Artigo de método

In Vitro A desmontagem do vírus influenza A caps�eos por centrifugação em gradiente

DOI:

10.3791/53909

⸱

27 de março de 2016

 ,  , 
1Institute of Biochemistry, ETH Zurich, 2Department of Biochemistry, University of Zurich, 3Institute for Molecular Health Sciences, ETH Zurich

Neste artigo

Resumo

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A desmontagem dos núcleos do vírus influenza A durante a entrada do vírus nas células hospedeiras é um processo de várias etapas. Descrevemos um método in vitro para analisar os estágios iniciais do desrevestimento viral. Nesta abordagem, a centrifugação por gradiente de velocidade é usada para dissecar bioquimicamente as etapas que iniciam o desrevestimento sob condições definidas.

Resumo

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Os processos moleculares desencadeados por ácido controlam de perto a entrada celular de muitos vírus que entram pelo sistema endocítico. No caso do vírus influenza A (IAV), a fusão do vírus com a membrana endossômica, bem como a subsequente desmontagem do capsídeo viral, chamada de desrevestimento, é governada pelas condições iônicas dentro das vesículas endocíticas. As etapas iniciais do ciclo de vida do vírus são difíceis de estudar porque os endossomos não podem ser acessados diretamente experimentalmente, criando a necessidade de uma abordagem in vitro. Aqui, descrevemos um método baseado na centrifugação com gradiente de velocidade de vírions purificados através de um gradiente de glicerol de duas camadas, que permite a análise do núcleo IAV e sua estabilidade. O gradiente contém um detergente não iônico (NP-40) em sua camada inferior para remover a membrana viral por solubilização à medida que o vírus sedimenta em direção ao fundo. Em pH neutro, os núcleos virais são peletizados como estruturas estáveis. Os principais componentes do núcleo, proteína da matriz (M1) e ribonucleoproteínas virais (vRNPs), podem ser claramente identificados na fração do pellet por SDS-PAGE. Diminuir o pH para 6,0 ou menos na camada inferior remove seletivamente M1 do pellet, seguido pela liberação de vRNPs em condições mais ácidas. As bandas de proteínas virais em géis corados com Coomassie podem ser submetidas à quantificação densitométrica para monitorar os estados intermediários de desmontagem do IAV. Além do pH, outros fatores que influenciam a estabilidade do núcleo viral podem ser avaliados, como concentração de sal e fatores de desrevestimento viral putativos, simplesmente modificando a camada de glicerol contendo detergente de acordo. Em conjunto, a técnica apresentada permite uma análise altamente reprodutível e quantitativa do desrevestimento viral in vitro. Pode ser aplicado a outros vírus envelopados que passam por processos complexos de desrevestimento.

Introdução

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Vírus da Influenza A (IAV) é um vírus envolvido que pertence à família de Orthomyxoviridae. Seus genes são codificados em uma, de sentido negativo e segmentada genoma de ARN de cadeia simples. Nos seres humanos, IAV causa infecções respiratórias, que ocorrem em surtos epidêmicos sazonais e tem o potencial para pandemias globais 1. Após a ligação de resíduos de ácido siálico na superfície das células de acolhimento 2, IAV é internalizado por endocitose dependente de clatrina e vias independentes de clatrina 3-8. O meio ácido (pH <5,5) nos vacúolos de endocitose desencadeia uma mudança conformacional na IAV pico glicoproteína hemaglutinina (HA), o que resulta na fusão do vírus e no final da membrana endossomal 9. Uma vez que a cápside IAV (aqui também referido como "núcleo" viral) escapou de endossomas tardios (EIE), que é não revestidos no citosol seguido por transporte das ribonucleoproteínas virais (vRNPs) no núcleo - o local de Oa replicação do vírus e transcrição F 10-13. Antes da activação de ácido HA do vírus sofre uma redução gradual do pH no sistema endocítico, que prepara o núcleo para a sua desmontagem posterior 14-16. Neste "priming" intensificar os canais de íon M2 na membrana viral mediar o influxo de prótons e K +10,14,16. A mudança na concentração iônica no interior vírus perturba as interações construir pela proteína da matriz viral M1 ea vRNP pacote de oito, e facilita IAV uncoating no citoplasma seguindo a fusão da membrana 10,14-17.

análise directa e quantitativa do passo de iniciação tem sido dificultada pelo facto de endossomas são difíceis de aceder experimentalmente. O processo de entrada é, aliás, altamente não-síncrona. Além disso, ensaios de ponto final, como qRT-PCR de RNA ou da infecciosidade medições virais libertados, não fornecem uma imagem detalhada sobre o estado bioquímico do capsi virald em qualquer etapa de entrada. Enquanto perturbação da endossomas por siRNA ou tratamento de drogas tem contribuído significativamente para a compreensão de entrada IAV 18-20, ajuste fino é difícil e propenso a efeitos colaterais não específicos no programa endosome maturação rigidamente controlado.

Para evitar estes problemas, nós adaptamos um protocolo previamente desenvolvido in vitro, com base na utilização de centrifugação em gradiente de velocidade de 17. Em contraste com outras tentativas 21,22, 23,24, que eram na maior parte baseados em combinações de clivagem proteolítica e tratamento com detergente, seguido por análise de EM, esta abordagem permitiu um resultado facilmente quantificáveis. Centrifugação através de diferentes camadas de gradiente permite que as partículas sedimentam a ser expostos e reagem com mudança de condições, de forma controlada. No protocolo apresentado, IAV derivados a partir de fluido alantóico clarificado ou partículas virais purificadas são sedimentadas numa glicerol de duas camadasgradiente em que a camada inferior contém o detergente não-iónico NP-40 (Figura 1). Tal como o vírus entra na segunda camada, contendo detergente, o envelope lipídico e glicoproteínas do envelope viral são suavemente solubilizada e deixado para trás. O núcleo, composto pelo feixe vRNP e oito rodeado por uma camada de matriz, sedimentos como uma estrutura estável na fracção de sedimento. proteínas de núcleo virai, tais como M1 e nucleoproteína vRNP-associado (NP), pode ser identificado no sedimento por SDS-PAGE e coloração com Coomassie. Em particular, tomando vantagem de géis de gradiente disponíveis comercialmente e a coloração com Coomassie coloidal altamente sensível 25, permite alta precisão e a detecção de mesmo pequenas quantidades de proteínas associadas ao núcleo virai.

Isso define a base para testar se condições diferentes, como pH, concentração de sal, e os fatores não revestidos putativos têm efeitos sobre o comportamento de sedimentação dos componentes do núcleo e stabil núcleo dade. Para este objectivo, apenas a camada inferior, contendo o detergente em o gradiente de glicerol é modificado através da introdução do factor ou condição de interesse. A técnica tem sido particularmente útil em investigar o efeito de diferentes valores de pH e concentrações de sal sobre a integridade do núcleo 16 IAV. Etapas intermediárias de IAV desencapsulamento poderia ser monitorada incluindo dissociação da camada de matriz a um pH ligeiramente ácido (<6,5), seguido de vRNP de dissociação a pH 5,5 e inferior 16,17 (Figura 1). O último passo foi adicionalmente reforçada pela presença de alta concentração de K + na camada de glicerol, reflectindo um ambiente endocítica final 16. Assim, como o vírus e o núcleo sedimentado através do gradiente que experimentaram uma mudança de meio, imitando as condições em endossomas. O resultado foi uma desmontagem gradual do núcleo virai in vitro, completando os resultados derivados a partir de ensaios de biologia celular.

t "> O método aqui apresentado, permitiu rápido e altamente reprodutível análise de IAV (X31 e A / WSN / 33) e IBV (B / Lee / 40) desencapsulamento desencadeada pelo pH ácido e aumentando +16,17 K, bem como desmontagem de núcleos paramixovírus após exposição pH alcalino 17. é concebível que a abordagem pode ser adaptada para outros vírus com envelope para obter insights sobre as propriedades bioquímicas da estrutura da cápside virai e desmontagem da cápside durante a entrada na célula.

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Protocolo

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1. Preparação de tampões e soluções de Stock

  1. Preparar tampão de MNT (MES 20 mM, Tris 30 mM e NaCl 100 mM) por dissolução de 470 mg de Tris, cloridrato de 390 mg de hidrato de MES e 580 mg de NaCl em 80 ml ​​de ddH 2 O. Ajustar o tampão a pH 7,4 e trazê-lo para um volume final de 100 ml com ddH 2 O.
  2. Preparar três soluções idênticas de tampão 500 mM MES dissolvendo 9,76 g MES hidratado em 80 ml ​​de dH2O cada um. Ajustar as memórias intermédias para um pH de 5,8, 5,4, e 5,0, respectivamente, por titulação com NaOH concentrado. Traga cada tampão para um volume final de 100 mL com dH2O
  3. Preparar duas soluções idênticas de tampão Tris 500 mM por dissolução de 7,88 g de Tris cloridrato em 80 ml ​​de dH2O cada e ajustar o pH para 7,4 e 6,4, respectivamente, por titulação com HCl concentrado. Traga o tampão para um volume final de 100 mL com dH2O
  4. Preparar a solução de glicerol a 50% em dH 2 O e agita-se bem até a GlycErol é homogeneamente misturada. Filtrar a solução através de uma unidade de filtro Steritop (0,22 de tamanho de poro) para um frasco de vidro.
  5. Preparar solução a 10% de NP-40 e NaCl 1 M em dH2O
  6. Prepare 25x inibidor de protease concentrada por dissolução de dois comprimidos em 4 ml DDH 2 O.

2. Preparação de gradientes de glicerol

  1. Prepare 5 ml de tampão detergente de mistura principal solução para cada condição de pH (300 mM de NaCl, 2% de NP-40, inibidores da protease 2x concentrado) de teste (pH 7.4, 6.4, 5.8, 5.4, e 5.0). Para este efeito, mistura 9 ml de NaCl 1 M, 6 ml de 10% de NP-40, 2,4 ml de solução stock de inibidor de protease, 25x e 9 ml de ddH 2 0.
  2. Para cada condição pipeta pH 4,4 ml da mistura principal em um tubo de 50 ml.
  3. Para valores de pH acima de 5,8 adicionar 0,6 ml da respectiva solução de estoque de 500 mM de Tris com pH ajustado ao tubo. Para pH 5,8 e inferior adicionar 0,6 ml da respectiva solução de MES 500 mM com o pH ajustado.
  4. Faça 5ml de solução tampão contendo NaCl 300 mM, inibidor de protease de 2x, Tris 60 mM ajustado para pH 7,4 e ddH 2 O. Isto irá servir como tampão de gradiente de controlo sem detergente.
  5. Se necessário, ajustar com precisão o pH das soluções para pH 7,4, 6,4, 5,8, 5,4, e 5,0 por adição de soluções de HCI ou NaOH concentrado, respectivamente.
  6. Adicionar 5 ml de solução stock de glicerol a 50% e 5 ml de as misturas tampão contendo detergente e sem detergente, resultando em seis diferentes soluções de glicerol a 25%. Verifique os valores de pH utilizando papel indicador de pH.
    NOTA: No caso de o pH medido difere significativamente do valor desejado, as respectivas soluções devem ser preparadas novamente.
  7. Preparar solução de glicerol a 15% por mistura de estoque de glicerol a 50% com dH 2 O em uma proporção de 3: 7.

3. Ultracentrifugação da IAV

  1. Adicionar solução de glicerol a 3 ml de 15% em tubos de centrifugação ultra-claros (13,2 ml, 14 mm x 89 mm) usando uma seringa de 5 ml e uma needle (21 G, 9 cm de comprimento). Não deixar gotas para a parede interior do tubo como este poderia perturbar a integridade do gradiente. Repetir este para um total de seis tubos de centrifugação, uma para cada um dos cinco condições de pH para testar e uma para a amostra de controlo.
  2. Com cuidado, coloque solução de glicerol a 3,4 ml de 25% sob a camada de glicerol 15%, utilizando uma seringa de 5 ml e uma agulha longa. Tome cuidado para não misturar as duas camadas. Repita este procedimento para todas as seis condições para testar com as respectivas soluções de glicerol com o pH ajustado.
    NOTA: Trabalho na classe II biossegurança gabinete para as etapas seguintes.
  3. Suavemente sobrepor os gradientes de glicerol com 30 ul clarificadas fluido alantóide que contém IAV (X31, H3N2) diluído em 1 ml de tampão de MNT (corresponde a cerca de 20-30 ug da proteína virai total) para cada gradiente.
  4. Equilíbrio oposição tubos e colocá-los em um rotor SW41 ultracentrifugação. Centrifugar durante 150 minutos, a 55000 x g, e 12 ° C.
  5. Após a centrifugação, cuidadosamenteremover o sobrenadante, isto é, ambas as camadas de glicerol, usando uma pipeta de Pasteur limpa e um aspirador. Ressuspender o sedimento em 40 ul (1x) não redutoras tampão de amostra LDS. É importante para pipetar para cima e para baixo várias vezes para dissolver completamente o sedimento. Transferir a amostra para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.

4. SDS-PAGE de fracções de pellets e coloração com Coomassie

  1. Aquecer todas as amostras a 95 ° C durante 10 min. Neste ponto, as amostras podem ser armazenadas a -20 ° C até serem analisadas por SDS-PAGE.
  2. Carga de 20 ul das pelotas dissolvidas em um gradiente de pré-molde (4-12%) em gel de mini-Bis-Tris e correr durante 1 h a 200 V em MOPS SDS 1x tampão de corrida.
  3. Fazer a solução de fixação com 40% de metanol e ácido acético glacial a 10% em DDH 2 O.
  4. Incubar o gel na solução de fixação durante 1 hora e manchar durante a noite numa placa de cultura celular 15 cm, com um volume suficiente de solução de Coomassie coloidal enquanto suavementeagitação à temperatura ambiente.
    NOTA: É importante para fechar o prato, a fim de evitar a evaporação da solução de coloração.
  5. Destain o gel em ddH 2 O. Substitua o DDH 2 O a cada 15-20 minutos até que o fundo gel torna-se clara. Armazenar o gel em ddH2O a 4 ° C até ser digitalizada para quantificação banda.
  6. Digitalizar o gel em alta resolução e use um software disponível ou personalizado comercialmente para a quantificação de intensidades das bandas de proteína. Subtrair o sinal de fundo a partir de uma região próxima às respectivas bandas e normalizar estes valores para as amostras de controlo sem detergente (a pH 7,4).

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Resultados

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Como já foi discutido, priming em endossomos é necessária para tornar o núcleo IAV perda do revestimento competente. A protonação do núcleo enfraquece interacção de M1 e vRNPs (composto do RNA viral, NP, e o complexo de polimerase PB1 / PB2 / PA). Este processo inicia-se quando o vírus de entrada está exposta a um pH de 6.5 (ou inferior) em endossomas precoces (EES) e continua até que os fusíveis de vírus em torno de pH 5,0 em les.

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Discussão

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cápsides virais são complexos macromoleculares metaestáveis. Enquanto a montagem de viriões requer a encapsidação e condensação do genoma do vírus, o início da próxima ronda de infecção depende de desmontagem desta estrutura capsídeo compacto. Vírus evoluíram para explorar vários mecanismos celulares para controlar o ciclo de revestimento-desencapsulamento, incluindo receptores celulares, chaperones, enzimas proteolíticas, forças físicas proporcionadas pelas proteínas do motor ou helicases, bem como o pH e interruptores...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

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Agradecemos Yohei Yamauchi e Roberta Mancini por nos fornecer reagentes. O laboratório AH foi apoiada pelas redes de formação inicial Marie Curie (ITN), o Conselho Europeu de Investigação (ERC), e pela Swiss National Science Foundation (Sinergia).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
cOmplete™, comprimidos inibidores de protease sem EDTASigma-Aldrich11873580001A solução estoque pode ser armazenada a 2 a 8 graus; C por 1 a 2 semanas
Ácido acético glacialMerck Millipore100063
Glicerol anidro BioChemicaAppliChemA1123
Ácido clorídricoMerck Millipore100317
Agulha de injeção longa (21  G, 9 cm, chanfrado ou sem corte)
Hidrato MESSigma-AldrichM8250
MetanolMerck Millipore106009
NP-40Sigma-AldrichI8896Agora disponível comercialmente como IGEPAL® CA-630
NuPAGE 4-12% Bis-Tris mini géis, 10  poços, 1,0 mmLife TechnologiesNP0321
NuPAGE LDS tampão de amostra (4x)Life TechnologiesNP0008
NuPAGE MOPS SDS tampão de corrida (20x)Life TechnologiesNP0001
tiras indicadoras de pH, pH 4,0-7,0Merck Millipore109542
QC Colloidal Coomassie StainBIO RAD1610803
Sodium cloretoMerck Millipore106406
Hidróxido de sódioMerck Millipore106498
Unidade de filtro SteritopMerck MilliporeSCGPT05RE
SW41 Ti, conjunto de rotores de ultracentrífugaBeckman Coulter331336
Thinwall, Tubos de centrífuga ultra-claros, 13.2  ml, 14 mm x 89 mmBeckman Coulter344059
Cloridrato de Tris AppliChemA1087
X31 Vírus Influenza A (H3N2), cultivado em ovo, fluido alantóide clarificadoVirapurRecém-descongelado em 4 ° O

Referências

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