Artigo de método

A Tissue Combinada 3D Engineered

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DOI:

10.3791/53885

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6 de abril de 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Tissue Engineering and Regenerative Medicine (TERM), University Hospital Wuerzburg, 2Department of Cardiothoracic Surgery, University Hospital Wuerzburg, 3Department of Bioinformatics, University Wuerzburg, 4Translational Center Wuerzburg, Fraunhofer Institute Interfacial Engineering and Biotechnology IGB

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Apresentamos um modelo tridimensional (3D) de câncer de pulmão baseado em um andaime de colágeno biológico para estudar a sensibilidade a terapias direcionadas ao câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC). Demonstramos diferentes técnicas de leitura para determinar o índice de proliferação, apoptose e status de transição epitelial-mesenquimal (EMT). Os dados coletados são integrados em um modelo in silico para previsão da sensibilidade aos medicamentos.

Resumo

No presente estudo, nós combinamos um modelo de tumor in vitro 3D pulmão com um modelo em silico para otimizar previsões de resposta à droga com base em um fundo mutacional específico. O modelo é gerado num andaime porcino descelularizado que reproduz as características específicas de tecidos em relação à composição da matriz extracelular e arquitectura, incluindo a membrana basal. Nós padronizado um protocolo que permite a geração de tecido tumoral artificial no prazo de 14 dias incluindo três dias de tratamento com fármaco. Nosso artigo fornece várias descrições detalhadas de 3D ​​leitura de técnicas de rastreio, como a determinação da do índice de proliferação Ki67 coloração, a apoptose a partir de sobrenadantes por M30-ELISA e avaliação de epitelial para mesenquimal (EMT), que são ferramentas úteis para avaliar a eficácia das compostos terapêuticos. Pudéssemos mostrar em relação à cultura 2D uma redução da proliferação em nosso modelo de tumor em 3D que é related com a situação clínica. Apesar desta proliferação inferior, o modelo previu EGFR de respostas ao fármaco -targeted correctamente de acordo com o estado biomarcador como se mostra por comparação das linhas de células de carcinoma de pulmão HCC827 (EGFR -mutated, KRAS do tipo selvagem) e A549 (EGFR de tipo selvagem, KRAS - mutado) tratados com o inibidor da tirosina-gefitinib cinase (TKI). Para investigar as respostas de drogas de células de tumor mais avançadas, EMT induzida por tratamento de longo prazo com TGF-beta-1, tal como avaliado por vimentina / imunofluorescência pan-citoqueratina. Um fluxo-biorreator foi empregado para ajustar a cultura às condições fisiológicas, o que melhorou a geração de tecido. Além disso, vamos mostrar a integração de respostas de drogas após tratamento gefitinib ou TGF-beta-1 de estimulação - a apoptose, índice de proliferação e EMT - em um booleano no modelo silico. Além disso, explicamos como respostas de drogas de células de tumor com um fundo mutacional específico e contagemerstrategies contra a resistência pode ser previsto. Estamos confiantes de que o nosso 3D abordagem in vitro especialmente com sua expansão in silico proporciona um valor adicional para testes de drogas pré-clínicos em condições mais realistas do que na cultura de células 2D.

Introdução

A indústria farmacêutica está de frente para altas taxas de desgaste de até 95% no domínio do tratamento do cancro em fase clínica provocando enormes custos 1-5. Uma razão para este défice é o facto de, actualmente eficácia de potenciais novos compostos é avaliada em rastreios de grande escala em culturas de células em 2D de linhas de células de cancro ou em modelos animais. Os modelos animais têm uma complexidade maior, mas existem diferenças cruciais entre ratos e homens 6,7. Na última década, modelos de cancro em 3D usando diferentes abordagens têm sido gerados para preencher a lacuna entre a cultura 2D de linhas celulares de cancro e um complexo de 6,8,9 tumor vivo. O impacto do ambiente 3D na diferenciação celular e também na sinalização tem sido demonstrado em vários estudos anos atrás (por ex., Por Mina Bissell) 10,11. Hoje em dia, muitos modelos de cultura de células estão disponíveis em 3D, tais como culturas de esferóides, hidrogéis ou chips de microfluidos 12-16. Mesmo que Tse modelos aumentarão a complexidade em relação aos sistemas convencionais de cultura 2D, que principalmente carecem de um microambiente tecido que é conhecido por ter efeitos apoiando-tumorais e também impactos eficácia da droga.

Para abordar esta questão, geramos um modelo de tumor 3D baseado em um andaime biológico chamado SISmuc (do intestino delgado-submucosa + mucosa), que é derivado de um jejuno porcinos descelularizados. Deste modo, a arquitectura do tecido e os componentes importantes da ECM, tais como diferentes colagénios, bem como a estrutura da membrana basal são preservados 17. Esta característica única é crucial para a geração modelo de tumor de carcinomas que surgem a partir do epitélio e compreendem cerca de 80% de tumores sólidos. Além disso, a taxa de proliferação no nosso modelo de tumor da engenharia de tecidos é reduzida em comparação com as elevadas taxas artificialmente alcançados na cultura 2D. Como a proliferação é um parâmetro importante para avaliar a eficácia dos medicamentos, testes de drogas está habilitado no nosso modelo em mais semelhantecondições para in vivo tumores 17.

A fim de avaliar o potencial do nosso modelo para prever a eficácia do fármaco-dependentes biomarcador corretamente, os dados aqui presentes para duas linhas de células de câncer de pulmão diferentes que diferem em seu estado EGFR -biomarker. Este estado mutacional começou a ser determinado rotineiramente em pacientes com NSCLC. Tratamentos direcionados com TKI como o EGFR -inhibitor gefitinib contra tumores que carregam uma mutação ativando mostra EGFR resultados superiores em comparação com aqueles com quimioterapia à base de platina 18-21.

Nós estabelecemos várias técnicas de leitura que são relevantes para avaliar a eficácia do composto. Além disso, após a TGF-beta-1 a estimulação somos capazes de investigar as acções de compostos em células tumorais que iniciou o processo de EMT, que se pensa ser uma etapa importante na transformação maligna 22,23 e que está ligado à droga resistance 24.

O modelo de tumor 3D permitem monitorar as respostas específicas de células para tratamentos dirigidos, quimioterapia, ou combinações de fármacos com boa contrastes. Para melhorar ainda mais e acelerar droga triagem e encontrar resistência, isto é complementado por uma simulação em silico. Com base em algumas experiências, a resposta do tumor pode ser previsto no silício em relação ao resultado de uma ampla gama de medicamentos e suas combinações.

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Protocolo

1. bidimensional (2D) Cultura celular

  1. Comercialmente obter linha de células de tumor HCC827 (DSMZ). Cultura da linha celular de adenocarcinoma de pulmão HCC827 (EGFR mutante, KRAS do tipo selvagem) em meio RPMI-1640 suplementado com 20% de FCS. Alterar médio a cada 2 - 3 dias. Dividir as células duas vezes por semana. As células são usadas até que a passagem 20 seja atingido.
  2. Comercialmente obter tumor linha de células A549 (DSMZ). Cultura da linha celular de carcinoma do pulmão A549 (EGFR de tipo selvagem, KRAS mutado) em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de FCS. Realizar a cultura tal como indicado acima. As células são usadas até que a passagem 20 seja atingido.
  3. Testar as células regularmente (de 4 - 6 semanas) por contaminações, tais como a contaminação por micoplasma.
  4. A cultura de células A549 ou em lamelas de vidro HCC827
    1. Coloque uma lamela de vidro esterilizada em cada poço de uma placa de 24 poços usando uma pinça.
    2. Semente 50.000 células tumorais de ambas as linhas celulares em um volume de 500 ul nos poços comas lamelas de vidro, respectivamente.
    3. Cultivar as células até atingirem uma confluência de 70% sob condições de cultura padrão (37 ° C; 5% de CO 2). Durante este tempo, Aspirar o meio de idade, utilizando uma pipeta Pasteur e adicionar 500 mL de meio fresco a cada 2 - 3 dias de cultura.

2. Geração de Sistemas de Teste Tumor em um Biológica colágeno andaime

  1. Condições de cultura estática
    1. Gerar o decelularizado do intestino delgado-submucosa + mucosa (SISmuc) e corrigi-lo entre dois anéis de metal, os chamados coroas celulares, conforme descrito na publicação anterior 25.
    2. Semear as células de ambos os 100.000 células A549 HCC827 ou em um volume total de 500 ul para o lado dos antigos lúmen do intestino fixo em coroas de células.
    3. Permitir que as células tumorais a aderir durante 2 horas a 37 ° C, 5% de CO 2. Adicionar 1 ml de meio no interior da coroa de células e 1 ml de fora.
    4. Cultura do tumormodelo sob condições estáticas, a 37 ° C, 5% de CO 2 na incubadora durante 14 dias. Alterar meio de cultura a cada 2 - 3 dias. Portanto, Aspirar o meio com uma pipeta de Pasteur e pipeta de 1 ml fresco RPMI com a quantidade apropriada de FCS (A549: 10%, HCC827: 20%) no interior da coroa de células e 1,5 ml do mesmo meio exterior.
  2. Condições cultura dinâmica
    1. Configure o sistema de teste de tumor com a matriz decelularizado dentro das coroas celulares e semeadura de células como descrito na subseção 2.1.1 a 2.1.3.
    2. Cultura o modelo de tumor, em condições estáticas 37 ° C, 5% de CO 2 na incubadora durante 3 dias.
    3. Monte o biorreator autoclavado e inserir o SISmuc semeado conforme publicado anteriormente 25.
    4. Pipetar 45 ml de RPMI com a quantidade apropriada de FCS (A549: 10%, HCC827: 20%) para o balão e o dispositivo de amostragem se conectam sem agulha para o sistema de tubagem entre o biorreactor e abalão médio.
    5. Colocar o biorreactor na incubadora, ligá-lo à bomba e o modelo de tumor de cultura durante mais 14 dias, com uma constante de fluxo médio (3 ml / min) a 37 ° C, 5% de CO 2.
    6. Mudar o meio de cultura após 7 dias. Para isso, mover o bioreactor do incubador sob uma câmara de fluxo laminar. Aspirar o meio no frasco de suporte, utilizando uma pipeta de Pasteur. Levante o biorreator, enquanto a aspiração de se livrar do meio no sistema de tubulação. Pipetar 45 ml de meio fresco para o balão. Coloque o biorreator de volta para a incubadora e ligá-lo à bomba.

3. Tratamento do Modelo de tumor estáticas com gefitinib

  1. Cultura o modelo de tumor, como descrito na secção 2.1.
  2. No dia 11 de cultura, preparar RPMI / FCS com 1 gefitinib? M (2,5 ml para cada coroa celular). Aspirar a idade média dos poços usando uma pipeta de Pasteur e adicionar 1 ml de meio RPMI preparado / FCS / gefitinib dentro tele coroa de células e 1,5 ml do mesmo meio exterior.
    NOTA: A solução de estoque descongelado gefitinib pode ser armazenado a 4 ° C durante uma semana.
  3. Alterar o meio no dia 13 como descrito na subsecção 3.2.

4. Estimulação do Modelo de tumor estáticas com FTC-beta-1 para indução de EMT

  1. Cultura o modelo de tumor, como descrito na secção 2.1.
  2. Pelo dia 3 de cultura, preparar RPMI / FCS com 2 ng / ml de TGF-beta 1 com o transportador (2,5 ml para cada coroa de células). Aspirar a idade média dos poços usando uma pipeta de Pasteur e adicionar 1 ml de meio RPMI preparado / FCS / FTC-beta-1 no interior da coroa de células e 1,5 ml do mesmo meio exterior. Mudança de meio suplementado com FTC-beta-1 a cada 2 - 3 dias até 14 dias, conforme descrito em 4.2.

5. Leia-outs

  1. Recolha de amostras para medições de ELISA
    1. Recolher amostras dos sobrenadantes de estática (seção 2.1) e cultura dinâmica (ponto 2.2) duranteo tratamento com gefitinib (secção 3) nos dias 11-14 da cultura, tal como indicado na Figura 2. Para além disso, tomar uma amostra antes do tratamento (T0).
    2. Sob condições de cultura estática, tomar amostra de 100 ul a partir do interior da célula coroa. Sob condições de cultura dinâmica, o parafuso de seringa no dispositivo de amostragem e levar 1 ml de meio para fora do sistema de biorreactor. Armazenar todos os sobrenadantes recolhidos a -80 ° C até o ensaio ELISA é realizado.
  2. M30-ELISA para a Quantificação de Apoptose
    1. Para quantificar a apoptose nos sobrenadantes de realizar o ensaio de morte celular de acordo com as instruções do fabricante. Todos os reagentes para atingir a TA antes de realizar o ensaio.
    2. Vortex todos os reagentes. Dissolva o comprimido de lavagem em água deionizada fresco 500 ml. Dilui-se conjugado de HRP com 9,2 ml de tampão de diluição de conjugado e misturar. Pipetar 25 ul de padrão ou de amostra por poço.
    3. Adicionar 75 ml da HRP Conju diluídasolução portão por poço. Cobrir a placa e incubar-lo num agitador durante 4 h à TA. Lava-se a placa manualmente, 5 vezes com 250 ul de solução de lavagem preparada.
    4. Adicionar 200 ul de 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) a cada poço. Incubar no escuro a temperatura ambiente durante 20 min. Adicionar 50 ul de solução de paragem a cada poço. Agitar a microplaca durante 10 segundos e deixar a microplaca durante 5 min antes de ler a absorvância. Determinar a absorvância a 450 nm num leitor de microplacas. Calcula-se a curva padrão e as concentrações nas amostras utilizando um programa adequado para lidar com dados do tipo de ELISA tais como a origem.
  3. coloração amostra
    1. Fixação, parafina-incorporação e Seção Preparação do modelo 3D
      1. Fixar o SISmuc semeado com 2,5 ml de paraformaldeído a 4% (PFA) por coroa celular para 2 horas e incorporá-lo em parafina
      2. Preparar 3 uM secções de tecido para a coloração, tal como publicado anteriormente25.
    2. Fixação de células cultivadas em 2D Condições Cultura
      1. Quando 70% de confluência é atingido, lavar as células cultivadas sobre lamelas de vidro em placas de 24 poços uma vez com PBS e corrigi-los com 500 ul de 4% PFA / poço, durante 10 min.
      2. Remover PFA e armazenar as lamelas de vidro para o bem-placa coberta com PBS a 4 ° C até a coloração é realizada.
    3. H & E coloração
      1. Corar as secções re-hidratadas com Hematoxilina / Eosina como uma coloração visão geral de acordo com protocolos padrão.
    4. Coloração de imunofluorescência do modelo 3D
      1. Para coloração por imunofluorescência, realizar uma recuperação de antigénios, colocando as lâminas desparafinizadas e re-hidratadas numa panela a vapor pré-aquecido com tampão citrato (pH 6,0) durante 20 min.
        NOTA: Consulte a tabela de materiais e equipamentos de para a preparação de tampão citrato.
      2. Transferir as lâminaspara o tampão de lavagem (tampão PBS, 0,5 M + Tween a 0,5%), as secções do círculo com uma caneta PAP para minimizar o volume necessário para as soluções de coloração e coloque as lâminas numa câmara de humidade.
      3. Bloquear as secções de tecido com 5% de soro a partir das espécies de hospedeiros dos anticorpos secundários utilizados na alínea 5.3.4.6 durante 20 min à TA.
      4. Remover o soro de bloqueio agitando ligeiramente as lâminas com um lenço de papel e aplicar o anticorpo primário às secções cercados numa diluição, de acordo com as instruções do fabricante (coelho anti Ki67 1: 100, de coelho anti vimentina 1: 100, de ratinho anti pan-citoqueratina 1 : 100). Incubar O / N a 4 ° C. Para double-coloração, devem ser utilizados anticorpos primários de diferentes espécies hospedeiras.
      5. Lavar cuidadosamente off anticorpo não ligado com tampão de lavagem três vezes por 5 min.
      6. Para a detecção de ligações específicas de antigénio-anticorpo, anticorpos secundários aplicar na diluição de 1: 400 para as secções e incubar à temperatura ambiente durante 1 h.
      7. Lavar UnBanticorpo ound com tampão de lavagem três vezes durante 5 min.
      8. Montar as lâminas com um meio aquoso contendo DAPI para contracoloração núcleos e deixe-os secar O / N.
    5. Coloração por imunofluorescência de células cultivadas 2D
      1. Remover PBS e cobrir as lamelas de vidro semeada com 0,2% de Triton-X100 em PBS durante 5 min para a permeabilização. Lavam-se as lamelas de vidro com tampão de lavagem (tampão PBS, 0,5 M + Tween a 0,5%) durante 5 min.
      2. Execute as etapas de 5.3.4.3 a 5.3.4.7. Executar todos os passos do bem-placa sobre uma plataforma oscilante e remover os reagentes invertendo a placa.
      3. Para a montagem, detectar uma gota de meio aquoso contendo DAPI para contracoloração núcleos em uma lâmina de vidro revestido e não transferir a lamela a ele com as células de frente para o meio de montagem usando uma pinça. Deixe secar antes de imagem.
  4. Determinação do índice de proliferação
    1. execute imunofluorescênciamanchando contra Ki67 de acordo com a seção 5.3.4. ou 5,3 5.
    2. Tome imagens fluorescentes das secções de tecidos ou células cultivadas em 2D com um microscópio invertido. Use diferentes filtros para tirar imagens de colorações DAPI e de colorações Ki67. Para a quantificação, usar 10 imagens de secções 3D ou 5 imagens das culturas 2D (20x) de cada condição de partes não sobrepostas da amostra.
    3. Determinar o número de núcleos e o número de núcleos positivos para Ki67 em 2D
      1. Contagem Ki67 núcleos positivos manualmente usando o contador de células plug-in do software Fiji 26. Portanto, abra a imagem e clique em "Plugins" → "Analisar" → "Cell Contador". Pressione o botão "Iniciar" e selecione um tipo de contador. Clique em cada núcleo Ki67 positivo. O número de cliques é mostrado ao lado do tipo de contador selecionado.
      2. Para contagem de células automático do número total de núcleos criar uma macro usando Fiji 27,28. AdjUst a macro para cada linha de coloração e celular. A seguir, veja um exemplo de como criar uma macro.
        1. Comece gravador de macro. Abra uma imagem de DAPI e convertê-lo para o formato de 8 bits, clicando em "Imagem" → "Tipo" → "8-bit". Clique em "Melhore o contraste", definir "saturada" como "1" e "normalizar".
        2. Defina "máscara de nitidez" a nitidez da imagem. Usar um "raio" de "1" e uma "máscara" de "0,60". Clique em "limiar de auto", escolher o método de "RenyiEntropy" com "objetos brancos sobre fundo preto" para binarise a imagem.
        3. Clique em "Plugins" → "BioVoxxel" → "características irregulares divisor de águas" com um raio erosão do "5" para separar as células. Clique em "Analisar" → "Analisar Particles" e definir o "tamanho" para "0,02-Infinito".
          NOTA: O número de partículas / células émostrados na tabela de resumo como contagens.
        4. Clique em "Criar" para salvar macro para a análise de novas imagens.
    4. Determinar o número de núcleos e número de núcleos positivos para Ki67 em 3D manualmente, conforme descrito no subitem 5.4.3.1.
    5. Calcula-se a média índice de proliferação (PI), de acordo com a seguinte fórmula:
      figure-protocol-1
      n = número de imagens (3D: 10, 2D: 5)

6. In Silico Geração Tumor Modelo e Simulação de terapia anti-EGFR em células HCC827

  1. Generation Network usando um software de análise de rede
    1. Use diferentes bases de dados conhecidos para gerar a rede de tumor com base nos parâmetros experimentais importantes de leitura e do fundo mutacional da linha de células HCC827.
    2. Abra o software de análise de rede 21 para visualizar arede.
      1. Clique → "Novo" → tipo 'modelos' JoVE_tumor "File" → clique em "OK" para gerar uma nova rede. Clique em "Praça do close up do Norte" → "OK" para visualizar o receptor em uma membrana dupla. Clique em "Protein genérico" para visualizar os nós (= proteínas) como retângulos → tipo 'EGFR "→ clique em" OK "; repetir este procedimento para cada nó na rede.
      2. Rotular os nós na rede: clique com o botão direito → "Shape Change Color & ..." → selecionar para nós EGFR e (EGF-EGFR) código de cor "255,0,0" (cor vermelha); Para nós de c-MET e (c-MET) código de cor "0,255,0" (cor verde); para código de cor gefitinib "255,255,0" (cor amarela); para código de cor PI3K-INH "204204204" (cor cinza claro); para código de cor MEK-INH "102102102" (cor cinza escuro); para todos os outros nós no seleto código de cor rede4; 255,255,255 "(cor branca).
      3. Clique em "Fenótipo" para visualizar parâmetros ler-out como hexágonos → tipo 'proliferação "→ clique em" OK "→ clique com o botão direito → → selecione o código de cor" 255204204 "(salmão cor)" mudar de forma ... Cor & "; repetir este para o parâmetro apoptose → selecione a cor do código "255,51,204" (cor violeta).
      4. Visualize Edges (= interações): Clique em "Estado de Transição" para ativações (setas), clique em "inibição" de inibições (flechas embotadas); repetir este procedimento para cada interacção na rede.
    3. Clique em "Arquivo" → "Salvar como ..." → tipo 'JoVE_tumor models.xml "→ clique em" Save "para salvar a rede de sinalização gerada como XML formato.
  2. In Silico Simulação usando SQUAD
    NOTA: SQUAD representa the topologia da rede como um sistema discreto lógico Booleano (AND, OR, NOT) e executa uma análise de estado estacionário. A análise estado estável reflete o equilíbrio do sistema e a responsabilidade sobre estímulos de sinalização (por exemplo., A aplicação de drogas ou mutação).
    1. Abrir software SQUAD 17, clique em "Network Load" → de upload 'JoVE_tumor models.xml' arquivo. Clique em "análise Run":
      NOTA: Em seguida, aplica-se SQUAD função exponencial para interpolar a conectividade de rede booleana, que permite a simulação dinâmica do comportamento da rede ao longo do tempo (coloridas curvas de atividade sigmóide).
    2. Clique em "Avançado" → "Perturbator" para escrever um protocolo de simulação. Simular a resistência anti-EGFR: Clique em "Editar Protocolo"
      1. Clique em "perturbação" → usar padrão "initialState = SS-4" (estado estacionário 4) → Clique em "Adicionar" para adicionar "novo pulso Constant → Select parâmetro "estado" → "FLIP" Selecionar destino → Select tempo "0" → Select valor "0,4" → Clique em "OK".
      2. Repita isso: Clique em "Adicionar" → Seleccionar o parâmetro "estado" → Selecionar destino "c-MET" → Select tempo "0" → Select valor "0,4" → Clique em "OK"; Clique em "Adicionar" → Seleccionar o parâmetro "estado" → "gefitinib" Selecionar destino → Select tempo "0" → Select valor "1" → Clique em "OK".
      3. Defina um valor de estado de nó ativo (EGF-EGFR): Clique em "activenode" → Clique em "Editar" → Selecione o estado "0.8" → Clique em "OK"; para todos os outros nós: Clique em "Editar" → Selecione estado "0" → Clique em "OK". Clique em "OK" para salvar o protocolo.
      4. Exibir curvas específicas: Vá para o painel "Opções" → Escolha "(EGF-EGFR)", "* (EGF-EGFR)", "* MEK", "caspases", "(c-MET)", "PI3K", "gefitinib", "apoptose", "proliferação", "MEK-INH" e "PI3K-INH" para a representação gráfica. Clique em "Iniciar" → "Executar" para iniciar uma simulação completa de resposta do sistema. Clique em "Reset" para iniciar uma nova simulação.
    3. Simular PI3K combinada e tratamento inibidor MEK: Clique em "Editar Protocolo"
      1. Usar o mesmo parâmetro de nó, conforme descrito em 6.2.2.1 - 6.2.2.3. Clique em "perturbação" → Clique em "Adicionar" para adicionar "novo pulso Constant → Seleccionar o parâmetro" estado "→ Select target" PI3K-INH "→ Select tempo" 0 "→ Select valor" 1 "→ Clique em" OK "; Clique em "Adicionar"para adicionar "novo pulso Constant → Seleccionar o parâmetro" estado "→ Select target" MEK-INH "→ Select tempo" 0 "→ Select valor" 1 "→ Clique em" OK ".
      2. Clique em "OK" para salvar o protocolo. Vá para o painel "Opções": Use mesmos nós de representação gráfica conforme descrito em 6.2.2.4. Clique em "Iniciar" → "Executar" para iniciar uma simulação completa de resposta do sistema. Clique em "Reset" para terminar a simulação.

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Resultados

Na base do andaime SISmuc (Figura 2A a C), foi estabelecido um protocolo de funcionamento normalizado para a geração, a estimulação e tratamento de um sistema de teste do tumor 3D (Figura 2D). Este modelo permite a determinação do índice de proliferação e a quantificação da apoptose utilizando M30-ELISA, como mostrado na Figura 1 e Figura 3, respectivamente. A Figura 3 mostra representativa H & E de ...

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Discussão

Nós estabelecemos um combinado in vitro / in sistema de teste tumor silico para previsões de tratamento guiado por biomarcadores. O modelo in vitro avalia diferentes aspectos importantes de acções compostos, tais como mudanças de proliferação de células tumorais e a apoptose em um fundo mutacional específico, que também pode ser simulada in silico 17. Aqui, apresentamos o protocolo padronizado para 3D geração de modelo de tumor e teste composto incluindo a quantificação da ...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi patrocinada pelo Centro Interdisciplinar de Investigação Clínica (IZKF, BD247 concessão) do Hospital Universitário de Wuerzburg eo programa Bayern Fit (concedido a Heike Walles).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Presidente de Biorreatoresde Engenharia de Tecidos e Medicina Regenerativa, Wü rzburg (GER)Configuração do biorreator
BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji)Jan Brocher, Thorsten Wagner, https://github.com/biovoxxel/BioVoxxel_Toolbox
Cell crownsPresidente de Engenharia de Tecidos e Medicina Regenerativa, Wü rzburg (GER)para cultura 3D estática
CellDesignerhttp://www.celldesigner.org/-Este software foi usado para desenhar a rede.
Solução de estoque tampão de citrato (10x)em produção42 g/L Ácido cítrico monohidratado, 17,6 g/L Pastilhas de hidróxido de sódio em água deionizada, pH 6,0, armazenadas em RT. 
Solução de trabalho de tampão de citratona produçãoSolução de estoque tampão de citrato a 10% em água desmineralizada, armazenada em RT.
Ácido cítrico monohidratadoVWR, Darmstadt (GER)1002441000usado para o tampão citrato
LamínulasVWR, Darmstadt (GER)631-1339
DAPI Fluoromount-GTMSouthernBiotech, Birmingham (EUA)SBA-0100-20
Bancos de dados como KEGG, HPRD e QIAGEN (Genes & Caminhos)http://www.genome.jp/kegg/pathway.html; http://www.hprd.org/; https://www.qiagen.com/de/geneglobe/-Diferentes bancos de dados da literatura conhecida foram usados para gerar a topologia da rede.
Camiseta Feminina Estilo Luer LugMednet, Mü Configuração dobiorreatorFTLT-1
Estilo de rosca Luer fêmea com rosca hexagonal de 5/16" para rosca UNF de 1/4-28Mednet, Mü nster (GER)SFTLL-J1A Configuração do biorreator
Soro fetal de bezerroBio& SELL, Feucht (GER)FCS. ADD.0500não inativado por calor
GefitinibAbsource Diagnostics GmbH, Mü nchen (GER)S1025-100 mg100 mM solução de estoque com DMSO
Balão de vidro (Schott, GER) fornecido com conexão de mangueira de vidroWeckert, Kitzingen (GER)feito sob medida
Histofix 4% (Paraformaldeído)Carl Roth, Karlsruhe (GER)P087.1
Acoplamento de mangueiraMednet, Mü Configuração dobiorreatorCC-9
Incubadora para biorreatoresPresidente de Engenharia de Tecidos e Medicina Regenerativa, Wü rzburg (GER)Configuração do biorreator
M30 CytoDeathTM ELISAPeviva, Bromma (SWE)10900
Anel de Trava Integral Luer MachoMednet, Mü nster (GER)MTLL230-J1AConfiguração do biorreator
Câmara de umidadefeita
Mouse anti Pan-CitoqueratinaSigma-Aldrich, Munique (GER)   C2562-2MLClone C-11 + PCK-26 + CY-90 + KS-1A3 +M20+A53-B/A2, usado 1/100 para imunofluorescência
Válvula Swabable sem agulha Fêmea LuerMednet, Mü nster (GER)NVFMLLPCConfiguração do biorreator, para amostragem, O-Ring esterilizado por gama
MVQ 10 vermelho 37 x 3 mmArcus Dichtelemente, Seevetal (GER)21444O-ring grande, configuração do biorreator
O-Ring MVQ 70 vermelho 27 x 2,5 mmArcus Dichtelemente, Seevetal (GER)19170O-ring pequeno, configuração do biorreator
caneta PAPDako, Hamburgo (GER)S002
ParafinaCarl Roth, Karlsruhe (GER)6642.6
Bomba peristálticaIsmatec, Wertheim-Mondfeld (GER)Configuração do biorreator
Tamponamento de fosfato SalinoSigma-Aldrich, Munique (GER)   D8537-6x500ml
de tubulação de bombaIsmatec, Wertheim (GER)IS 3710Configuração do biorreator
Rabbit anti Ki67Abcam, Cambridge (Reino Unido)ab16667Clone SP6, usado para 1/100 para IF
Rabbit anti VimentinAbcam, Cambridge (Reino Unido)ab92547usado 1/100 para
IF RPMI-1640 mediumLife technologies, Darmstadt (GER)61870-044quente em 37 > C banho-maria antes do uso
Tubo de siliconeCarl Roth GmbH, Karlsruhe (GER)HC66.1Configuração do biorreator
Hidróxido de sódioSigma-Aldrich, Mü nchen (GER)30620-1KG-Rutilizado para o tampão citrato
SQUADhttp://sbos.eu/docu/docu/SQUAD/doku.php.htm-Estesoftware foi utilizado para a realização das simulações semiquantitativas.
Filtro de ar estéril, tamanho de poro 0,2 µ mSartorius Stedium Biotech, Gö ttlingen (GER)16596-HYKConfiguração do biorreator
Seringa Luer Lok 5 mlBD Biosciences, Heidelberg (GER)309649para amostragem de biorreator
Placas de teste de cultura de tecidos: 6-,          12, 24, 96 poçosTPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen (GER)92006, 92012, 92024, 92048
Fator de crescimento transformador-beta 1 (TGF-β 1) com CellSignaling, Frankfurt (GER)8915LCsolução estoque em tampão citrato estéril pH 3,0
Triton X-100Sigma-Aldrich, M & uuml; nchen (GER)X100-1L
Tween-20Sigma-Aldrich, Mü nchen (GER)P7949-500mlpara tampão de lavagem de coloração imunofluorescente
interna interna nster (GER)nster (GER)sob medida

Referências

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