Um método para alvejar e Isolar Airway-inervação neurônios sensoriais em Ratos

Resumo

Neurônios sensoriais específicos de órgãos são difíceis de identificar. O rastreamento Fast Blue é usado para identificar neurônios nodose que inervam as vias aéreas para classificação celular. Os neurônios nodose classificados são usados para extrair ácido ribonucleico (RNA) de alta qualidade para sequenciamento. Usando este protocolo, a expressão gênica de neurônios específicos das vias aéreas é determinada.

Resumo

nervos Somatosensoriais transduzir estímulos nocivos causados ​​por ambos os agentes endógenos e ambientais térmica, mecânica, química, e. Os corpos celulares destes neurónios aferentes estão localizados dentro do gânglio sensorial. gânglios sensoriais que inervam um órgão específico ou porção do corpo. Por exemplo, o gânglio da raiz dorsal (DRG) são localizados na coluna vertebral e extensão dos processos ao longo do corpo e membros. O gânglio trigeminal estão localizados no crânio e inervam a face, e das vias aéreas superiores. aferentes vagais dos gânglios nodosos se estender por todo o intestino, coração e pulmões. Os neurónios nodosos controlar um conjunto diversificado de funções, tais como: freqüência respiratória, irritação das vias aéreas, e reflexo de tosse. Assim, entender e manipular a sua função, é crítica para identificar e isolar sub-populações neuronais específicas das vias aéreas. No rato, as vias aéreas estão expostas a um corante marcador fluorescente, azul rápido, para rastreamento retrógrado de neurônio nodose específica das vias aéreass. Os gânglios nodosos são dissociados e de células activadas por fluorescência (FAC) de classificação é usado para coletar células positivas de corante. Em seguida, o ácido ribonucleico, de alta qualidade (ARN) é extraído a partir de células positivas de corante para a próxima geração de sequenciação. Usando este método de expressão do gene de vias aéreas neuronal específica é determinada.

Introdução

nervos Somatosensoriais transduzir estímulos nocivos causados ​​por ambos os agentes endógenos e ambientais térmica, mecânica, química, e. Os corpos celulares destes nervos aferentes estão localizados em gânglios sensoriais, tais como a raiz dorsal, trigeminal, ou gânglios nodosos. Cada gânglio sensorial inerva regiões específicas do corpo e contém células que inervam órgãos e tecidos separadas dentro dessa região. Por exemplo, os gânglios da raiz dorsal (DRG) são localizados na coluna vertebral e extensão dos processos ao longo do corpo e membros, enquanto que o gânglio trigeminal estão localizados no crânio, contendo neurónios que inervam a face, olhos, meninges ou das vias aéreas superiores ^{1, 2.} A gânglios nodosos do nervo vago está localizado no gargalo abaixo do crânio e contém corpos celulares que se estendem fibras nervosas ao longo do tracto gastrointestinal, no coração e pulmões e vias aéreas inferiores ^3. Nos seres humanos o gânglio nodoso está sozinho, no entanto, no ratinho é fundidacom o gânglio jugular, que também inerva os pulmões ^4. Este gânglio fundido é muitas vezes chamado a jugular / nodose complexa, gânglio vagal, ou simplesmente nodose gânglio ^5. Aqui, é referido como o gânglio nodoso.

fibras aferentes do nodosos passar informações de vísceras para o núcleo do tracto solitário (NTS) no tronco cerebral. Entrada sensorial para esta gânglio único controla um conjunto diversificado de funções, tais como a motilidade intestinal ^{6, 7} da frequência cardíaca, a respiração ^8,9, e as respostas respiratórias activado-irritantes ^10,11. Com esta diversidade de funções e órgãos inervados, é crítico para alvejar e isolar subpopulações específicas de órgãos do gânglio nodoso, a fim de estudar vias neuronais individuais. No entanto, dado o pequeno tamanho do nodosos e ao limitado número de neurónios que contém esta não é uma tarefa trivial. Cada rato nodose gânglio contém cerca de 5.000 neurônios ¹²em adição a uma grande população de células de suporte satélite. Dos 5.000 neurónios nodosos, apenas 3 - 5% inervam as vias aéreas. Portanto, quaisquer alterações funcionais, morfológicos ou moleculares dentro dos neurônios das vias aéreas-inervação, devido a estimulação respiratória ou patologias, serão perdidos no gânglio nodoso densamente.

Para resolver este problema, foi desenvolvido um método para identificar e isolar neurónios que inervam as vias aéreas. As vias aéreas foram expostos a um corante marcador fluorescente para identificar os neurónios nodosos inervação subsequentes. Azul rápida foi apanhada por neurônios e viaja rapidamente para seus corpos celulares, onde é retido por até oito semanas ^{13 - 15.} Uma vez identificados, um protocolo de dissociação suave, mas eficiente foi usado para preservar rotulagem corante e viabilidade celular para celular ativado fluorescente (FAC) de classificação. As células seleccionadas são usadas para extrair o ácido ribonucleico de alta qualidade (ARN) para determinar a expressão do gene ou fou outra análise molecular a jusante. Este protocolo proporciona uma técnica útil e robusto para isolar neurónios sensoriais que inervam um tecido de interesse.

Protocolo

Procedimentos envolvendo indivíduos animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Universidade de Duke.

1. Administração Intranasal de Fast Blue

Para Fast Blue, administrar o corante, pelo menos, 2 dias antes da eutanásia o mouse. O corante vai persistir por até oito semanas.

1. Anestesiar o rato com anestesia inalatória leve (2,5% sevoflurano) até que começa a respiração lenta.
2. Usar uma pipeta de 200 uL com pontas filtrados para instilar-se lentamente 40 ml de solução de corante (0,4 mM Fast Blue, 1% de sulfóxido de dimetilo, solução salina de DMSO, em tampão fosfato, PBS) na narina, parando periodicamente para assegurar o rato é aspiração da solução (Figura 1A).
3. Segure o mouse vertical, cabeça para cima e massageie suavemente no peito para garantir o corante se espalha por todo o pulmão.

2. Preparações sobre Dissecção e Dia Análise

1. Preparar 10 ml0; Ganglia dissociação Solução (GADs) por combinação dos ingredientes tal como especificado no Quadro 1.
2. Realizar a extracção de ARN em uma área de laboratório dedicado. Antes de começar a experiência, limpar as superfícies com 70% de etanol, 10% de água sanitária, e reagente de descontaminação RNase. Isto inclui a centrifugação de ARN, quaisquer suportes de tubos, e as pipetas. Garantir que não dedicados ponta caixas de filtro para uso apenas RNA. Não utilize este equipamento e área para preparação de ADN, como isso vai contaminar as amostras.
3. Mistura fresca de 70% e 80% de etanol com água livre de RNase. Prepare 1 ml para cada amostra a ser usado na extracção de ARN.

Ingrediente	Quantidade
Avançada DMEM / F12	9,5 ml
glutamina	100 ul
HEPES (10 mM)	100 ul
suplemento N2	100 ul
B27 (sem vitamina A)	200 ul
NGF (50 ug / ml)	10 ul

Tabela 1. Mistura Reagente para Ganglia dissociação Solution (gads).

3. Dissecção Procedimento

1. Encher tubos de 1,5 ml com 500 ul GADs, uma para cada amostra experimental, um como contraprova positiva de triagem, e uma para um controlo negativo de triagem. tubos de loja no gelo durante todo dissecção.
2. Dissecar o gânglio nodoso e fazer dois cortes parciais para facilitar a dissociação, em seguida, colocá-lo no tubo de ensaio experimental. Por favor, consulte o seguinte protocolo JoVE para dissecção dos gânglios nodosos ¹⁶ e DRG ^17.
3. Dissecar e parcialmente em corte gânglios não marcado, tais como gânglio da raiz dorsal (DRG), para os controlos de triagem. Use dois gânglios para o controlo positivo e dois Ganglium para o controlo negativo.
4. Para obter neurónios nodosos suficientes para classificar bem sucedida, combinar gânglios a partir de 5 ratos em um tubo de amostra experimental contendo GADs.

4. Sensorial Ganglia dissociação

1. Pipeta 500 GADs ul, deixando gânglios no tubo. Lave gânglios uma vez, adicionando 1 ml PBS, aguarde gânglios para assentar no fundo do tubo, então pipeta PBS.
2. Adicionar 1 ml GADs e 22 ul da enzima de digestão de colagenase (I / II e mistura de protease, 2,5 mg / ml em _H2O) a cada tubo.
3. Adicionar 20 ul azuis Rápido (5,26 mm) para o tubo de controlo positivo.
4. Colocar os tubos num banho de água ou bloco de aquecimento já fixada em 37 ° C.
   Nota: O tempo de digestão gânglios depende da idade da enzima de digestão. No espaço de 1 mês de dissolução do enzima de digestão, digestão durante 30 min, a 2 - 6 meses digerir durante 45 min. Se a enzima é mais de 6 meses de idade, digerir gânglios fou 60 min.
5. A cada 15 minutos tubos de agitar brevemente e agite-los para assegurar gânglios são cobertos pela solução.
6. Enquanto estão a ser digerido gânglios, preparar gradientes de densidade, utilizando uma solução de partículas (partículas de sílica coloidal revestida com polivinilpirrolidona).
   1. Misturar a solução de partículas% 12 em GADs, 500 ul por amostra.
   2. Misturar a solução de partículas% 28 em GADs, 500 ul por amostra.
   3. Lentamente e cuidadosamente adicionar solução densidade de 400 ul de 12% na parte superior da solução densidade de 400 ul de 28% em um tubo de 1,5 ml fresco para cada amostra. Não permita que as duas camadas para misturar. Duas camadas distintas deve ser visível no tubo; uma mais escura que a outra.
7. Enquanto gânglios estão sendo digerida, rotular novos tubos de 1,5 ml de coleta para ordenar (um tubo rápido Azul positivo e um rápido Azul negativo por amostra de classificação). Dependendo dos requisitos da instalação de triagem, estes tubos devem ter tampas amovíveis de modo a não interferirE com o classificador de células.
8. Após o tempo de digestão adequada, remova GADs com enzima de digestão e lavar gânglios duas vezes com 1 ml PBS. Adicionar 200 ul de GADs fresco a cada tubo.
9. Usar uma pipeta de 200 mL, definido como volume de 100 mL, e gânglios pipeta cima e para baixo várias vezes para separar as células. Repita até que nenhum pedaço intacto do tecido é visto. Evitar a criação de bolhas na solução.
10. Passa células dissociadas através de um filtro celular de 70 uM.
11. Adicionar mais 100 GADs ul ao tubo de dissociação original para pegar todas as células perdidas restantes esquerda e passar a solução adicional através do filtro de células. Utilizando uma nova ponta de pipeta, recolher qualquer líquido contendo células remanescente que passou através do filtro e agarrou-se à malha. O volume final de células suspensas em GADs é 300 ul.
12. camada cuidadosamente os 300 ul de células no topo do gradiente de densidade previamente feita. Evitar bolhas e mistura de cells com as camadas de densidade.
13. Centrifugar durante 10 minutos a 2900 xg à temperatura ambiente.
14. Enquanto as células são na centrífuga, mistura de tampão de lise (1 ml por amostra experimental) como se segue: 10 ul de 2-mercaptoetanol em 1 ml de tampão de RLT (estojo de extracção de ARN).
    1. Adicionar 300 mL de tampão de lise de tubo de coleta positiva Azul Rápido e 600 mL ao tubo rápido Azul negativo de coleta (tubos rotulados a partir do passo 4.7). Esse volume depende do número de células que se espera serem recolhidos. Para <2000 células, adicionar 300 ul, durante> 7.000 células adicionar 600 ul. Isto irá assegurar que o fluido de revestimento de classificação não dilui significativamente o tampão de lise.
15. Uma vez que a centrifugação estiver concluída, remova cuidadosamente e elimine a camada ul top 700. Esta camada contém a maioria dos resíduos celulares que de outra forma interfira com a separação de células.
16. Adicionar 700 ul GADs frescos para a célula restante contendo solução e pipetate para cima e para baixo várias vezes para misturar.
17. Centrifugar durante 15 minutos a 2900 xg para sedimentar as células.
18. Enquanto as células são na centrífuga, misturar triagem GADs (500 ul por amostra) pela adição de 5 ul de ADNase (10 mg / ml) até 1 ml GADs.
19. Depois de centrifugação é feito, cuidadosamente remover e descartar o sobrenadante, deixando o sedimento celular.
20. Re-suspender pellet celular em 200 - 300 ml de classificação GADs pipetando cima e para baixo com uma pipeta de 1000 mL ajustado para 200 mL várias vezes. Coloque as amostras em gelo. As células são agora pronto para ser classificado.

5. fluorescência celular ativado (FAC) Classificando

Nota: Esta seção requer conhecimento operacional de um classificador FACS ou a assistência de pessoal qualificado.

1. Adicionar uma solução de estoque ul iodeto de propídio (PI) (50 ug / ml) para cada amostra a testar para a viabilidade celular. Divisão de controle negativo em 2 tubos, um com PI e um sem. PI se liga ao ADN apenas em células mortas. E seapós os primeiros tipos não há células mortas, para rotular, não é necessário o uso de PI.
2. Células de transporte para citometria de fluxo instrumento, por exemplo., BD FACS AriaII executando o software Diva 8, em gelo.
3. Uma vez que o tamanho da célula é variável nesta população, usar um grande bocal (100 uM) para a classificação. Para diminuir a quantidade de tensão da experiência as células e aumentar a viabilidade celular utilizar baixa pressão (20 psi).
4. Use o software classificador FACS para configurar as parcelas de análise, de dispersão para a frente, dispersão lateral (SSC), Blue rápido e PI, se necessário.
5. Para as células re-suspender, gentilmente vortex brevemente a amostra antes de o colocar na classificador.
6. Comece com o controlo negativo, nenhum Fast Blue ou IP, para definir o limite de portão (Figura 2A). Isto vai determinar a quantidade de autofluorescência na população de células. Opcional: Executar a amostra negativa com PI para identificar se existe uma população de células mortas.
7. Classificar a amostra de controlo positivo (incubated com Fast Blue), para definir os parâmetros de compensação.
8. Uma vez que os portões e parâmetros são definidos, começam a triagem das amostras experimentais. As amostras são classificadas dentro dos tubos de coleta de preparados contendo tampão RNA lise.
9. Manter as amostras classificadas em gelo até que a separação de células é completa.
10. Comece a etapa de extração de RNA imediatamente após as células são classificadas.

6. Extracção de ARN

1. Vortex células classificadas em tampão de lise durante 1 min para homogeneizar.
2. Adicionar 1 volume de etanol a 70% e misture pipetando cima e para baixo várias vezes.
3. Transferir para 700 ul da amostra a uma coluna de centrifugação. Centrifugar durante 15 segundos a 8000 x g. Descartar o fluxo de passagem.
   1. Repetir até que o volume total da amostra é passada através da coluna de centrifugação.
4. Adicionar 350 ul de tampão de RW1 e continuar o processo de purificação de ARN, incluindo o passo de tratamento com ADNase, de acordo com Protoco do fabricantel para as células.
5. Uma vez que o RNA foi extraído, testar a qualidade de ARN utilizando um sistema de electroforese de microfluidos de acordo com as especificações do fabricante.

Resultados

Usando este método, os neurónios da via aérea-inervação são rotulados por via intranasal incutir Fast Blue (Figura 1A). Após dois dias, as células marcadas azul depressa aparecem nos gânglios nodosos (Figura 1C). Essas células formam 3-5% da população neuronal total do gânglios nodosos. Outros corantes retrógrada, que têm sido utilizados para este fim incluem DiI (1,1'-dioctadecil-3,3,3 ', 3'-perclorato tetramethylindocarbocyanine) e Fluorogo...

Discussão

Este protocolo descreve um método para alvejar neurónios das vias aéreas-inervação nos gânglios nodosos do nervo vago. Uma vez marcado, os gânglios são suavemente dissociados para otimizar a preservar o número de células e viabilidade. Estes neurónios são, então, classificados FAC directamente em tampão de lise e o ARN é extraído. A importância deste protocolo é a capacidade de segmentar, isolar e preservar a qualidade de uma população de células sensorial específica. A expressão de genes é descrito nesta pequena popula...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Policiências Azul Rápida	, Inc.	17740-2	estoque 2 mg/ml em água
NeuroTrace 530/615 mancha vermelha de Nissle	Life Technologies	N21482
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Fisher Scientific	D128-500
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Ca e Mg livre	Gibco	14190-144
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634-010
glutamina ( Glutamax)	Gibco	35050-061
HEPES	Gibco	15630-080
N2	Gibco	17502-048
B27 (sem vitamina A)	Gibco	12587-010
Fator de Crescimento Nervoso (NGF)	Sigma	N6009	estoque 50 µ g/ml em enzima de digestão PBS/10% FBS
, Liberase DH Grau de Pesquisa	Roche	5401054001	estoque 2,5 mg/ml em
solução de partícula de água (Percoll)	Sigma	P1644-25ML
Bloco de aquecimento	LabNet
70 µ filtro de células m	Falcon	352350
Absolute Ethanol (200 proof)	Fisher Scientific	BP2818-500
RNase free water	Fisher Scientific	BP2484-100
RNase, RNase AWAY	invitrogen	10328-011
2-mercaptoetanol	VWR	EM-6010
Kit de extração de RNA, RNeasy Plus Micro Kit	Qiagen	74034
Kit DNase, Conjunto DNase Livre de RNase	Qiagen	79254
DNase	Sigma	D5025-15KU	estoque 10 mg/ml em 0.15 M NaCl
Propidium Iodide Iodide	Sigma	P4170-10MG	estoque 10 µ g/ml no
sistema de eletroforese microfluídica PBS (TapeStation 2200)	Agilent