Apresentamos as técnicas necessárias para isolar a fração vascular estromal (SVF) de depósitos de tecido adiposo inguinal (subcutâneo) e perigonadal (visceral) de camundongos para avaliar sua expressão gênica e atividade colagenolítica. Este método inclui o enriquecimento de células-tronco derivadas de alto teor adiposo (ASCs) Sca1 usando separação celular imunomagnética.
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Artigo de método
A separação imunomagnética Sca1 de gordura Depot-específica
Neste artigo
Resumo
Resumo
O isolamento de células-tronco derivadas do tecido adiposo (ASCs) é um método importante no campo da biologia do tecido adiposo, adipogênese e remodelação da matriz extracelular (MEC). In vivo, o ambiente rico em ECM consistindo de colágenos fibrilares fornece um suporte estrutural aos tecidos adiposos durante a progressão e regressão da obesidade. A remodelação fisiológica da MEC mediada por metaloproteinases da matriz (MMPs) desempenha um papel importante na regulação do tamanho e função do tecido adiposo1,2. A perda da remodelação fisiológica da MEC colagenolítica pode levar ao acúmulo excessivo de colágeno (fibrose tecidual), infiltração de macrófagos e, finalmente, perda da homeostase metabólica, incluindo resistência à insulina3,4. Quando uma alteração fenotípica do tecido adiposo é observada em modelos de camundongos direcionados a genes, isolar ASCs primários de depósitos de gordura para estudos in vitro é uma abordagem eficaz para definir o papel do gene específico na regulação da função dos ASCs. A seguir, definimos uma separação imunomagnética de Sca1ASCs altos.
Introdução
Stem antigénio da célula 1 (Sca1 ou Ly6A / E) foi pela primeira vez identificado como um marcador de superfície celular expressa por hematopoiéticos e células estaminais mesenquimais 5,6. A fracção do estroma vascular (SVF) de tecido adiposo obtidas a partir de depósitos de gordura do rato é uma população heterogénea de células compreendendo de fibroblastos, macrófagos, células endoteliais vasculares, células neuronais, adipócitos e células progenitoras 7. Células progenitoras de adipócitos, ou células-tronco derivadas de tecido adiposo (ASCs) são células não-lípidos carregados que residem na matriz extracelular rica em colagénio perivascular (E....
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Protocolo
Declaração de Ética: A Universidade de Michigan Comitê de Uso e tratamento dos animais (UCUCA) aprovou todos os métodos e protocolos, de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (Instituto de Pesquisa Animal Laboratory, Conselho Nacional de Pesquisa). Os ratinhos são mantidos no biotério da Universidade de Michigan e é dado livre acesso a comida e água e mantidos numa / ciclo de luz escuro de 12 h.
1. Preparações
- Preparar meios de cultura primária com DMEM, 10% de FBS, 1x P / S / G e 1x antibióticos / antifúngicos. Isto irá ser utilizado para manter tecidos na digestão antes. Coloque estoque e da alíquot....
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Resultados
Enriquecimento de altas ASC SCA1 de diferentes bolsas de gordura.
As células estromais vasculares isoladas a partir de SQ visor de gordura do tipo fibroblastos, esticado a forma da célula, independentemente do nível de expressão Sca1 (Figura 1A). Por outro lado, VIS (eWAT derivados) células de baixa SCA1 alta e SCA1 demonstrar diferença distinta na sua forma celular. Como quadr.......
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Discussão
Aqui demonstramos o isolamento e separação de células imunomagnética de ASC de murino a partir de diferentes camadas de gordura e o seu uso em experiências in vitro. O método apresentado é eficaz para o isolamento rápido de um grande número de ASC SCA1-positivo, o que é vantajoso sobre o isolamento tecnicamente complexo e caro mediada por FACS de ASC 9,14. Ao contrário de FACS, a separação imunomagnética célula não permite a utilização de antigénio múltiplos para a identificação de uma população de c.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para revelar.
Agradecimentos
Este trabalho é apoiado pelo NIH DK095137 (de THC). Agradecemos aos membros do laboratório atuais e antigos que contribuíram para o desenvolvimento e sofisticação dos métodos descritos.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tipo 3 colagenase | Worthington Bioquímica | LS004182 | digestão tecidual |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | Meio de cultura com alto teor de glicose |
| Caneta / estreptococo / glutamina (100x) | Gibco | 10378-016 | Antibiótico |
| anti-anti (100x) | Gibco | 15240-062 | Antifúngico |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| PBS (1x, pH 7,4) | Gibco | 10010-023 | |
| Tripsina (0,05%) | Gibco | 25300-054 | |
| Filtro de células | BD Bioscience | 352360 | 100-μ Filtro de célula m |
| Placas de 60 mm | BD Falcon | 353004 | |
| Tesoura | FST | 14001-12 | Tesoura Grande |
| FST | 14091-11 | Ponta fina e curva | |
| Pinça Grande | FST | 11000-12 | |
| Pinça Fina | Qualquer fornecedor | ||
| 25G 5/8" agulhas | BD | 305122 | |
| Agulhas 22G de 1,5" | BD | 305159 | |
| tubos cônicos de 15 ml | BD Falcon | 352097 | |
| tubos cônicos de 50 ml Colunas | BD Falcon | 352098 | |
| MACS | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Kit de microesferas Anti-Sca1 (FITC) | Miltenyi Biotec | 130-092-529 | FITC-anti-Sca1 1º Microesferas Ab e anti-FITC 2º Ab |
| AutoMACS buffer de corrida | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Separador MiniMACS | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Almofadas de chux azul | Fisher | 276-12424 | |
| Almofadas absorventes | Fisher | 19-165-621 | |
| Placa de isopor | Use de tubos de 50 ml | ||
| 70% de etanol | |||
| Isoflurano | Qualquer fornecedor | ||
| Rato IgG2a Alexa Fluor 647 | Invitrogen | R2a21 | |
| Rato IgG2a anti-mouse Sca1 Alexa Fluor 647 | Invitrogen | MSCA21 | |
| Rato IgG2a R-PE | Invitrogen | R2a04 | |
| Rato IgG2a anti-rato F4/80 R-PE | Invitrogen | MF48004 | |
| Tubo de fundo redondo | BD Falcon | 352058 | |
| HBSS (– Ca, – Mg) | Gibco | 14175-095 | |
| HBSS (+Ca, +Mg) | Gibco | 14025-092 | Para solução de colagenase |
| Colágeno tipo I (2,7 mg/ml em ácido acético de 37 mm | Preparar em casa12 | ||
| 10x MEM | Gibco | 11430-030 | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 0,34 N NaOH | Preparar em casa | ||
| Lamínulas | Corning | 2870-22 | |
| Alexa Fluor 594 ácido carboxílico, éster succinimidílico, isômeros mistos | Invitrogen | A-20004 | |
| 0.89 M NaHCO3 | Gibco | 25080-094 |
Referências
- Chun, T. H., et al. A pericellular collagenase directs the 3-dimensional development of white adipose tissue. Cell. 125 (3), 577-591 (2006).
- Chun, T. H., et al. Genetic link between obesity and MMP14-dependent adipogenic collagen turnover.
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Reimpressões e permissões
