateral usando os pinos de insetos e, em seguida, transferir uma ovaríolo isolado para um copo vazio bem com um conta-gotas. Faça-se o volume final de 50-100 ul usando meio de montagem.
  3. Transferir uma ovaríolo para o slide com um conta-gotas de vidro e depois dissecá câmaras de ovo usando os pinos de insetos.
    NOTA: Para os embriões com mais de 6 fase de desenvolvimento, sugere a separação de câmaras de ovos; para germaria e as duas primeiras câmaras de ovos com menos de fase 6, a separação é opcional.
  4. Mudaria de uma câmara de ovo dissecado para uma lâmina limpa usando um conta-gotas de vidro.
  5. Coloque uma lamela (tamanho: 22 x 22mm) ao longo dos germaria dissecados ou câmaras de ovos (contendo embriões em estágios de desenvolvimento 1-10) lentamente para evitar bolhas.
    1. Câmaras de Mount ovo (contendo embriões em estágios do desenvolvimento 11-18) em um slide com a ponte lamela unilateral e colocar outra lamela (tamanho: 18 x 18 mm) no topo da amostra.
    2. Câmaras de Mount ovo (contendo embriões com idade superior a 19 etapa do desenvolvimento) em um slide com ponte dupla face lamela e colocar outra lamela (tamanho: 18 x 18 mm) no topo da amostra.
  6. Encha o espaço sob o topo lamela com meios de montagem para evitar a secagem da amostra.
  7. Ligeiramente role o embrião deslizando a lamela para obter a orientação certa para observação.
  8. Selar em torno da borda de lamelas (incluindo as lamelas ponte) com unha polonês.

9. Análise de Imagem

  1. Fotografia contraste de interferência diferencial (DIC) imagens de toda montagem embriões com um compouND microscópio equipado com DIC óptica e uma lente objectiva seco (10X, 20X, 40X) ligado a uma câmara. Instale o software para transferência de imagens entre a câmera eo computador usando as instruções do fabricante.
  2. Adquirir projeções dos embriões fluorescente etiquetado com uma varredura a laser confocal microscópio 14. Siga as instruções do fabricante para fotografar, z-empilhamento, e projetando 3D com software de imagem.
    1. Vire o slide de cabeça para baixo, encontrar a amostra montada com objetivo de 10X, e circundar a área da amostra com uma caneta com base oleada bem.
      NOTA: Isso faz com identificação da amostra mais fácil quando procurá-lo através de objectivos de um microscópio confocal.
    2. Adicionar uma gota de óleo na parte superior da área de lamela cujo lado oposto é rotulado como descrito no ponto 9.2.1.
  3. Encontre o plano focal em 40X objetivo de imersão em óleo, em seguida, mudar para um objetivo de imersão em óleo 63X. Mova manualmente o controle de foco fino e fazerwn para capturar o melhor plano focal.
    NOTA: Para observar detalhes estruturais da germaria e embriões, sugerimos o uso 40X objetivos ou aqueles com maior ampliação.
  4. Digitalizar o embrião em diferentes canais de excitação e obter uma imagem de z-stack.
    NOTA: Para tecidos de afídeos de ervilha, reduzir a espessura de cada secção óptica até 1,5 m ou menos.

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Resultados

Neste estudo, realizamos todo mount-immunostaining em embriões de afídeos de ervilha assexuados (Figura 1A). Estas fêmeas produzir descendentes partenogeneticamente e vivíparos. Estes embriões femininos se desenvolvem em câmaras de ovo dos túbulos do ovário (ovarioles) (Figura 1B e Figura 2A). Antes de microscopia, os ovaríolos dissecados são os alvos de coloração; No entanto, a separação de câmaras de ovo é necessário p...

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Discussão

Identificamos condições óptimas críticas para immunostaining sucesso no pulgão da ervilha A. Pisum, um organismo modelo emergente para estudos genômicos e de desenvolvimento 3,15. Condições otimizadas para aumentar a permeabilidade dos tecidos e reduzindo a coloração de fundo aumentou a intensidade e especificidade dos sinais. Eles diferem de protocolos padrão para a imunocoloração, em outros modelos animais nos passos para a criação de poros em membranas celulares e anticorpo bloqueador a l...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Somos gratos a Chau-Ti Ting (Fly Core em Taiwan) por fornecer o anticorpo monoclonal 4D9, Technology Commons (TechComm) da Faculdade de Ciências da Vida NTU para microscopia confocal, Hsiao-Ling Lu por revisar o manuscrito e Chen-yo Chung por ajudar nas filmagens. CC agradece particularmente a Charles E. Cook por fornecer sugestões estratégicas e pela edição crítica do manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelo Ministério da Ciência e Tecnologia (101-2313-B-002-059-MY3 e 104-2313-B-002-022-MY3 para GWL e CC) e pela Universidade Nacional de Taiwan (NTU-CESRP 101R4602D3 para CC; 103R4000 para GWL).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
30% de perxidase de hidrogênio (H2O2)Sigma-Aldrich18304Para branqueamento de peroxidase endógena de embriões.
4' Dicloridrato de 6-diamidino-2-fenil-indol (DAPI)Sigma-AldrichD9542Para rotular o DNA de fita dupla. TÓXICO. Use luvas, dispense em pequenas alíquotas e feche para minimizar a exposição
4D9 anticorpo monoclonal de camundongo anti-engrailed/invectedEstudos de desenvolvimento banco de hibridomaAB_528224Para rotular os segmentos em desenvolvimento do embrião.
Anticorpo policlonal de coelho ApVas1Nosso laboratórioN / APara rotular a proteína Vas1 específica da linha germinativa do pulgão em embriões. Este anticorpo foi feito pelo nosso laboratório. 
Austerlitz Alfinetes de insetosENTOMORAVIAN/APara separar cada câmara de ovo de um ovario. Tamanho 000, ESMALTADO PRETO. 
Albumina de soro bovino (BSA)Sigma-Aldrich9048-46-8Para bloquear a ligação não específica de anticorpos.
Câmera conectada ao microscópio compostoCanonEOS 5DPara fotografar embriões de pulgões.
Bandeja colorimétrica de 8 célulasKartell Labware357Para desenvolver o sinal de coloração de embriões de pulgões. Diâmetro 95 x 57 mm, profundidade da célula 2 mm.
Microscópio composto com óptica DICLeica MicrosystemsDMRPara fotografar embriões de pulgões montados nas lâminas.
Conjunto de tampão de lavagem e bloqueio DIGSigma-Aldrich (Roche)11585762001Para bloquear a ligação não específica de anticorpos. Diluímos a solução de bloqueio 10x em 1x como reagente bloqueador.
FórcepsIdeal-tekN/APara dissecção de ovários de pulgões. Peça do fabricante nº 5: 5 SA. 
Conta-gotas de vidroN/AN/APara transferir ovários de pulgões da placa de splot para tubos. 150 mm de comprimento total e 5 3/4" de comprimento da ponta.
GlicerolSigma-AldrichG5516Para limpeza de embriões de pulgões e montagem.
GlycineBioshopN/APara bloquear a atividade enzimática da proteinase K (PK).
IgG anti-camundongo de cabra conjugado Alexa Fluor 488InvitrogenA11017Para detecção de anticorpo primário de camundongo.
IgG anti-coelho de cabra conjugado Alexa Fluor 633InvitrogenA21072Para detecção de anticorpo primário de coelho.
Misturador IntelliEquipamento de laboratório ELMIRM-2MPara melhorar a reação completa de reagentes com ovários.
Microscopia confocal de varredura a laserLeica MicrosystemsSP5Para fotografar embriões de pulgões montados nas lâminas com etiqueta recente.
metanol Burdick e JacksonAH2304Para branqueamento da peroxidase endógena de embriões.
Lâminas de microscópioThermo scientific10143560Para montagem de embriões. Bordas retificadas SUPERFROST, ca./env. 76 x 26 mm.
Microscópio Óculos de coberturaMarienfeld0101030Para montar embriões nas lâminas. Tamanho 18 x 18 mm. Espessura nº 1 (0,13 a 0,16 mm)
Microscópio Óculos de coberturaMarienfeld0101050Para montagem de embriões nas lâminas. Tamanho 22 x 22 mm. Espessura nº 1 (0,13 a 0,16 mm)
anticorpo monoclonal anti-alfatubulina de camundongo (DM1A)Santa Cruz Biotechnologysc-32293Para rotular a distribuição de alfa-tubulina das células.
VernizN/AN/APara selar as lamínulas nas corrediças.
Soro de cabra normal (NGS)Sigma-AldrichG9023Para bloquear a ligação não específica de anticorpos.
Paraformaldeído (PFA)VWRMK262159Para fixação de ovários de pulgões.
Faloidina-TRITCSigma-AldrichP1951Para rotular a distribuição de F-actina em embriões.
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)N/AN/AComo solução isotônica para ovários de pulgões.
Conta-gotas de plásticoN/AN/APara transferir ovários de pulgões do tubo para a bandeja de células. Tamanho 3 ml. 
Proteinase KMerck124678Para criar poros (perfuração) na membrana celular e facilitar o acesso de anticorpos. 
Placa de ponto de pirexN/AN/APara dissecção e reações de cor de ovários de pulgões sob microscopia. Cada cavidade com diâmetro de 22 mm e  profundidade 7 mm.
SIGMAFAST 3,3'-diaminobenzidina (DAB) comprimidos Sigma-AldrichD4168Para o desenvolvimento de sinais com substrato. Também chamado de conjunto de comprimidos de substrato de peroxidase DAB.
Microscópio estéreoLeica MicrosystemsEZ4Para dissecção e observação de ovários de pulgões.
Triton-X 100Sigma-AldrichT8787Para criar poros (perfuração) na membrana celular. 
Kit VECTASHIELD Elite ABC (Rabbit IgG)Laboratórios vetoriaisPK-6101Para aprimoramento do sinal. Incluindo anticorpo secundário IgG anti-coelho biotinilado de cabra, reagentes A e B.
Meio de montagem VECTASHIELDVector laboratoriesH1000Para limpeza de embriões de pulgões e montagem.

Referências

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