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Artigo de método

Estudar Wnt Signaling Durante Padronização de conduzir Airways

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DOI:

10.3791/53910

⸱

16 de outubro de 2016

 ,  , 
1Neonatology and Pulmonary Biology-Perinatal Institute, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, 2University of Cincinnati, College of Medicine

Neste artigo

Resumo

A utilização de ratinhos repórter acoplado ao conjunto de montagem e a secção de coloração, microscopia e ensaios in vivo facilita a análise dos mecanismos subjacentes à padronização normal do tracto respiratório. Aqui descrevemos a forma como estas técnicas contribuiu para a análise de sinalização Wnt durante o desenvolvimento traqueal.

Resumo

Wnt As vias de sinalização desempenham papéis críticos durante o desenvolvimento do trato respiratório. A definição de mecanismos precisos de diferenciação e morfogênese controlados pela sinalização Wnt é necessária para entender como os tecidos são padronizados durante o desenvolvimento normal. Esse conhecimento também é fundamental para determinar a etiologia de defeitos congênitos, como hipoplasia pulmonar e traqueobroncomalácia. A análise dos estágios iniciais de desenvolvimento do trato respiratório impõe desafios, pois a quantidade limitada de tecido impede a realização de protocolos padrão mais adequados para estudos pós-natais. Neste artigo, discutimos metodologias para estudar a diferenciação e proliferação celular no trato respiratório. Descrevemos técnicas como coloração de montagem inteira, processamento do tecido para microscopia confocal e imunofluorescência em cortes de parafina aplicados ao desenvolvimento do pulmão traqueal. Também discutimos metodologias para o estudo da diferenciação do mesênquima traqueal, em particular a formação da cartilagem. As abordagens e técnicas discutidas no presente artigo contornam a limitação do material ao trabalhar com tecido embrionário, permitindo uma melhor compreensão do processo de padronização do desenvolvimento de vias aéreas condutoras.

Introdução

Desenvolvimento das vias respiratórias é iniciada por dia embrionário 9 (E9) com a aparência de células positivas Nkx2.1 no intestino anterior ventral endodérmica 1,2. Separação tubo esofágico-traqueal irá resolver por E11.5 quando os tubos podem ser distinguidos como entidades distintas, cada um rodeado por tecido mesenquimal 3. Sinalização Wnt desempenha um papel chave na especificação do tracto respiratório como supressão de WNT2 e Wnt2b, expressa pelo mesênquima esplânenico e eliminação de β-catenina do epitélio respiratório endodérmica irá resultar em agenesia pulmonar 4,5. Os nossos estudos anteriores determinaram que a eliminação do WLS, um receptor de mediar a secreção de carga de todos os ligandos de Wnt, a partir dos resultados do tracto respiratório em endoderme hipoplasia pulmonar, defeitos no desenvolvimento vascular pulmonar e mis-padronização do mesênquima traqueal 6,7. Estes dados sustentam a importância da cro epitelial-mesenquimalSS falar na diferenciação celular e especificações, como também foi demonstrado em outros estudos 8,9.

O estudo dos estágios iniciais do desenvolvimento do pulmão depende genética, in vitro e técnicas ex vivo que nos permitiram compreender melhor os mecanismos de condução identidade respiratória 10-16. Culturas de explantes de pulmão inteiro na interfase líquido de ar têm sido amplamente utilizados para estudar os efeitos de fatores de crescimento nos estágios iniciais de pulmonar ramificação morfogênese 10,17,18. Enquanto este método é utilizado como leitura de alterações morfológicas, tais como ramificação morfogénese, e modulação da expressão do gene, que se limita ao estudo de fases iniciais do processo de desenvolvimento, como a cultura em si não suporta o desenvolvimento da vasculatura 17. Desenvolvimento da cartilagem traqueal requer tempos de incubação mais longos que podem ser não é compatível com esta técnica de cultura.

para analyze o papel da sinalização de Wnt durante a formação do trato respiratório, que se adaptaram técnicas padrão para atender as necessidades de nossos estudos embrionárias. Nós modificamos volumes, tempos de coloração, ciclismo de processamento para inclusão em parafina e tempo para o esclarecimento de tecido traqueal-pulmão. O principal objetivo de otimizar as técnicas descritas no presente estudo foi analisar os primeiros estágios de desenvolvimento traqueal em ratos que ocorrem a partir de E11 a E14.5. Usando os ratos repórter linha Axin2LacZ nós sites de determinada com precisão de atividade / β-catenina Wnt no mesênquima traqueal em desenvolvimento. Nós também se adaptaram procedimento de coloração lectina para o tecido traqueal montagem todo. Assim, fomos capazes de visualizar condensações mesenquimais e prever locais onde chondrogenesis terão lugar. Coloração de toda montagem e seções de tecido embrionário obtidas a partir de ratos WlsShhCre, juntamente com técnicas avançadas de microscopia, permitiu-nos a desvendar o papel de ligantes Wnt produzidos pelo traepitélio traqueal no padrão traqueal.

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Protocolo

Os animais foram alojados em condições sem agentes patogénicos. Os ratos foram tratados de acordo com os protocolos aprovados pela CCHMC Institutional Animal Care e Use Committee (Cincinnati, OH EUA). Os ratinhos utilizados ao longo destes estudos foram mantidas num fundo misto.

1. Montagem Total X-galactosidase Coloração

  1. Eutanásia fêmea grávida em E11.5 a E14.5, por inalação de CO 2. Coloque animais em CO 2 câmara, carregar a câmara com CO 2. Manter animais em câmara para mínimo de 5 min. Executar método secundário da eutanásia por deslocamento cervical.
  2. Limpo área abdominal com etanol (EtOH) a 70% e realizar uma laparotomia com uma única incisão na linha média abdominal. Utilize uma tesoura cirúrgica e padrão standard (serrilhadas reta) fórceps.
  3. Isolar cornos uterinos usando uma pinça e tesouras finas e imediatamente colocar o tecido na placa de Petri contendo refrigerados solução PBS. Manter o tecido em gelo até processopara isolamento de embriões.
  4. Isolar embriões de cornos uterinos. Dissecar tecido traqueal do pulmão embrionário usando microscópio de dissecação. Utilize uma pinça de ponta fina e uma tesoura para segurar e perfurar o tecido uterino e concepti liberando os embriões.
    1. Remover restantes membranas embrionárias. Com a ajuda de lâminas de agulha cortar a cabeça de embriões e menor parte do corpo abaixo do diafragma. Localize fígado como um marco.
    2. Após o isolamento da região torácica do embrião, prosseguir para remover os lados laterais da parede do corpo, coluna vertebral e coração utilizando lâminas de agulha. Tome cuidado ao remover o coração para evitar ferir o tecido traqueal. Finalmente, cuidadosamente, separar o esôfago da traqueia, puxando o esôfago com a ajuda de lâminas de agulha. Manter o tecido em solução de PBS em gelo.
  5. tecidos lugar em 4 ml parafuso frascos CAP usando vidro ou de transferência de pipetas. Fix tecido pulmonar traqueal em 4% de paraformaldeído (PFA) em PBS durante 30 min. Após a fixação,lavar o tecido com PBS. Ao lavar, preparar uma solução de X-gal coloração (adicionar 5 mM de K 3 Fe (CN) 6, (100 ul de 0,5 H da) 5 mM, K 4 Fe (CN) 6 (100 ul de estoque) mM de MgCl 0,5 m 2 2, ( 20 ul 1 M Stock) 0,01% NaDOC (50 ul de 2% estoque), 0,02% de NP 4 O (100 mL 2% estoque), 1 mg / ml de X-gal (500 ul de 20 mg / ml) e 9,13 ml de água destilada para levar a um volume final de 10 ml).
  6. Remover qualquer PBS restante e adicione 2 ml de solução de coloração X-gal para o frasco de vidro. Coloque os frascos no tabuleiro no shaker. tecidos mancha de 1 a 2 horas em solução de coloração com X-gal. Incubar o tecido em solução X-gal, durante 4 h para posterior processamento e incorporação.
  7. Suspender a reacção por tecidos de lavagem em 3% dimetilsulfóxido-PBS. Enxágüe em PBS, 3 vezes durante 5 minutos cada lavagem e armazenar em 70% de etanol.
  8. Encha placas de Petri com uma solução / PBS 1% de agarose. Permitir agarose para solidificar. Usando pipetas de transferência de vidro, coloque o tecido em co agaroseated placas cheias com solução de PBS. Fotografar as peças inteiras utilizando um microscópio de dissecação. Selecione o filtro apropriado para campo claro.
  9. Para melhor distinguir locais de amostras do processo de coloração X-gal para inclusão em parafina e corte. Colocar as amostras em cassetes de tela fina.
    1. Para processar amostras para inclusão em parafina usar um processador automatizado e criar um ciclo curto da seguinte forma: seis mudanças de álcool: 5 min primeira mudança e 3 min por cada mudança restante. Três mudanças de xileno: 5 min primeira mudança e 3 min próximas duas alterações. Os passos anteriores são realizadas a 30 ° C. Finalmente, execute três mudanças de parafina a 62 ° C: 25 min, 8 min e 5 min.
  10. amostras de orientar para a incorporação com o tecido deitado no fundo da incorporação de barco. Adiciona-se cuidadosamente parafina para encher o barco incorporação. Refrescar imediatamente na placa fria de incorporar estação até que solidifica parafina. Remova o bloco de incorporação barco. Utilizando um micrótomo, gerar 6 uM sexões. seções montar em-slides pré-tratados e slides secas na corrediça conjunto mais quente a 42 ° C por 1 hora.
  11. Asse desliza durante a noite em estufa a 56 ºC. Colocar as lâminas em racks. Desparafinar desliza com três mudanças de 100% de xileno, 10 min cada. Use coloração pratos cheios com 200 ml de xileno.
  12. Rehidratar lâminas através de série graduada de EtOH (100%, 70%, 50% e 30%, 1 min por passo) para PBS antes contracoloração com Fast Red nuclear por 10 a 30 seg. Lavar as lâminas com água da torneira de três vezes durante 5 min de cada vez para remover o excesso de Nuclear Fast Red.
  13. Desidratar slides em uma série EtOH graduada (50%, 70% e 100% EtOH) antes de lavagem em três mudas de xileno (20 mergulhos cada mudança) e tampa deslizando com meios de montagem com base xileno.

2. A lectina Coloração

  1. Dissecar tecido pulmonar E13.5 e E14.5 traqueal como descrito nas etapas 1.1 a 1.4. Usando pipetas de transferência de vidro tecido lugar em frascos com tampa de rosca. Fix tecido pulmonar traqueal com 2 ml desolução PFA 2% durante a noite a 4 ° C. Após a fixação, lavar amostras em PBS três vezes, durante 10 min cada lavagem.
  2. Preparar tampão, geralmente num volume final de 10 ml de solução de bloqueio. Adicionar 0,1 g de BSA (1%) a 8 ml de PBS. Permitir BSA para dissolver. Adicionar 0,2 ml de soro de cabra (2%) de 0,03 ml de Triton X-100 (0,3%). Levar o volume final para 10 ml com PBS. amostras de blocos de 1 h em 0,5 ml de tampão de bloqueio à temperatura ambiente.
  3. Remover o tampão de bloqueio usando uma pipeta de transferência e substituir com lectina solução composta por 50 mg / mL de lectina, soro de cabra a 10% e PBS. Utilizar 250 ul de solução de lectina por amostra. Incubar durante a noite a 4 ° C. Certifique-se de cobrir o frasco de vidro contendo tecido com folha de alumínio. Após a incubação com uma solução de lectina, lavar amostras em PBS três vezes durante 10 min.
  4. explantes lugar em agarose revestidas placas de petri contendo o suficiente PBS para cobrir amostras. Fotografar as peças inteiras utilizando um microscópio de dissecação de fluorescência. Selecione o appropriate filtro para detectar a fluorescência. Lectina de PNA é normalmente acoplada a GFP.

3. Monte Whole Imunofluorescência Coloração e microscopia confocal

  1. Isolar tecido pulmonar traqueal, a transferência para 4 ml frascos de vidro com tampa de rosca e corrigir durante a noite em 4% PFA. tecido E11.5 pode ser fixado em 2% PFA. Loja em metanol 100%. As amostras podem ser armazenadas até vários meses à temperatura de -20 ° C.
  2. Remover o metanol que usa a pipeta de transferência e permeabilizar amostras usando Bleach de Dent (4 partes de metanol, 1 parte de DMSO e 1 parte 30% H 2 O 2) durante 2 horas. Hidrato de tecido numa série graduada de metanol diluído em PBS como se segue: 100% de metanol, 75% de metanol, 50% de metanol, 25% de metanol, 100% de PBS. Incubar 10 min a temperatura ambiente, durante cada passo de hidratação.
  3. Bloco de tecido em reagente de bloqueio a 0,5% diluído em PBS (ver Materiais para detalhes) durante duas horas à temperatura ambiente com agitação.
  4. Diluir anticorpo primário em bloquearsolução (Sox9 1: 100, Nkx2.1 1: 200, αSMA 1: 250) e incubar as amostras durante a noite a 4 ° C. Lavar as amostras com PBS cinco vezes à temperatura ambiente. Execute cada lavagem durante 1 h.
  5. Aplicar anticorpo secundário com uma diluição de 1: 500 em solução de bloqueio a 0,5%. Selecionar cuidadosamente anticorpos secundários para evitar a ligação entre os anticorpos secundários. Incubar durante a noite a 4 ° C em ambiente escuro. Lavar as amostras três vezes durante 20 min à temperatura ambiente. Desidratar amostras numa série graduada de metanol diluído em PBS como se segue: 25% de metanol, 50% de metanol de 75% de metanol, 100% de metanol, 10 min cada passo.
    NOTA: Certifique-se de que as amostras permanecem cobertas com papel alumínio e minimizar a exposição à luz. Os tecidos podem agora ser armazenados a 4 ° C, durante várias semanas até fotografado.
  6. Amostras de transferência para custom made placas de palco, remover o metanol e clara com aproximadamente 200 ml de solução clara de Murray 19,20 (2 partes de benzoato de benzilo, 1 parte Álcool benzílico) imediatamente befimaging minério. Fotografar usando um microscópio confocal. Processar e analisar imagem usando software de imagem.

Proliferação 4. celular

  1. Injectar ratinhos E11.5 grávida intra-peritoneal com uma solução de BrdU para uma concentração de 100 ug de BrdU / g de peso corporal. Sacrifício do sexo feminino como descrito na seção 1 do protocolo e isolar embriões em E12.5 ou E13.5. Usando lâminas de faca, cabeças especiais de consumo e menor parte do corpo abaixo cavidade torácica.
  2. Coloque o tecido torácica em 4 ml parafuso frascos cap e fixar em 1 ml de PFA 4% durante a noite. Lavar as amostras duas vezes com PBS durante 5 min e desidratar as amostras através de uma série de etanol diluído em água destilada até 70% de etanol do seguinte modo: 30%, 50% e 70% de etanol, durante 5 minutos cada passo.
    1. Colocar as amostras em cassetes tela de tamanho médio. Processo de tecido para inclusão em parafina utilizando e processador automatizado. Configurar um ciclo da seguinte forma: seis mudanças de álcool para 8 min cada, três mudanças de xileno para 6 min cada, três cHanges de parafina, por 25 min, 9 min e 8 min.
  3. Incorporar em parafina orientar o tecido na posição desejada para gerar 6 uM transversal ou cortes longitudinais, como descrito na secção 1. Colocar secções em lâminas e permitir que o tecido de aderir a deslizar na corrediça conjunto mais quente a 42 ° C durante 1 h.
  4. Asse lâminas, sobre os seus lados, durante a noite em estufa a 56 ° C. Colocar as lâminas em cabides de plástico. lâminas de-paraffinize por imersão em três mudas de 100% xileno, 10 min por mudança. Use 200 ml de xileno para submergir completamente os slides. Rehidratar lâminas através de série graduada de EtOH (100%, 70%, 50% e 30%, 5 minutos por passo com agitação) para PBS (5 min).
  5. Executar a recuperação de antigénio utilizando-se 10 mM de tampão de citrato, pH 6. Para preparar 100 ml de tampão de citrato de mistura 18 ml de ácido cítrico 0,1 M mono-hidratado e 82 ml de citrato de sódio 0,1 M.
    1. Colocar as amostras em frascos coplin de plástico cheios de solução de recuperação antigênica e microondas para 6,5 ​​min a alta potência. Adicionar discultivada água para jar coplin para compensar-citrato evaporou-tampão e reaquecimento com potência de 40% para 6 min.
    2. Preencha frasco coplin ao topo com água e aquecer novamente no poder de 40% para 6 min. tempos de microondas pode variar de acordo com microondas utilizado.
    3. Permitir que as lâminas se arrefecer durante 20 min à temperatura ambiente antes de as lâminas de lavagem em água destilada durante 1 min, seguido de PBS durante 5 min. Após a lavagem com PBS, as lâminas do bloco, durante 2 horas numa solução contendo TBS (2,425 g de base Tris e 8,765 g de NaCl diluído em 1 L de água destilada) a 10% de soro de burro e 1% de BSA de bloqueio.
  6. Adicionar anticorpos primários diluídos em solução de bloqueio (TBS contendo 10% de soro de burro e 1% de BSA). BrdU (marcador mitose), Nkx2.1 (epitélio das vias respiratórias), Sox9 (células que dão origem a cartilagem) e αSMA (células do músculo liso). Incubar as lâminas durante a noite, a 4 ° C. Use o método de sobreposição para conservar anticorpos. Aplicar 180 mL de anticorpo a uma junta e, em seguida, anexar slide como se a tampa deslizanteping.
  7. Retire a junta por imersão slides em água destilada. Após a remoção do anel de vedação, lavar o anticorpo primário não ligado através da realização de seis lavagens de 5 min com TBS contendo 0,1% de Tween-20.
    1. Incubar as lâminas com anticorpo secundário diluído em solução de bloqueio a uma diluição de 1: 200, durante 1 h à temperatura ambiente. Selecione anticorpos secundários com cuidado para evitar indesejada de ligação entre eles. Remover anticorpo secundário não ligado através da realização de três de cinco lavagens minutos, com TBS contendo 0,1% de Tween.
    2. Lavar as lâminas em base de 0,1 M Tris duas vezes durante 5 minutos e, em seguida, 0,05 base de Tris duas vezes por 5 min. As lâminas podem ser deixados na base de 0,05 M Tris, enquanto coversliping usando meios de montagem com ou sem DAPI (1,5 ug / ml). lâminas Armazenar na pasta de slides a 4 ° C e proteger da luz, cobrindo pasta com folha de alumínio.
  8. Visualize coloração e fotografia utilizando um microscópio de fluorescência automatizado. Contagem de células marcadas e células totais por campo fotografadas em20X e 40X para determinar índices de proliferação de células de células totais.

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Resultados

atividade / β-catenina Wnt

Whole montagem Lac-Z coloração foi detectado no tecido traqueal-pulmão de embriões isolados de repórter Axin2 Lac-Z ratos 11. Sites de coloração indicar atividade / β-catenina Wnt. Análise de secções de toda a coloração de montagem determinado que a actividade / β-catenina Wnt estava presente no mesênquima da traqueia e no mesênquima de regiões periféricas do...

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Discussão

Eventos subjacentes a morfogénese do tracto respiratório não são completamente compreendidos, em particular os processos necessários para a modelação das vias aéreas condutoras. Estudos anteriores têm utilizado técnicas ex vivo, em que explantes em desenvolvimento são cultivadas na interfase ar-líquido ou embebido em matrigel 21,22. Estes estudos têm mostrado como factores de crescimento influenciam o padrão da traqueia desenvolvimento e a formação de cartilagem traqueal. Uma limitação para estes est...

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Divulgações

"Os autores não têm nada para revelar."

Agradecimentos

Nós reconhecemos a assistência de Mike Muntifering e Matt Kofron com imagem confocal e Gail Macke com os procedimentos histológicos. Este trabalho foi parcialmente financiado pelo National Institutes of Health-NHLBI (K01HL115447 para DS).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Anti Sox9 ab.MilliporeAB55351:400 , coelho
Anti Sox9 ab.Santa CruzSc-200951:50, coelho
Anti Músculo Liso Actina ab.SigmaA52281:2k, mouse
Anti NKX2.1 ab.Seven Hillsn/a1:100, porquinho-da-índia
Anti NKX2.1 ab.Seven Hillsn / a1:400, mouse
Anti Brdu ab.AbcamAB18931:200, ovelhas
Anti Brdu ab.Santa CruzSc-323231:4k, camundongo
PNALectina SigmaL 7381
Anticorpos secundáriosTecnologiasAlexa fluor Sondas moleculares
K3Fe(CN)6SigmaP8131
K4Fe(CN)6Sigma-AldrichP3289
MgCl2Sigma-AldrichM9272
NaDOCLife Technologies89905
NP4OLife Technologies85124
Alcian Blue 8GXSigmaA-3157
Marca Fisher super-frost plusFisher12-550-15
PFA (16%)EMS15710
PBSGibco70011-044
Soro de Bezerro FetalSigma11K413
Reagente de bloqueioInvitrogenComponente do kit TSA #2      (T20932)
BrDuSigmaB5002-5g
Vectashield meio de montagemVector labsH-1000
PermountFisherSP15-500
Tissue-loc HistoscreenFisherC-0250-GR
de biópsiaPremiereBC0109Disponível em diferentes cores
Vermelho nuclear rápido  Kernechtrot 0,1%SigmaN3020
Ácido cítricoSigmaC1909-500G
Citrato de sódio tribásico di-hidratadoSigmaS4641-1Kg
Cloridrato de TrizmaSigmaT5941-500G
XilenoPharmco-AAPER399000000
EtanolPharmco-AAPER111000200
Micro facasFST10318-14
Dumont #5 revestidas de cerâmicaFST11252-50
Dumont #5COFST11295-20
Dumont # 5FST91150-20
Thermo/Shandon Excelsior ESThermo Fisher
MicrótomoLeicaRM2135
Nikon i90Microscópio decampo amplo
NikonA1RsiNikon. Configurações: câmera NikonA1 plus, scanner: Galvano, detector: DU4. Óptica Plan Apo lambda 10X. Modalidade: Laser de fluorescência de campo amplo confocal. 
Leica MS 16 FALeicaMicroscópio de dissecação de fluorescência
ZeissZeissMicroscópio de fluorescência automatizado
Leica Suíte de aplicativos LeicaSoftware de imagemLeica
Software de imagemNISNikon
IMARISBitplaneSoftware de processamento de imagem
de vida Nikon Microscopia confocal Nikon Nikon Softwarede processamento de imagem

Referências

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Reimpressões e permissões

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