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Isolamento e diferenciação de células tronco derivadas de tecido adiposo de Suínos Subcutânea tecidos adiposos

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DOI:

10.3791/53886

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31 de março de 2016

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1Institute of Biotechnology, National Taiwan University, 2Department of Animal Science and Technology, National Taiwan University, 3Department of Surgery, National Taiwan University Hospital and College of Medicine

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve o isolamento de células-tronco derivadas do tecido adiposo de porco (pADSC) de tecidos adiposos subcutâneos com exame de multipotência. O pADSC multipotente é usado para delinear processos de diferenciação de adipócitos e estudar a transdiferenciação em múltiplas linhagens celulares de mesênquima mesodérmico ou outras linhagens de ectoderma e endoderme para estudos regenerativos.

Resumo

A obesidade é uma epidemia mundial irrestrita. Desvendar os controles moleculares no desenvolvimento do tecido adiposo é promissor para tratar a obesidade ou o diabetes. Embora numerosas linhagens celulares adipogênicas imortalizadas tenham sido estabelecidas, as células-tronco derivadas do tecido adiposo derivado da fração vascular estromal dos tecidos adiposos brancos subcutâneos fornecem um sistema celular confiável ex vivo muito mais próximo do desenvolvimento adiposo in vivo. As células-tronco derivadas do tecido adiposo de porco (pADSC) são isoladas de leitões de 7 a 9 dias de idade. O depósito de gordura branca dorsal dos tecidos adiposos subcutâneos suínos é fatiado, picado e digerido pela colagenase. Esses pADSC exibem forte potencial para se diferenciar em adipócitos. Além disso, o pADSC também possui multipotência, avaliada por marcadores seletivos de células-tronco, para se diferenciar em vários tipos de células mesenquimais, incluindo adipócitos, osteócitos e condrócitos. Esses pADSC podem ser usados para esclarecimento de interruptores moleculares na regulação da diferenciação clássica de adipócitos ou na direção para outros tipos de células mesenquimais de origem mesodérmica. Além disso, linhagens estendidas em células de origem ectodérmica e endodérmica foram alcançadas recentemente. Portanto, o pADSC derivado neste protocolo fornece uma fonte abundante e avaliável de células-tronco mesenquimais adultas com total multipotência para estudar o desenvolvimento adiposo e a aplicação à engenharia de tecidos da medicina regenerativa.

Introdução

A obesidade, presente em cerca de 30% da população dos EUA, com um índice de massa corporal superior a 30, tem emergido como um fenómeno mundial prevalente 1. A obesidade tende a levar a complicações relacionadas, incluindo doenças cardiovasculares, diabetes tipo 2 e câncer 2-4. Portanto, lidar com a obesidade é uma prioridade importante. A obesidade se manifesta por expansão massiva do tecido adiposo, e é atribuída ao consumo excessivo de alimentos e um estilo de vida sedentário na sociedade moderna. Assim, decifrar a regulação transcricional da adipogênese e lipogênese poderia ser promissora para o tratamento de obesidade ou diabetes 5.

O 3T3-L1, 3T3-F442A e outras linhas celulares de ratinho adipogênica ter sido aplicado para estudar a adipogénese lipogénese ou durante o desenvolvimento do tecido adiposo. No entanto, existem algumas discrepâncias nos mecanismos de regulação, entre as linhas celulares in vitro e animais in vivo 6. Primária adiposo-Dericélulas estaminais ved (adsc) na fracção de células estromal-vascular podem ser isolados directamente a partir de tecidos adiposo branco e induzidas para se diferenciarem. A diferenciação de adipocitos em ADSC mais provável recapitula o processo de adipogénese e lipogénese em desenvolvimento do tecido adiposo in vivo 7.

Os porcos são um modelo animal adequado para o estudo e a adipogénese lipogénese em desenvolvimento do tecido adiposo. Os nossos estudos anteriores suína 8-10 demonstram que a expressão do factor de transcrição de esterol reguladora 1c de ligação ao elemento (SREBP1c), um importante factor de transcrição conhecido para modular a transcrição de sintase dos ácidos gordos lipogénica, é inibido por ácidos gordos poli-insaturados (PUFA) no fígado porcino e tecidos adiposos. A expressão de SREBP1c porcina diminuiu PUFA in vivo e in vitro é semelhante ao de outras espécies tais como seres humanos e ratos 11-13. Estes estudos de suínos in vitro são principalmente em diffadipócitos erentiated derivados de ADSC porcino (pADSC). Portanto, esta cultura celular primária de pADSC pode ser utilizada para servir como um sistema celular de confiança para estudar o desenvolvimento do tecido adiposo ou outras aplicações de células estaminais.

Protocolo

Nota: Este método tem sido estabelecidos e utilizados em pesquisas relatado anteriormente 14-17 a este laboratório; ao longo do tempo a metodologia foi modificada. O actual procedimento foi realizado utilizando uma média de 60 g de tecido adiposo subcutâneo suína de um leitão (7 a 9 dias de idade) com sementeira em placas de 6 poços de cultura de tecidos. Todos os procedimentos foram realizados à temperatura ambiente a menos que designado de outra forma. Todas as experiências com animais foram aprovados pelo Comitê de Animal Institucional Cuidado e Uso (IACUC) da Universidade Nacional de Taiwan.

1. Prepare Digestão Médio

  1. Obter tecidos adiposo subcutâneo do pescoço e costas; 40 a 80 g por leitão (7 a 9 dias de idade), dependendo do tamanho dos porcos. Aqui, use 60 g de tecido adiposo subcutâneo obtidos a partir de um porco.
  2. Preparar o meio digestão: pesar colagenase II em pó com um total de 54.000 unidades e dissolvê-lo em 90 ml Modified Eagle Médium da Dulbecco (DMEM,para 60 g de gordura) num frasco de 100 ml serológica (900 unidades de colagenase / 1,5 ml de DMEM / g de gordura).
  3. Agitar suavemente o meio de digestão num agitador de tapete (100 rpm) durante pelo menos 15 min para dissolver e depois passar o meio de digestão através de um filtro de 0,22 um para esterilização. Armazenar a 4 ° C antes do uso.

2. Dissecar adiposo subcutâneo tecidos de suínos

  1. Esterilizar todos os instrumentos, vidro e utensílios de plástico e quente toda a mídia para 37 ° C antes do uso.
  2. Sacrificar o leitão com elétrica sangria deslumbrante e ou usando um método de acordo com as regulamentações locais IACUC. Realizar dissecção cuidadosa e imediatamente após os leitões são sacrificados.
  3. Coloque o leitão sobre uma mesa cirúrgica limpa (de volta para cima e barriga para baixo). Raspar o cabelo do leitão volta remover todos os pêlos do pescoço à cauda e em ambos os lados para baixo para a linha média.
  4. Esfregar a pele dorsal do porco com 7,5% de povidonaiodo três vezes (com três novos-esfrega independentes) e, em seguida, permitir que o iodo para sentar-se na superfície da pele por cerca de 10 min.
  5. Remova a iodopovidona com vários sprays de 70% de etanol. Use compressas de gaze ou papéis de tecido contendo 70% de etanol para limpar a pele numa direcção, sendo repetido até não se observa qualquer cor óbvia de povidona-iodo.
  6. Use um bisturi para separar a camada dorsal de gordura suína em tecidos adiposos subcutâneos, juntamente com a camada de pele em anexo dos músculos, mantendo-se a gordura e pele usando uma pinça.
  7. mergulhar imediatamente a camada de gordura dos tecidos adiposos subcutâneos com a pele ligado num copo esterilizado (200 ml) contendo DMEM isento de soro.
  8. Pulveriza-se a fora da proveta contendo a camada de gordura com 70% de etanol e no lugar de um capuz de cultura de célula de fluxo laminar. Coloque uma grande (40 cm x 30 cm) esterilizado folha de cobertura de camada tripla na capa. [Uma camada tripla é usado para assegurar a integridade contínua.]
  9. Coloque otecido com a pele virada para baixo sobre a folha de rosto.
  10. Aparar o tecido muscular remanescente fora do tecido adiposo usando fórceps e tesouras para evitar a contaminação com o tecido do músculo.
  11. Cortar a gordura em pedaços quadrados (~ 7 cm x 7 cm) com um bisturi ou tesoura. Colocar estas partes da camada de gordura para um novo recipiente esterilizado (200 ml) contendo DMEM isento de soro.
  12. Definir um suporte de fatia personalizado na folha de cobertura montado com uma lâmina de cortador de aço de carbono (Figura 1). Pegue um pedaço de gordura para fora do copo e coloque-o na (camada de pele na camada superior e gordura abaixo) slicer.
  13. Cortar a camada de gordura do tecido adiposo subcutâneo em aproximadamente um milímetro de espessura peças. Cortar a camada de gordura da pele tão próxima quanto possível, mas evitar cortar a pele.
  14. Mince cortado tecidos adiposos com uma tesoura o mais fino possível.
  15. Adicionar meio de digestão contendo colagenase filtrada para um balão de Erlenmeyer de 250 mL ou um frasco com serológica picadatecidos adiposos (54.000 unidades de colagenase / 90 ml DMEM / 60 g de gordura).
  16. Incubar e agitar o frasco de Erlenmeyer a 45 rpm num agitador orbital durante 90 min a 37 ° C para permitir a colagenase para digerir os tecidos.
    Nota: Verifique a cada 15 a 30 minutos para evitar o excesso de digestão. O processo de digestão é completada se o meio de digestão é uma pasta sem aglomerados de tecido significativos.
  17. Adicionar um volume igual (igual ao meio de digestão) de meio de cultura contendo DMEM / F12 com 10% de soro fetal de bovino (FBS) para parar a digestão com colagenase.

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Figura 1. Um cortador de personalização utilizados para o isolamento de pADSC. Dissecada de tecidos adiposos dorsais porcino tecidos adiposo subcutâneo são compostos da camada de gordura da pele com camadas unidas. Um cortador é necessário para cortar a camada de gordura de aproximadamente 1 mm de espessura e evitar a excessivacorte em camadas da pele. Da esquerda para a direita: o titular fatia, almofada slicer, lâmina de carbono cortador de aço, e os parafusos. Lâmina Slicer é inserido entre o titular fatia e pad slicer quando montado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Recolha de pADSC da fracção do estroma-vascular

  1. Passar o meio de digestão contendo os tecidos adiposos digeridas por meio de uma única camada de tecido de seda para um Erlenmeyer de 250 mL esterilizado frasco limpo ou um frasco de 250 ml serológico. Use uma pinça para pressionar a meio do chiffon para orientar e auxiliar a passagem do digerir.
  2. Escorra e torcer o chiffon com uma pinça para completar a passagem.
  3. Distribuir o meio de digestão em quatro tubos de 50 ml de centrífuga cónicos (~ médias 40 ml por tubo).
  4. Centrifuga-se a 700 xg durante 10 min para recolher o sedimento de células do estroma vascular.
  5. Decantar o sobrenadante sem perturbar os sedimentos para remover a maior parte da camada de topo contendo gordura adipócitos maduros. Lava-se a pelete por adição de 10 ml de DMEM a cada tubo para ressuspender o sedimento com pipetagem e agitação suave do tubo.
  6. Centrifugar a 700 g durante 6 min. Decantar o sobrenadante.
  7. Adicionar 10 ml de tampão de lise ACK e em seguida ressuspender o sedimento por pipetagem. Deixar repousar durante 7 minutos (5 a 10 min) à temperatura ambiente para lisar as células vermelhas do sangue na fracção do estroma vascular.
  8. Adicionar quantidades iguais de DMEM (10 ml) para parar a reacção com agitação suave do tubo, e depois centrifugar a 700 xg durante 10 min.
  9. Decantar o sobrenadante, adicionar 10 ml de DMEM a cada tubo, ressuspender o sedimento com pipetagem repetida, e centrifugar a 700 xg durante 6 minutos. Repita duas vezes.
  10. Recolha e passar o DMEM (total de 40 ml DMEM a partir de 4 tubos representativas de 60 g de gordura) com células em suspensão através de um filtro de 100 um em um novo tubo de 50 ml.
  11. Gentilmente medi pipetaUM várias vezes para misturar bem e alíquota de 20 ul de meio contendo células misturada com 180 ul de solução de azul de tripano a 0,4% (diluição 1:10) em um novo tubo Eppendorf de 1,5 ml.
  12. Contar as células com um hemocitómetro e, em seguida, pADSC semente a uma densidade de 60.000 células / cm2 num tamanho desejado da placa de cultura ou placa com meio de cultura contendo DMEM / F12, 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 1% de antibióticos de penicilina solução B -streptomycin-anfotericina (P / S / A). Geralmente, a semente pADSC sobre as placas de 6 poços para cultura de tecidos de adipócitos ou diferenciação osteócito. Semear o pADSC em pratos de 10 cm para coloração marcador de superfície de células-tronco ou a diferenciação de condrócitos.
  13. Incubar as placas ou pratos no 37 ° C em incubadora de ar com 5% de CO 2 para permitir a fixação das células às placas.

4. Identificação marcadores de superfície de células-tronco de pADSC por citometria de fluxo

  1. Após 24 horas, retire o meio completamente, lave the 10 cm de placa duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS), e células de colheita com 1 ml de 0,25% de tripsina-EDTA durante 5 minutos a 37 ° C.
  2. Neutralizar tripsina-EDTA com quantidades iguais de meio de cultura (1 ml), recolher as células em um novo tubo cónico de 15 ml, e, em seguida, centrifugar a 400 x g durante 7 minutos.
  3. Decantar o sobrenadante. Lava-se a pelete duas vezes em 3 ml de tampão de SBF-lavagem arrefecido com gelo (PBS contendo 10% de FBS) usando re-suspensão por pipetagem acoplado com centrifugação a 400 xg durante 7 minutos.
  4. Ressuspender, contar, e ajustar a pADSC 10 6 células / ml em tampão de SBF-lavagem arrefecido com gelo. células de localização (100 ul / cada tubo) em vários novos tubos cónicos de 15 ml e incuba-se tubos contendo pADSC a 4 ° C durante 30 min com anticorpos contra ambos os CD4a conjugado com ficoeritrina (CD4a-PE), CD29-PE, CD31-PE , CD44-PE, CD45-PE, CD90-PE, MHC I-PE ou de MHC II-PE para a coloração directa. Parar a reacção por lavagem das células duas vezes em 10 ml de tampão de SBF-lavagem juntamente com 400 × g centrifugatíon para 7 min.
  5. Fix e ressuspender as células em tampão de fixação (PBS com 0,01% de FBS e 1% de formaldeído) para citometria de fluxo de acordo com as instruções do fabricante e a nossa publicação anterior 18.

5. Diferenciação de pADSC em adipócitos, osteócitos e condrócitos

  1. A diferenciação de adipocitos em pADSC
    1. Prepare meio de indução de adipócitos e meio de manutenção dos adipócitos
      1. Por meio de indução de adipócitos, preparar 1 L de livre de soro de DMEM / F12 (com antibióticos de 1% de P / S / A) contendo o seguinte: 1 ml de caldo de insulina (10 mg / ml de tampão de HEPES, pH 8), concentração final = 10 ug / ml; estoque 1 ul T3 (3,3 ', 5-triiodo-L-tironina, 1 mM em DMSO), concentração final = 1 nM; Da transferrina 200 uL (50 mg / ml de H 2 O destilada duas vezes), ácido clorídrico cone definitiva = 10 ug / ml; 100 ul da dexametasona (10 mM em etanol), concentração final = 1 uM; 100 ul da rosiglitazona (10 mM em DMSO), concentração final= 1 uM.
      2. Prepare meio de manutenção dos adipócitos com as mesmas adições como o meio de indução, mas com omissão de dexametasona.
    2. processo de diferenciação de adipócitos
      Nota: Após espalhar pADSC em placas de 6 poços, pADSC será confluentes em 72 h.
      1. Após 3 dias, remover completamente o meio e, em seguida, adicionar 3 ml de meio de indução de adipocitos em cada poço. Voltar as placas para a incubadora. Este é o dia zero de diferenciação.
      2. Após 3 dias, remover o meio de indução de adipócitos completamente e substitua com 3 ml de meio de manutenção de adipócitos de três em três dias. adipócitos maduros será terminalmente diferenciadas em cerca de 9 dias. Mais de 90% dos adipócitos são bem diferenciadas com este protocolo. Estes adipócitos estão prontos para Oil Red O coloração.
  2. Diferenciação de pADSC em osteócitos
    1. Prepare meio de indução osteócito: mediu cultura completom (DMEM / F12 com 10% de FBS e 1% de P / S / A) contendo 1 uM de dexametasona, mM β-glicerofosfato 10 e 50 ug / ml de ascorbato-2-fosfato.
    2. processo de diferenciação para osteocytes
      Nota: Após espalhar pADSC em placas de 6 poços, pADSC será confluentes em 72 h.
      1. Após 3 dias, remover completamente o meio e adicionar 3 ml de meio de indução osteócito em cada poço. Voltar as placas à temperatura de 37 ° C incubadora. Este é o dia zero de diferenciação.
      2. Substitua-o por meio de indução osteócito cada três dias. osteocytes maduros formará por 14 dias de diferenciação. Estes osteócitos estão prontos para Alizarina S coloração.
  3. Diferenciação de pADSC em condrócitos
    1. Prepare meio de indução de condrócitos: aMEM contendo 1% de FBS, 6,25 ug / ml de insulina, 50 ^ g / ascorbato-2-fosfato ml, e 10 ng / ml de factor de crescimento transformante-β1.
    2. processo de diferenciação de condrócitos
      1. Após espalhar pADSC em placas de cultura de 10 cm, durante 24 h, remover o meio de cultura completamente e lavar pratos duas vezes com PBS.
      2. Tripsinizar pADSC com 1 ml de 0,25% de tripsina-EDTA durante 5 minutos, e depois neutralizou-se com meio de cultura de 1 ml. Recolha, contar e ajustar pADSC em tubos de 15 mL cónico, com uma densidade de 2,5 x 10 5 células por tubo. Use um hemocitômetro para contar as células.
      3. Após centrifugação a 400 x g durante 7 minutos, rejeitar o sobrenadante sem perturbar o sedimento e adicionar 1 ml de meio de indução de condrócitos em um tubo de 15 ml. O tubo é devolvido à 37 ° C incubadora. Este é o dia zero de diferenciação.
      4. Substituir o meio de indução de condrócitos de três em três dias, sem a remoção de células na parte inferior. condrócitos maduros irá formar em aproximadamente 14 dias. Estes condrócitos estão prontos para o Azul de Toluidina O coloração.

6. Coloração de adipócitos diferenciados, Osteocytes e condrócitos

  1. Oil Red O para coloração adipócitos diferenciados
    1. No dia 9, remover o meio de manutenção de adipocitos em 6 poços de cultura de placas com adipócitos diferenciados e, em seguida, lava-se a placa duas vezes com PBS. [Nos passos seguintes, designadas adicionar reagentes suficientes para cobrir cada poço da placa de 6 poços.]
    2. Fix adipócitos com solução de formalina a 10% durante pelo menos 10 min.
    3. Remover a solução de formalina a 10% e lava-se a placa duas vezes com água duplamente destilada.
    4. Depois de duas lavagens, adiciona-se 100% de propileno glicol para a placa de cultura e deixar repousar durante 1 min.
    5. Remover a 100% de propileno glicol e, em seguida, adicionar solução de Oil Red O (0,5% em propilenoglicol) à placa de cultura. Deixe repousar por pelo menos 10 min num agitador oscilante com agitação suave (100 rpm).
    6. Remover a solução de Oil Red O e, em seguida, substitua-o por 60% de propileno glicol. Deixe repousar por 1 min.
    7. Remover a 60% de propileno glicol e, em seguida, lava-se a placa duas vezes com dágua ouble-destilada.
    8. Substitua com solução de formol a 10%. As gotículas lipídicas manchadas dentro dos adipócitos estão prontos para a observação por microscopia de luz.
    9. Quantificação de intracelular Oil Red O (passos opcionais abaixo): após observação microscópica, remover 10% de solução de formalina e lavar a placa duas vezes com água duplamente destilada.
    10. Drenar a placa completamente e adicionar 500 mL de isopropanol para a placa de 6 poços.
    11. Deixe isopropanol ficar na placa de 6 poços, num agitador basculante suave (100 rpm) durante pelo menos 10 min para dissolver o corante Oil Red O. de
    12. Aspirar o isopropanol contendo Oil Red O e distribuir sobre uma placa de 96 poços. Quantificar o extraído Oil Red O utilizando uma leitura espectrofotométrica a 510 nm.
  2. coloração Alizarina Red S para osteocytes diferenciado
    1. No dia 14, remover o meio de indução osteócito a partir de placas de 6 poços com osteócitos diferenciadas e lavar as placas duas vezes com PBS. [Nos following passos, adicionar os reagentes designados suficientes para cobrir cada poço da placa de 6 poços.]
    2. Fix osteócitos em solução de formalina a 10% durante pelo menos 10 min.
    3. Remover a solução de formalina a 10% a partir de cada cavidade e lavar a placa duas vezes com água duplamente destilada.
    4. Depois de duas lavagens, adiciona-se 2% de solução de vermelho de alizarina S (pH = 4,1-4,3) para a placa de 6 poços e deixar repousar durante pelo menos 15 minutos num agitador basculante suave (100 rpm).
    5. Remover a solução de Vermelho de Alizarina S e, em seguida, lava-se a placa duas vezes com água duplamente destilada.
    6. Substitua com solução de formol a 10%. Osteócitos estão prontos para a observação por microscopia de luz.
  3. Azul O coloração Toluidine para condrócitos diferenciados
    1. No dia 14, o meio de indução de condrócitos aspirado a partir do tubo de 15 ml sem remover sedimentos de condrócitos diferenciados na parte inferior do tubo e lavar o tubo, duas vezes com PBS. [Nas etapas a seguir, adicionar os reagentes designados suficientes para coveR condrócitos no fundo do tubo ou sobre a secção de corrediça.]
    2. Fix condrócitos em solução de formalina a 10% durante pelo menos 10 min.
    3. Remover a solução de formalina a 10% a partir de cada tubo de lavagem e o tubo, duas vezes com água duplamente destilada.
    4. Depois de duas lavagens, pastilhas incorporar em OCT e Composto secção com um criostato com uma espessura de 5 um.
    5. Manchar o slide das seções criostato com Azul de Toluidina O solução (0,1% com pH 4.1).
    6. Remover Azul de Toluidina O solução e, em seguida, lava-se a secção de duas vezes com água duplamente destilada.
      Nota: Os condrócitos em slides estão prontos para a observação por microscopia de luz.

Resultados

O pADSC derivada de porco gordo subcutâneo dorsal foram semeadas em placas de cultura ou pratos e mostrado na Figura 2. A morfologia do pADSC derivada a partir da fracção do estroma vascular é semelhante ao rato ou ADSC humano. Vinte e quatro horas após a sementeira, subconfluentes pADSC são aderidas e têm uma morfologia (Figura 2A) do tipo fibroblastos expandidos. O pADSC vai se tornar confluentes no prazo de 72 h e estão prontos para adipócitos ou outro tipo mesenquimal diferenciação (Figura 2B). pADSC apresentam um forte potencial adipogênica após a indução química e adipócitos maduros pode ser observada após 9 dias de diferenciação com mais de 90% dos pADSCs mostrando diferenciação adipogênica (Figura 2C).

Para abordar as características de pADSC derivado neste protocolo, marcadores de superfície de pADSC foram avaliados por citometria de fluxo analysis. Como mostrado na Figura 3, marcadores de superfície de células estaminais mesenquimais, incluindo CD29, CD44, CD90 e MHC I (ou I de HLA), foram altamente expresso. Marcadores de superfície negativas, tais como CD4a, CD31, CD45 e MHC II (ou HLA II) eram praticamente indetectável no pADSC derivado no protocolo (Figura 3). Estes resultados demonstram que essas características de células-tronco pADSC exposição do tipo mesenquimal sem endotelial significativa ou contaminação de células estaminais hematopoiéticas, incluindo mielóides ou linfóides progenitoras.

Para confirmar ainda que pADSC representam células-tronco mesenquimais, o multipotency de pADSC foi examinado por diferenciação em adipócitos, osteócitos e condrócitos. Estes adipócitos, condrócitos e osteócitos foram coradas por corantes específicos, Oil Red O, Vermelho de Alizarina S, e Azul de Toluidina O, respectivamente (Figura 4). Estes dados indicam que este protocolo gerado pADSC que manteve multipotency com características completas que se assemelham a células progenitoras mesenquimais de tipo.

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Figura 2. Morfologia do pADSC de suíno volta região gordura. (A) subconfluentes pADSC aderiu e ampliado após 24 h de semeadura em uma placa de cultura de 6 poços. (B) pADSC tornou-se confluentes depois de 72 h a sementeira numa placa de cultura de 6 poços. Foram observadas adipócitos (C) maduras após 9 dias de diferenciação adipogênica de pADSC. As imagens foram tiradas ampliação de 100 x usando microscopia de contraste de fase. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3. A identificação de células-troncomarcadores de superfície para pADSC. Fizeram-se reagir 1 x 10 5 de pADSC com anticorpos específicos e analisadas para marcadores de células estaminais por análise de citometria de fluxo. Os números indicam a percentagem de células coradas na população (vermelho) comparado com o controlo não coradas. O eixo x representa a intensidade de fluorescência relativa. O eixo y representa a população de células. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4. Multipotentes diferenciação de pADSC. Multipotency de pADSC foi determinada por diferenciação em adipocitos pADSC (A), (B) (C) osteócitos e condrócitos coradas por corantes representativos, Oil Red O, Vermelho de Alizarina S, e Azul de Toluidina O, respectivamente . Eu sou umges foram tomadas no (A) 100 x, (B) 200 x, e (C) 100 x ampliação usando microscopia de contraste de fase, respectivamente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Aqui nós apresentamos um sistema celular confiável para estudar o desenvolvimento do tecido adiposo em cultura celular primária de pADSC. Em comparação com outras linhas de células imortalizadas, este método proporciona um meio conveniente para isolar grandes quantidades de células estaminais mesenquimais adulto de alta qualidade que pode ser aplicado para estudar processos de diferenciação de adipócitos ou outras linhagens mesenquimais relacionadas com o desenvolvimento de animais in vivo. O passo crítico neste protocolo modificado é que derivam pADSC usando um leitão de idade de 7 a 9 dias, porque é fácil de manipular o leitão pequeno em comparação com os porcos mais velhos e semelhante a outras espécies de 19,20, o rendimento e multipotência de pADSC diminui à medida que as 21 idades de porco.

fontes de células-tronco potenciais incluem células estaminais embrionárias (ESC), células-tronco pluripotentes induzidas (IPSC), e células-tronco adultas pós-natais. A restrição de ADSC, classificados como células-tronco multipotentes adultas, é que multipotency de células estaminais adultasna diferenciação de linhagens divergentes é relativamente limitada em comparação com o ESC ou da IPSC. No entanto, questões éticas relacionadas com derivação da ESC e oncogênicos propriedades de iPSC restringir a aplicação da ESC e iPSC 22,23. Portanto, numerosos investigadores concentraram-se em células-tronco adultas com os esforços para melhorar a pluripotência. A fonte mais comum de células adultas mesenquimais (CTM), que tem sido muito estudada, é osso células-tronco mesenquimais derivadas da medula 24. No entanto, a colheita de medula óssea é considerada um procedimento relativamente doloroso. Outra preocupação é que o rendimento de células estaminais da medula óssea é finito. Aspirados da medula óssea produzir uma média de 6 x 10 6 células nucleadas por ml, e representam apenas MSC 0,001-0,01% de todas as células nucleadas. Depois de considerar estes inconvenientes, ADSC é sugerida como uma fonte menos intrusivos para obter células-tronco multipotentes 25,26.

Limitações sobre o uso de ADSC no regenerativa medicina dependem, em grande medida sobre o rendimento celular e de qualidade. Por conseguinte, a importância de empregar porcos para isolar ADSC neste protocolo é para produzir uma grande quantidade de células estaminais adultas de alta qualidade. O porco é um modelo animal útil representando os seres humanos devido ao tamanho do órgão comparável e muitas semelhanças fisiológicas e bioquímicas entre as espécies 27-30. Adquirente hADSC de empresas comerciais é dispendioso e, em muitos casos, as células têm sido manipulados, passadas ou criopreservadas. Aquisição de amostras clínicas humanas é relativamente difícil por causa de questões éticas e produção de ADSC é limitado. Obtivemos aproximadamente 6 x 10 5 hADSC por g de gordura após a digestão de colagenase. Com 100 g de tecido adiposo da mama feminino (uma média de amostragem), um total de 6 x 10 7 células podem ser colhidas. Usando um ratinho individual, o rendimento é ainda mais limitada. Um total de 1 x 10 6 células podem ser colhidas a partir de 0,4 g de i subcutânea ratotecido adiposo nguinal de ambas as pernas de um rato adulto FVB (6-8 semanas de idade). No entanto, em um porco individuais (7 a 9 dias de idade), um total de 2 x 10 8 células pode ser facilmente colhida a partir de 60 g de tecido adiposo subcutâneo obtido a partir do depósito de gordura dorsal. O pADSC derivado neste protocolo têm plena multipotency do tipo mesenquimal e marcadores de células-tronco mesenquimais adequadas. Portanto, pADSC são uma fonte favoráveis ​​para a obtenção de grandes quantidades de células estaminais adultas sem comprometer a qualidade de células estaminais.

A aplicação de pADSC não se restringe a decifrar a diferenciação dos adipócitos, incluindo adipogénese e lipogénese. Recentemente, ADSC tornaram-se uma popular fonte de células-tronco no campo da medicina regenerativa 22,31,32. Em comparação com outras fontes de células estaminais, ADSC reter uma vantagem única de ser facilmente acessível e abundante, e sua multipotência robusto tem sido demonstrado ser uma fonte promissora para a terapia celular e de tecido eda engenharia, 22,33,34. O fácil acesso de tecido adiposo faz ADSC uma das maneiras menos invasivas de obter progenitores multipotentes. Recentemente, nós diferenciadas pADSC em clusters secretoras de insulina de glucose de resposta, indicando que pADSC não estão limitados à diferenciação do mesênquima (dados não publicados). Outros têm também sido demonstrado que ADSC podem ser diferenciadas em muitos tipos de células derivadas de outras camadas germinativas, tais como hepatócitos endodérmicas (a partir de 35 ou hADSC pADSC 36) ou neurónios ectodérmicas (a partir de 37 ou hADSC pADSC 38). Assim, pADSC poderia ser usado para drogas de alto rendimento ou rastreio biomaterial por dirigir células de processos de diferenciação divergentes para produzir linhagens desejados. Portanto, pADSC derivado neste protocolo tem potencial aplicação na terapia de células-tronco e transplante de tecidos para a investigação medicina regenerativa.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Os autores gostariam de expressar gratidão a todos os membros do laboratório para a ampla discussão e técnica suporta neste protocolo. Pesquisa realizada no laboratório foi apoiada por doações do Ministério da Ciência e Tecnologia (MOST 103-2314-B-002-126 e MOST 102-2313-B-002-026-MY3) e por doações de apontar para o Plano University Topo (104R350144) da Universidade Nacional, Taiwan.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Reagentes
Colagenase, Tipo IISigma-AldrichC6885
DMEM, alta glicose, piruvatoLife Technologies11995-040
DMEM/F-12, HEPESLife Technologies11330-032
Soro Fetal Bovino (FBS) Indústrias Biológicas04-001-1   
Solução de Penicilina-Estreptomicina-Anfotericina B (P/S/A) IndústriasBiológicas03-033-1Para uso de antibióticos e antimicóticos
&alfa; MEM, sem nucleosídeos Life Technologies12561-049
ACK tampão de lise Life TechnologiesA10492-01
Tripsina-EDTA (0,25%), vermelho de fenolLife Technologies25200072
CD4a-PESigma-AldrichSAB4700063
CD29-PESigma-AldrichSAB4700398
CD31-PESigma-AldrichSAB4700467
CD44-PESigma-AldrichSAB4700183
CD45-PESigma-AldrichSAB4700483
CD90-PESigma-AldrichSAB4700686
HLA Classe I-PE (MHC I) Sigma-AldrichSAB4700640
HLA-DR-PE (MHC II) Sigma-AldrichSAB4700662
insulina Sigma-AldrichI9278
3,3',5-Triiodo-L-thyronine (T3)Sigma-AldrichT6397
Transferrin Sigma-AldrichT2036
3-isobutil-1-metilxantina (IBMX)Sigma-AldrichI7018
Dexametasona Sigma-AldrichD4902
RosiglitazoneCayman71740
β-Glicerofosfato Sigma-AldrichG9422
2-Fosfo-L-ácido ascórbico Sigma-Aldrich49752
TGFB1 Proteína Humana Recombinante R& D Systems 240-B-002
Óleo Vermelho O Sigma-AldrichO0625
Alizarin Red SSigma-AldrichA5533
Toluidine Blue OSigma-Aldrich198161
NomeEmpresaNúmero de CatálogoComentários
Equipamento
Lâminas de Aço CarbonoThomas Scientific6727C18
Falcon 100 µ filtro de células mCorning 352360
Falcon Placa de 6 poçosCorning 
Falcon 100 mm  pratoCorning 
353046353003

Referências

  1. Farese, R. V., Zechner, R., Newgard, C. B., Walther, T. C. The Problem of Establishing Relationships between Hepatic Steatosis and Hepatic Insulin Resistance. Cell Metab. 15, 570-573 (2012).
  2. Taubes, G. Cancer research. Unraveling the obesity-cancer connection. Science. 335 (28), 30-32 (2012).
  3. Apovian, C. M., Gokce, N. Obesity and cardiovascular disease. Circulation. 125, 1178-1182 (2012).
  4. Glass, C. K., Olefsky, J. M. Inflammation and lipid signaling in the etiology of insulin resistance. Cell Metab. 15, 635-645 (2012).
  5. Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. Adipocytes as regulators of energy balance and glucose homeostasis. Nature. 444, 847-853 (2006).
  6. Farmer, S. R. Transcriptional control of adipocyte formation. Cell Metabolism. 4, 263-273 (2006).
  7. Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells. J Vis Exp. , (2013).
  8. Hsu, J. M., Ding, S. T. Effect of polyunsaturated fatty acids on the expression of transcription factor adipocyte determination and differentiation-dependent factor 1 and of lipogenic and fatty acid oxidation enzymes in porcine differentiating adipocytes. Brit J Nutr. 90, 507-513 (2003).
  9. Hsu, J. M., Wang, P. H., Liu, B. H., Ding, S. T. The effect of dietary docosahexaenoic acid on the expression of porcine lipid metabolism-related genes. J Anim Sci. 82, 683-689 (2004).
  10. Liu, B. H., Kuo, C. F., Wang, Y. C., Ding, S. T. Effect of docosahexaenoic acid and arachidonic acid on the expression of adipocyte determination and differentiation-dependent factor 1 in differentiating porcine adipocytes. J Anim Sci. 83, 1516-1525 (2005).
  11. Ou, J. F., et al. Unsaturated fatty acids inhibit transcription of the sterol regulatory element-binding protein-1c (SREBP-1c) gene by antagonizing ligand-dependent activation of the LXR. P Natl Acad Sci USA. 98, 6027-6032 (2001).
  12. Sekiya, M., et al. Polyunsaturated fatty acids ameliorate hepatic steatosis in obese mice by SREBP-1 suppression. Hepatology. 38, 1529-1539 (2003).
  13. Xu, J., Nakamura, M. T., Cho, H. P., Clarke, S. D. Sterol regulatory element binding protein-1 expression is suppressed by dietary polyunsaturated fatty acids - A mechanism for the coordinate suppression of lipogenic genes by polyunsaturated fats. J Biol Chem. 274, 23577-23583 (1999).
  14. Ding, S. T., McNeel, R. L., Mersmann, H. J. Conjugated linoleic acid increases the differentiation of porcine adipocytes in vitro. Nutr Res. 20, 1569-1580 (2000).
  15. Ding, S., Mersmann, H. J. Fatty acids modulate porcine adipocyte differentiation and transcripts for transcription factors and adipocyte-characteristic proteins. J Nutr Biochem. 12, 101-108 (2001).
  16. Liu, L. R., et al. Serum amyloid A induces lipolysis by downregulating perilipin through ERK1/2 and PKA signaling pathways. Obesity (Silver Spring. 19, 2301-2309 (2011).
  17. Chen, Y. J., et al. Docosahexaenoic acid suppresses the expression of FoxO and its target genes. J Nutr Biochem. 23, 1609-1616 (2012).
  18. Lin, Y. Y., et al. Modulation of glucose and lipid metabolism by porcine adiponectin receptor 1-transgenic mesenchymal stromal cells in diet-induced obese mice. Cytotherapy. 15, 971-978 (2013).
  19. Schipper, B. M., Marra, K. G., Zhang, W., Donnenberg, A. D., Rubin, J. P. Regional anatomic and age effects on cell function of human adipose-derived stem cells. Ann Plast Surg. 60, 538-544 (2008).
  20. Efimenko, A., et al. Adipose-Derived Mesenchymal Stromal Cells From Aged Patients With Coronary Artery Disease Keep Mesenchymal Stromal Cell Properties but Exhibit Characteristics of Aging and Have Impaired Angiogenic Potential. Stem Cell Transl Med. 3, 32-41 (2014).
  21. Akanbi, K. A., Brodie, A. E., Suryawan, A., Hu, C. Y. Effect of age on the differentiation of porcine adipose stromal-vascular cells in culture. J Anim Sci. 72, 2828-2835 (1994).
  22. Mizuno, H., Tobita, M., Uysal, A. C. Concise Review: Adipose-Derived Stem Cells as a Novel Tool for Future Regenerative Medicine. Stem Cells. 30, 804-810 (2012).
  23. Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Cir Res. 100, 1249-1260 (2007).
  24. Tobita, M., Orbay, H., Mizuno, H. Adipose-derived Stem Cells: Current Findings and Future Perspectives. Discov Med. 57, 160-170 (2011).
  25. Baer, P. C. Adipose-Derived Stem Cells and Their Potential to Differentiate into the Epithelial Lineage. Stem Cell Dev. 20, 1805-1816 (2011).
  26. Kakudo, N., et al. Adipose-derived regenerative cell (ADRC)enriched fat grafting: optimal cell concentration and effects on grafted fat characteristics. J Transl Med. 11, (2013).
  27. Lunney, J. K. Advances in swine biomedical model genomics. Int J Biol Sci. 3, 179-184 (2007).
  28. Prather, R. S., Lorson, M., Ross, J. W., Whyte, J. J., Walters, E. Genetically Engineered Pig Models for Human Diseases. Annu Rev Anim Biosci. 1, 203-219 (2013).
  29. Vodicka, P., et al. The miniature pig as an animal model in biomedical research. Ann Ny Acad Sci. 1049, 161-171 (2005).
  30. Wolf, E., et al. Transgenic pigs as models for translational biomedical research. Transgenic Res. 20, 1150-1150 (2011).
  31. Lindroos, B., Suuronen, R., Miettinen, S. The Potential of Adipose Stem Cells in Regenerative Medicine. Stem Cell Rev Rep. 7, 269-291 (2011).
  32. Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Circ Res. 100, 1249-1260 (2007).
  33. Cignarelli, A., et al. Human adipose tissue stem cells: relevance in the pathophysiology of obesity and metabolic diseases and therapeutic applications. Expert Rev Mol Med. 14, (2012).
  34. Cawthorn, W. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. Adipose tissue stem cells: the great WAT hope. Trends Endocrinol Metab. 23, 270-277 (2012).
  35. Banas, A., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells as a source of human hepatocytes. Hepatology. 46, 219-228 (2007).
  36. Bruckner, S., et al. A fat option for the pig: hepatocytic differentiated mesenchymal stem cells for translational research. Exp Cell Res. 321, 267-275 (2014).
  37. Anghileri, E., et al. Neuronal Differentiation Potential of Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells Dev. 17, 909-916 (2008).
  38. Huang, T. T., He, D. S., Kleiner, G., Kuluz, J. Neuron-like differentiation of adipose-derived stem cells from infant piglets in vitro. J Spinal Cord Med. 30, S35-S40 (2007).

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