Desenvolvimento de um<em&gt; In Vitro</em&gt; Ocular Platform para testar as lentes de contato

Resumo

Atuais modelos in vitro para avaliação de lentes de contacto (CLS) e outras aplicações relacionadas com o olho são severamente limitados. A plataforma apresentada ocular simula o fluxo lacrimal fisiológico, o volume lacrimal, de exposição ao ar e desgaste mecânico. Este sistema é altamente versátil e pode ser aplicado a várias análises in vitro com o CLS.

Resumo

Atualmente, as avaliações in vitro de lentes de contato (CLs) para administração de medicamentos são normalmente realizadas em frascos de grande volume,1-6 que não conseguem mimetizar os volumes lacrimais fisiológicos. ⁷ O modelo tradicional também carece do componente natural do fluxo lacrimal e do reflexo de piscar, ambos fatores definidores do ambiente ocular. O desenvolvimento de um novo modelo é descrito neste estudo, que consiste em um design exclusivo de 2 peças, globo ocular e pálpebra, capaz de mimetizar o volume fisiológico da lágrima. Os modelos são criados a partir de moldes impressos em 3D (moldes de politetrafluoretileno ou Teflon), que podem ser usados para gerar modelos de olhos a partir de vários polímeros, como polidimetilsiloxano (PDMS) e ágar. Outras modificações nas oculares, como a integração de uma córnea humana ou animal explantada ou de uma construção de córnea humana, permitirão estudos oculares in vitro mais complexos. Uma bomba de seringa microfluídica comercial é integrada à plataforma para emular a secreção lacrimal fisiológica. A exposição ao ar e o desgaste mecânico são obtidos usando dois atuadores mecânicos, dos quais um move a peça palpebral lateralmente e o outro move a ocularocular circularmente. O modelo tem sido usado para avaliar CLs para entrega de drogas e deposição de componentes lacrimais em CLs.

Introdução

Duas áreas significativas de interesse dentro da arena lente de contato (CL) incluem desconforto e o desenvolvimento de aplicações CL novos. Elucidar os mecanismos subjacentes CL desconforto é um problema que iludiu o campo durante décadas. ⁸ O desenvolvimento do romance, o CLS funcionais, tais como dispositivos de entrega de drogas ^1,3,9 e biossensores, ^10-12 é uma área de interesse crescente, com mercados potenciais substanciais. Em ambas as circunstâncias, um sofisticado modelo in vitro poderá fornecer informações relevantes para ajudar com a seleção de materiais de lentes ou características de design apropriado durante a fase de desenvolvimento. Infelizmente, atual em modelos in vitro para avaliar o CLS e outras aplicações relacionadas oculares são relativamente bruto e sem sofisticação. Tradicionalmente, os estudos in vitro que avaliam CL deposição do filme lacrimal ou entrega da droga são realizadas em frascos de volume estáticos, contendo um grande volume de fluido fixo, que excelenTLY excede valores fisiológicos. Além disso, este modelo simples falta a componente de fluxo natural das lágrimas e o reflexo de piscar, ambas as quais são factores de definir o meio ocular.

O desenvolvimento de um "modelo" sofisticado, fisiologicamente relevante olho exigirá uma abordagem multidisciplinar e exigem substancial na validação vivo. Por estas razões, o quadro fundamental para o nosso modelo in vitro olho é altamente versátil, de modo que o modelo pode ser melhorado continuamente por meio de upgrades e modulações futuras. Até à data, o modelo é capaz de simular o volume lacrimal, do fluxo lacrimal, o desgaste mecânico e exposição ao ar. O objectivo é o de criar um modelo in vitro que irá fornecer resultados significativos, que é complementar ao preditivo e in vivo e ex vivo observações.

Protocolo

Todos os experimentos foram preenchidos em conformidade e cumprimento de todas as orientações pertinentes delineadas pelo comité de ética pesquisa animal da Universidade de Waterloo de. Os olhos de bovinos são generosamente doados a partir de um matadouro local.

1. Modelo de Olho

1. Concepção e produção de moldes de ¹³
   1. Design os modelos de olho de acordo com as dimensões médias de fisiológicas olhos humanos adultos. ¹³
   2. Deixe um espaço de 250 mm entre o globo ocular e as peças da pálpebra do olho modelo. Projetar os respectivos moldes usando software assistida por computador (CAD).
   3. Criar novo arquivo .cad ou arquivo .sldprt com o AutoCAD ou Solidworks. Criar modelos 3D do globo ocular / pálpebra humana. Criar moldes dos modelos e salvar os moldes como arquivos .stl.
   4. Importar arquivos .stl em software da impressora 3D (por exemplo, makeware para replicator2). Especificar parâmetros da impressão (localização, sparseness, escala, orientação, suavidade, etc. ) ^13.
   5. Salve o arquivo como arquivo G-código para impressoras 3D para ler. Seleccionar materiais tais como PLA (ácido poliláctico), ABS (acrilonitrilo butadieno estireno), PC (policarbonato), ou uma combinação dos mesmos, para imprimir os moldes ^13.
   6. Instalar filamento desejado do material de escolha. Importar o arquivo G-código na impressora 3D para ler. Imprimir o molde.
      NOTA: Como alternativa, produzir os moldes do olho usando um numérico computadorizado (CNC) máquina controlada, se uma superfície mais lisa do modelo de olho é desejada. Para a produção de moldes CNC, materiais para moldes já não estão limitados aos plásticos térmicos, mas estender-se a metal, cerâmica, polímeros e química resistivas, como politetrafluoretileno.
   7. Abrir a interface de software do CNC que está ligado a uma broca de corte. Construção de moldes em 3D de acordo com frontal, superior, lateral e vistas em perspectiva dos previamente construídos moldes modelo globo ocular / pálpebra na interface do software de controle. Selecione os parâmetros apropriados para ousinagem (tamanho do bit, material de substrato, espessura do material) e prossiga para cortar o molde.
2. Síntese de Oculares Utilizando PDMS
   1. Usando uma seringa, medir 10 ml de volume de PDMS base (polidimetilsiloxano) e preenchê-lo em um tubo de centrífuga de 15-50 ml. Adicionar 10% w / v da solução de elastómero em peso total de PDMS. Usando uma vareta de agitação, misturar as soluções bem.
   2. Despeje a solução PDMS no globo ocular e das pálpebras moldes. Permitir que o PDMS de resolver à TA S / N (ou, pelo menos, 12 h) para iniciar a polimerização e para permitir que as bolhas de dissolver o polímero para fora da.
      NOTA: Verifique se não há bolhas deixadas no PDMS que possam subir ou expandir.
   3. Subsequentemente, colocar os moldes num forno de 75 ° C (167 ° F) durante 1 h, ou de 150 ° C (302 ° F) durante 5 min. Para um gel suave, deixe as PDMS sentar-se à temperatura ambiente durante pelo menos 48 horas para polimerizar completamente.
   4. Coloque as amostras num congelador durante alguns minutos; isso vai diminuir o PDMS e simplificara remoção das amostras dos moldes. Extrair as oculares dos moldes utilizando uma espátula fina.
   5. Para a entrega da solução para dentro do espaço entre o globo ocular ea pálpebra peças, ligar um "x 1/8" tubo de politetrafluoretileno 16/01 com um conector do tubo de perna acoplador igual 1/16 "e anexar à parte da peça pálpebra no furo de tubagem .
3. Síntese do globo ocular peça com Agarose
   NOTA: A peça ocular podem ser sintetizados utilizando outros polímeros, tais como agarose. O procedimento seguinte pode também ser modificado para produzir peças oculares a partir de uma variedade de tipos de ágar, como PDA (Agar de Dextrose de batata) ou SDA (Sabouraud agar de dextrose).
   1. Para produzir um gel de 2% (2 g / 100 ml), medida de 2 g de agarose e misturar-se com 100 ml de água ultrapura. Levar a solução à ebulição (100 ° C) de tal forma que a agarose se dissolve completamente. Deixe a solução esfriar por 5 min.
   2. Verter a solução para dentro do molde globo ocular e deixar a solução arrefecer para 30 min à temperatura ambiente. Retire os pedaços globo ocular com uma espátula. Armazenar o agar globo ocular em um -20 Congelador ° C para uso posterior. Para os estudos de microbiologia, esterilizar os moldes globo ocular por autoclave e / ou radiação UV.
4. Incorporação de Bovinos Cornea em PDMS Eyeball
   NOTA:. Este protocolo foi adaptado de Parekh et al ¹⁴
   1. Realizar a dissecção e incorporação das córneas de bovinos em condições estéreis sob uma capela de fluxo laminar. Adquirir os olhos e dissecar-los no mesmo dia.
   2. Ligue a câmara de fluxo por 10 min antes da utilização e higienizar álcool com etanol a 70%. Certifique-se de que todos os materiais e instrumentos são estéreis por autoclavagem a 273 ° F / 133 ° C durante 45 min, e posicionada de não menos do que 4 polegadas a partir da câmara de fluxo de entrada.
   3. Mergulha-se o olho de bovino num copo contendo uma solução de povidona-iodo diluída, durante 2 min. Lavar o olho numa proveta contendo solução salina tamponada com fosfato (PBS) PH 7,4. Utilizando uma pinça coloque suavemente o olho em uma placa de Petri de vidro, córnea face para cima.
   4. Remover o excesso de tecido adiposo e muscular, cortando nos pontos de fixação da esclera com tesouras de dissecação romba final. Elimine o excesso de tecido para um copo estéril designado para resíduos animais.
   5. Utilizando micro-tesoura, remover a conjuntiva do olho. Enrole a olho com gaze estéril, mantendo uma distância de pelo menos 1 cm a partir do limbo.
   6. Utilizando um escalpelo, incisão na esclera aproximadamente 2 mm a partir da região do limbo e superficialmente, de modo a evitar a penetração da coróide e vítreo subjacente. Cuidadosamente estender a incisão por 360 ° utilizando um bisturi ou dissecção tesoura sem deformar a córnea a partir de sua curvatura natural.
   7. Com uma pinça fina, remover a córnea do olho. Utilizando uma pinça, retire cuidadosamente qualquer tecido uveal aderindo e enxaguar córnea com PBS.
   8. Armazenar a córnea a 31ºC em um recipiente estéril com a culturamédio (tais como Meio 199) contendo 3% de Soro Fetal Bovino a manter a humidade nos tecidos e nutrição celular.
   9. Antes da experimentação, descansar da córnea transplantada no globo ocular PDMS, e prenda as duas peças juntas com um clip-on especializada.

2. Blink-plataforma

1. Concepção e produção do Blink-plataforma
   NOTA: O blink-plataforma é composta de três partes funcionais: Modelo de olho (descrito na seção 1), sistema de engrenagem, e do sistema eletrônico.
   1. Concepção e fabrico da plataforma piscar usando CAD 3D e de impressão, semelhante ao descrito para o modelo de olho (secção 1.1). Projetar o sistema de engrenagem de tal forma que se traduz simples rotação de motores para os movimentos laterais e rotacionais das oculares. ¹⁵
   2. Usando o pinhão e mecanismo de engrenagem, traduzir o movimento rotacional de um motor de passo para o movimento lateral de um carreto, que está ligada às peças de pálpebra.
   3. usando osistema de engrenagem conjugado, amplificar um movimento de rotação de um motor de passo em três (ou mais) movimentos de rotação por três partes diferentes do globo ocular.
   4. Alinhar os dois sistemas de engrenagem, uma para a pálpebra e para um globo ocular, de modo que a distância entre os dois são constantes. Monte o sistema eletrônico com um microcontrolador, protetor do motor, e dois motores.
      NOTA: Use dois motores de passo para fornecer motores rotativos, que é traduzido pelo sistema de engrenagem em um movimento de piscar.
   5. Ligar os dois motores de passo com um sistema constituído por uma blindagem do motor empilhados no microcontrolador. Conectar e configurar os componentes electrónicos para trabalhar com produtos de software de fonte aberta.
   6. Programar o sistema para controlar os parâmetros do motor, tais como rotações por minuto (RPM), número de rodadas para a frente, número de rodadas para trás, e estilo de viragem.
      NOTA: Consulte o "arquivo de código Arduino" complementar para detalhes.
   7. Faça o download do software do sistema do mawebsite 'nufacturers.
   8. Instalar o software e abri-lo. Escrever o código para controlar motores de passo na configuração desejada. Ligar o sistema com uma fonte para fornecer energia ao sistema electrónico de modo a que os motores movem na forma desejada, tal como definido pelo pesquisador.
      NOTA: Consulte o "arquivo de código Arduino" complementar.
2. Montagem com microfluídica (solução de lágrimas artificiais)
   1. Tome o globo ocular sintetizados e peças pálpebra e deslizá-los em seus correspondentes clip-ons para o olho-modelo. Conecte o tubo que se une com uma seringa e posicionado na bomba microfluídico com a peça de pálpebra (ponto 1.2.5). Teste de executar a plataforma e verificar se há movimento consistente.
   2. Primeiro o tubo e verificar se há um fluxo constante de solução de lágrima artificial (ATS). A receita para o ATS foi relatada anteriormente. ¹⁶
   3. mover manualmente as partes do olho-modelo em conjunto num plano horizontal, de tal modo que o globo ocular e o olhotampa estão em contato. Definir a taxa de fluxo da bomba de microfluidos para os valores desejados. Definir taxas de fluxo fisiológicos para 1-1,5 mL / min. ¹⁷
   4. Comece a bomba e os atuadores para começar a experiência. Para experiências de administração de medicamentos, coloque a lente de contato que contém o medicamento na peça globo ocular.
   5. Permita que o fluido de fluxo para escorrer para uma placa de 12 poços. A intervalos de tempo definidos desejados, quantificar a concentração do analito ou de drogas usando métodos de detecção comuns, tais como espectroscopia de UV-Vis ou fluorescência. ^1,4,18
   6. Para estudos que avaliaram a deposição de componentes de lágrima em lentes de contato, coloque a lente de contato na peça "globo ocular". Recolhe-se o fluido de fluxo, a qual pode ser descartada.
   7. Após os intervalos de tempo desejados, remova a lente de contato da peça globo ocular e preparar a lente para análise posterior, como a microscopia confocal.

Resultados

Os moldes olho sintetizados obtidos a partir da loja de máquinas de impressão e 3-D são apresentados na Figura 1. Esses moldes podem ser usados ​​com uma variedade de polímeros, tais como PDMS e de agarose, para produzir oculares com as propriedades desejadas. O conjunto de gesto da plataforma de modelo de olho com uma bomba de seringa de microfluidos é mostrado na Figura 2. A plataforma simula o desgaste mecânico através da rotação da peça ocular, e de ...

Discussão

Há três passos críticos no âmbito do protocolo que requerem atenção especial: concepção e produção de moldes (seção 1.1), a montagem da plataforma (seção 2.2.1-2.2.3), e acompanhamento do funcionamento experimental (seção 2.2.4-2.2.7 ). Em termos de concepção e produção de moldes (seção 1.1), a peça globo ocular deve ser projetado de acordo com as dimensões de uma córnea humana. No entanto, pode exigir vários protótipos do molde antes de uma peça do globo ocular pode ser criado que se encaixa perfeitamente uma lente de ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Arduino Uno R3 (Atmega328 - montado)	Adafruit	50
Board Motor de passo	Adafruit	324	Motor e escudo do motor
Acoplador de perna igual 1,6 mm 1/16 "	VWR	CA11009-280	50 pcs de conector de tubo
Tubulação PT / SIL 1/16 "x1 / 8"	VWR	16211-316	Caixa de 50 pés
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184 Encapsulamento de
Agarose, Tipo 1-A, baixo EEO	Sigma-Aldrich	A0169-25G
PHD UltraTM	Harvard Apparatus	703006	Bomba MicroFluídica
Córnea bovina	Cargill, Guelph/ON
Soldidworks	Dassault Systemes		Software
Impressão 3-D	Universidade de Waterloo - Centro de Impressão 3D
Ferramentas de dissecação	Ferramentas de ciências		finas Ferramentas gerais de dissecção
Medium 199	Sigma-Aldrich		Armazenamento de meio de cultura para córnea
Soro fetal bovino	Thermo Fisher		Adicionar ao meio de cultura, 3% do volume total

células solares