In Vitro A desmontagem do vírus influenza A caps�eos por centrifugação em gradiente

Resumo

A desmontagem dos núcleos do vírus influenza A durante a entrada do vírus nas células hospedeiras é um processo de várias etapas. Descrevemos um método in vitro para analisar os estágios iniciais do desrevestimento viral. Nesta abordagem, a centrifugação por gradiente de velocidade é usada para dissecar bioquimicamente as etapas que iniciam o desrevestimento sob condições definidas.

Resumo

Os processos moleculares desencadeados por ácido controlam de perto a entrada celular de muitos vírus que entram pelo sistema endocítico. No caso do vírus influenza A (IAV), a fusão do vírus com a membrana endossômica, bem como a subsequente desmontagem do capsídeo viral, chamada de desrevestimento, é governada pelas condições iônicas dentro das vesículas endocíticas. As etapas iniciais do ciclo de vida do vírus são difíceis de estudar porque os endossomos não podem ser acessados diretamente experimentalmente, criando a necessidade de uma abordagem in vitro. Aqui, descrevemos um método baseado na centrifugação com gradiente de velocidade de vírions purificados através de um gradiente de glicerol de duas camadas, que permite a análise do núcleo IAV e sua estabilidade. O gradiente contém um detergente não iônico (NP-40) em sua camada inferior para remover a membrana viral por solubilização à medida que o vírus sedimenta em direção ao fundo. Em pH neutro, os núcleos virais são peletizados como estruturas estáveis. Os principais componentes do núcleo, proteína da matriz (M1) e ribonucleoproteínas virais (vRNPs), podem ser claramente identificados na fração do pellet por SDS-PAGE. Diminuir o pH para 6,0 ou menos na camada inferior remove seletivamente M1 do pellet, seguido pela liberação de vRNPs em condições mais ácidas. As bandas de proteínas virais em géis corados com Coomassie podem ser submetidas à quantificação densitométrica para monitorar os estados intermediários de desmontagem do IAV. Além do pH, outros fatores que influenciam a estabilidade do núcleo viral podem ser avaliados, como concentração de sal e fatores de desrevestimento viral putativos, simplesmente modificando a camada de glicerol contendo detergente de acordo. Em conjunto, a técnica apresentada permite uma análise altamente reprodutível e quantitativa do desrevestimento viral in vitro. Pode ser aplicado a outros vírus envelopados que passam por processos complexos de desrevestimento.

Introdução

Vírus da Influenza A (IAV) é um vírus envolvido que pertence à família de Orthomyxoviridae. Seus genes são codificados em uma, de sentido negativo e segmentada genoma de ARN de cadeia simples. Nos seres humanos, IAV causa infecções respiratórias, que ocorrem em surtos epidêmicos sazonais e tem o potencial para pandemias globais ^1. Após a ligação de resíduos de ácido siálico na superfície das células de acolhimento ^2, IAV é internalizado por endocitose dependente de clatrina e vias independentes de clatrina ^3-8. O meio ácido (pH <5,5) nos vacúolos de endocitose desencadeia uma mudança conformacional na IAV pico glicoproteína h....

Protocolo

1. Preparação de tampões e soluções de Stock

1. Preparar tampão de MNT (MES 20 mM, Tris 30 mM e NaCl 100 mM) por dissolução de 470 mg de Tris, cloridrato de 390 mg de hidrato de MES e 580 mg de NaCl em 80 ml ​​de ddH ₂ O. Ajustar o tampão a pH 7,4 e trazê-lo para um volume final de 100 ml com ddH ₂ O.
2. Preparar três soluções idênticas de tampão 500 mM MES dissolvendo 9,76 g MES hidratado em 80 ml _{​​de dH2O} cada um. Ajustar as memórias intermédias para um pH de 5,8, 5,4, e 5,0, respectivamente, por titulação com NaOH concentrado. Traga cada tampão para um volume final de 100 mL com _dH2O
3. Preparar du....

Resultados

Como já foi discutido, priming em endossomos é necessária para tornar o núcleo IAV perda do revestimento competente. A protonação do núcleo enfraquece interacção de M1 e vRNPs (composto do RNA viral, NP, e o complexo de polimerase PB1 / PB2 / PA). Este processo inicia-se quando o vírus de entrada está exposta a um pH de 6.5 (ou inferior) em endossomas precoces (EES) e continua até que os fusíveis de vírus em torno de pH 5,0 em les.

Discussão

cápsides virais são complexos macromoleculares metaestáveis. Enquanto a montagem de viriões requer a encapsidação e condensação do genoma do vírus, o início da próxima ronda de infecção depende de desmontagem desta estrutura capsídeo compacto. Vírus evoluíram para explorar vários mecanismos celulares para controlar o ciclo de revestimento-desencapsulamento, incluindo receptores celulares, chaperones, enzimas proteolíticas, forças físicas proporcionadas pelas proteínas do motor ou helicases, bem como o pH e interruptores.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
cOmplete™, comprimidos inibidores de protease sem EDTA	Sigma-Aldrich	11873580001	A solução estoque pode ser armazenada a 2 a 8 graus; C por 1 a 2 semanas
Ácido acético glacial	Merck Millipore	100063
Glicerol anidro BioChemica	AppliChem	A1123
Ácido clorídrico	Merck Millipore	100317
Agulha de injeção longa (21  G, 9 cm, chanfrado ou sem corte)
Hidrato MES	Sigma-Aldrich	M8250
Metanol	Merck Millipore	106009
NP-40	Sigma-Aldrich	I8896	Agora disponível comercialmente como IGEPAL® CA-630
NuPAGE 4-12% Bis-Tris mini géis, 10  poços, 1,0 mm	Life Technologies	NP0321
NuPAGE LDS tampão de amostra (4x)	Life Technologies	NP0008
NuPAGE MOPS SDS tampão de corrida (20x)	Life Technologies	NP0001
tiras indicadoras de pH, pH 4,0-7,0	Merck Millipore	109542
QC Colloidal Coomassie Stain	BIO RAD	1610803
Sodium cloreto	Merck Millipore	106406
Hidróxido de sódio	Merck Millipore	106498
Unidade de filtro Steritop	Merck Millipore	SCGPT05RE
SW41 Ti, conjunto de rotores de ultracentrífuga	Beckman Coulter	331336
Thinwall, Tubos de centrífuga ultra-claros, 13.2  ml, 14 mm x 89 mm	Beckman Coulter	344059
Cloridrato de Tris	AppliChem	A1087
X31 Vírus Influenza A (H3N2), cultivado em ovo, fluido alantóide clarificado	Virapur		Recém-descongelado em 4 ° O