Um método para alvejar e Isolar Airway-inervação neurônios sensoriais em Ratos

Resumo

Neurônios sensoriais específicos de órgãos são difíceis de identificar. O rastreamento Fast Blue é usado para identificar neurônios nodose que inervam as vias aéreas para classificação celular. Os neurônios nodose classificados são usados para extrair ácido ribonucleico (RNA) de alta qualidade para sequenciamento. Usando este protocolo, a expressão gênica de neurônios específicos das vias aéreas é determinada.

Resumo

nervos Somatosensoriais transduzir estímulos nocivos causados ​​por ambos os agentes endógenos e ambientais térmica, mecânica, química, e. Os corpos celulares destes neurónios aferentes estão localizados dentro do gânglio sensorial. gânglios sensoriais que inervam um órgão específico ou porção do corpo. Por exemplo, o gânglio da raiz dorsal (DRG) são localizados na coluna vertebral e extensão dos processos ao longo do corpo e membros. O gânglio trigeminal estão localizados no crânio e inervam a face, e das vias aéreas superiores. aferentes vagais dos gânglios nodosos se estender por todo o intestino, coração e pulmões. Os neurónios nodosos controlar um conjunto diversificado de funções, tais como: freqüência respiratória, irritação das vias aéreas, e reflexo de tosse. Assim, entender e manipular a sua função, é crítica para identificar e isolar sub-populações neuronais específicas das vias aéreas. No rato, as vias aéreas estão expostas a um corante marcador fluorescente, azul rápido, para rastreamento retrógrado de neurônio nodose específica das vias aéreass. Os gânglios nodosos são dissociados e de células activadas por fluorescência (FAC) de classificação é usado para coletar células positivas de corante. Em seguida, o ácido ribonucleico, de alta qualidade (ARN) é extraído a partir de células positivas de corante para a próxima geração de sequenciação. Usando este método de expressão do gene de vias aéreas neuronal específica é determinada.

Introdução

nervos Somatosensoriais transduzir estímulos nocivos causados ​​por ambos os agentes endógenos e ambientais térmica, mecânica, química, e. Os corpos celulares destes nervos aferentes estão localizados em gânglios sensoriais, tais como a raiz dorsal, trigeminal, ou gânglios nodosos. Cada gânglio sensorial inerva regiões específicas do corpo e contém células que inervam órgãos e tecidos separadas dentro dessa região. Por exemplo, os gânglios da raiz dorsal (DRG) são localizados na coluna vertebral e extensão dos processos ao longo do corpo e membros, enquanto que o gânglio trigeminal estão localizados no crânio, contendo neurónios que inervam a face, olhos, meninges ou....

Protocolo

Procedimentos envolvendo indivíduos animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Universidade de Duke.

1. Administração Intranasal de Fast Blue

Para Fast Blue, administrar o corante, pelo menos, 2 dias antes da eutanásia o mouse. O corante vai persistir por até oito semanas.

1. Anestesiar o rato com anestesia inalatória leve (2,5% sevoflurano) até que começa a respiração lenta.
2. Usar uma pipeta de 200 uL com pontas filtrados para instilar-se lentamente 40 ml de solução de corante (0,4 mM Fast Blue, 1% de sulfóxido de dimetilo, solução salina de DMSO, em tampão fosfato, PBS) na narina, parando per....

Resultados

Usando este método, os neurónios da via aérea-inervação são rotulados por via intranasal incutir Fast Blue (Figura 1A). Após dois dias, as células marcadas azul depressa aparecem nos gânglios nodosos (Figura 1C). Essas células formam 3-5% da população neuronal total do gânglios nodosos. Outros corantes retrógrada, que têm sido utilizados para este fim incluem DiI (1,1'-dioctadecil-3,3,3 ', 3'-perclorato tetramethylindocarbocyanine) e Fluorogo.......

Discussão

Este protocolo descreve um método para alvejar neurónios das vias aéreas-inervação nos gânglios nodosos do nervo vago. Uma vez marcado, os gânglios são suavemente dissociados para otimizar a preservar o número de células e viabilidade. Estes neurónios são, então, classificados FAC directamente em tampão de lise e o ARN é extraído. A importância deste protocolo é a capacidade de segmentar, isolar e preservar a qualidade de uma população de células sensorial específica. A expressão de genes é descrito nesta pequena popula.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Policiências Azul Rápida	, Inc.	17740-2	estoque 2 mg/ml em água
NeuroTrace 530/615 mancha vermelha de Nissle	Life Technologies	N21482
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Fisher Scientific	D128-500
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Ca e Mg livre	Gibco	14190-144
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634-010
glutamina ( Glutamax)	Gibco	35050-061
HEPES	Gibco	15630-080
N2	Gibco	17502-048
B27 (sem vitamina A)	Gibco	12587-010
Fator de Crescimento Nervoso (NGF)	Sigma	N6009	estoque 50 µ g/ml em enzima de digestão PBS/10% FBS
, Liberase DH Grau de Pesquisa	Roche	5401054001	estoque 2,5 mg/ml em
solução de partícula de água (Percoll)	Sigma	P1644-25ML
Bloco de aquecimento	LabNet
70 µ filtro de células m	Falcon	352350
Absolute Ethanol (200 proof)	Fisher Scientific	BP2818-500
RNase free water	Fisher Scientific	BP2484-100
RNase, RNase AWAY	invitrogen	10328-011
2-mercaptoetanol	VWR	EM-6010
Kit de extração de RNA, RNeasy Plus Micro Kit	Qiagen	74034
Kit DNase, Conjunto DNase Livre de RNase	Qiagen	79254
DNase	Sigma	D5025-15KU	estoque 10 mg/ml em 0.15 M NaCl
Propidium Iodide Iodide	Sigma	P4170-10MG	estoque 10 µ g/ml no
sistema de eletroforese microfluídica PBS (TapeStation 2200)	Agilent

Reagente de descontaminação